孫娜，楊馨悅，楊宇馳，薛桂新

(延邊大學 農學院，吉林 延吉，133000)

東北長白山野生山葡萄(VitisamurensisRupr.)屬東亞葡萄種群，與赤霞珠、蛇龍珠和霞多麗等歐亞葡萄相比，粒小、皮厚、色濃、果香獨特；有機酸、單寧、氨基酸、礦物質和白藜蘆醇的含量較高，獨特的生態(tài)條件決定了該地區(qū)野生山葡萄及葡萄酒的優(yōu)良品質和獨特風格[1]。野生山葡萄酒的研究始于20世紀70年代[2]，2000年時張文英等[3]對山葡萄酒的苦澀味進行了分析并提出控制措施。2004年李記明等[4]報道了中國野生山葡萄的揮發(fā)性成分主要是醇、酯、醛、酮等。2018年李悅等[5]研究了北冰紅山葡萄酒的香氣類型，認為酒精味的含量較高。目前對野生山葡萄酒風味成分的研究報道較少，對揮發(fā)性成分的風味特征尚不明確。

揮發(fā)性成分主要有醇類、酯類、醛類、酮類、酸類、烴類等[6]，這些物質種類及其含量對葡萄酒的風味特征和質量起到重要影響[7-8]。葡萄酒的揮發(fā)性成分不僅受工藝條件、產地環(huán)境、葡萄品種的影響，還與葡萄酒的年份有關[9-10]。前人分別采用電子鼻結合固相萃取(solid phase extraction, SPE)氣相色譜-質譜(gas chromatography mass spectrometry,GC-MS) 聯(lián)用技術和電子鼻結合固相微萃取(solid phase micro extraction, SPME)GC-MS聯(lián)用技術測定了葡萄酒的揮發(fā)性成分并建立數據的相關性，突出了電子鼻結合GC-MS方法的優(yōu)勢[11-12]。

本文利用電子鼻和頂空固相微萃取(hea space solid phase micro extraction, HS-SPME)結合技術對2016年、2017年和2018年長白山野生山葡萄酒的揮發(fā)性成分進行檢測，一方面進一步認識了野生山葡萄酒的種類及含量，并深入了解了不同年份野生山葡萄酒揮發(fā)性成分的差異；另一方面對長白山野生山葡萄酒風味和典型性的研究具有一定的借鑒意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酒樣：3個垂直年份(2016、2017和2018年)的酒樣由吉林省長白娃健康科技有限公司提供，野生山葡萄原料均采自長白山區(qū)二道白河鎮(zhèn)野生山葡萄產區(qū)。同一山地，葡萄的栽培技術、管理模式、采收期、釀造工藝等均保持一致。

2-辛醇(色譜純GC≥99.5%)，上海源葉生物科技有限公司；C7～C23正構烷烴(色譜純)，北京化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

PEN3型電子鼻儀器，德國AIRSENSE公司；7890B-5977B氣相色譜與質譜聯(lián)用儀；CTC三位一體自動進樣器，美國Agilent；50/30 μm DVB/CAR on PDMS型萃取頭，美國Agilent；TDZ5-WS型高速離心機，中國湖南湘儀實驗儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 野生山葡萄酒加工流程

山葡萄→挑選脫?！扑椤砑庸z酶→調糖→添加活化酵母→發(fā)酵→過濾→后發(fā)酵→陳釀→山葡萄原酒。

1.3.2 操作要點

挑選脫粒：挑選無腐爛變質、無變軟、無病蟲害的葡萄粒。

破碎：用對輥破碎機擠壓葡萄使皮破裂出汁，按照100 g/t加入焦亞硫酸鉀，并加果膠酶酶解。

調糖：加入一定量的白砂糖，調整果汁糖度使酒精度達到12度。

酵母活化：按照0.02%(質量分數)加入FERMOL ROUGE BAYANUS酵母，發(fā)酵前活化。

發(fā)酵：在20～25 ℃室溫條件發(fā)酵7～10 d，過濾后進行后發(fā)酵，后發(fā)酵時間為5周左右。

陳釀：在15～20 ℃室溫條件陳釀。陳釀過程中不進行蘋果酸-乳酸發(fā)酵。

1.3.3 電子鼻測定方法

山葡萄酒在3 000 r/min的條件下離心10 min，取上層清液。待電子鼻測試數據穩(wěn)定后，取5 mL葡萄酒清液置于40 mL頂空瓶中，靜態(tài)平衡一段時間，在進樣口放置0.45 μm濾膜，針頭從采樣瓶頂空刺入取樣。每個年份取5個樣品。電子鼻清洗時間、樣品準備時間、檢測時間經優(yōu)化分別為240、5和100 s，電子鼻軟件每1 s自動記錄1次數據，表1為電子鼻傳感器對應的敏感物質[13]。

表1 電子鼻傳感器及對應的敏感物質Table 1 Electronic nose sensor and corresponding sensitive material

1.3.4 HS-SPME與GC-MS聯(lián)用測定方法

1.3.4.1 揮發(fā)性風味物質的提取

固相萃取采用CTC三位一體自動進樣器取樣分析；取5 mL樣液于頂空瓶中，以250 r/min、50 ℃條件振蕩15 min，在50℃條件下萃取30 min后，進樣分析，解析時間5 min。每個年份取2個樣品，實驗結果取2個樣品的平均值。

1.3.4.2 色譜條件

色譜柱：DB-wax(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；進樣溫度：260℃；程序升溫：40 ℃保持5 min，以5 ℃/min升至220 ℃，以20 ℃/min升至250 ℃，保持2.5 min；載氣：He(99.999%)；流量：1 mL/min；不分流模式進樣。

1.3.4.3 質譜條件

接口溫度：260 ℃；離子源溫度：230 ℃；四級桿溫度：150 ℃；電離方式：EI,70 ev；掃描方式：全掃描；質量范圍：20～400。

1.4 數據分析

用電子鼻系統(tǒng)配套軟件對數據進行主成分分析(principle component analysis，PCA)和線性判別分析(linear discriminant analysis，LDA)。其他數據分析用SPSS ver. 10.0 package program和Excel軟件處理。

GC-MS檢測結果通過NIST14譜庫檢索處理，當結合匹配度(≥80%)和保留指數RI值(≥800)時初步確定揮發(fā)性成分的名稱。保留指數根據改進的Kovats法計算得到，通過C7-C23正構烷烴混標物的保留時間來計算未知化合物的RI值[14]。

以2-辛醇為內標物進行半定量分析，揮發(fā)性成分的質量濃度根據公式(1)計算[15]。

(1)

式中:X，香氣物質的質量濃度,μg/L；A，測得的香氣物質的峰面積；C，內標物的質量濃度,μg/L；A0，測得的內標物的峰面積

2 結果與分析

2.1 不同年份野生山葡萄酒PCA和LDA分析

通過SPSS對3個年份10個傳感器的響應值進行主成分分析，得出第一主成分和第二主成分的表達公式。第一主成分=0.960ZS1+0.980ZS2+0.991ZS3+0.941ZS4+0.988ZS5+0.817ZS6+0.930ZS7+0.935ZS8+0.976ZS9+0.172ZS10。第二主成分=-0.253ZS1-0.140ZS2-0.065ZS3-0.123ZS4-0.067ZS5+0.192ZS6-0.150ZS7+0.258ZS8-0.080ZS9+0.974ZS10。

由圖1可知，PCA分析的總貢獻率為99.57%，遠大于70%，說明該方法能夠分析樣品揮發(fā)性風味的主要特征[16]；而且年份相差越久，樣品間距離越遠，揮發(fā)性成分差異越大，并且差異主要體現在第一主成分上。由主成分表達式可知，傳感器S1、S2、S3、S5和S9對第一主成分影響較大，結合表1說明3個年份中芳香成分、氮氧類、苯環(huán)類、3碳烷烴類、有機硫類等化合物均存在差異。

圖1 不同年份年野生山葡萄酒的PCA分析結果Fig.1 PCA analysis results of wild mountain wines in different years

由圖2可知，LDA分析的總貢獻率為96.62%，說明用該方法分析樣品揮發(fā)性的差異具有可行性。該分析結果與PCA分析結果一致。

圖2 不同年份野生山葡萄酒的LDA分析結果Fig.2 LDA analysis results of wild mountain wines in different years

圖1和圖2顯示，2017和2018年樣品點相隔較近，而2016年與2017和2018年樣品點相隔較遠，說明野生山葡萄酒年份越久，揮發(fā)性成分的差異越大。

2.2 不同年份野生山葡萄酒揮發(fā)性成分

從表2和圖3可知，在3個年份野生山葡萄酒中共檢測揮發(fā)性成分153種，其中酯類有56種，醇類有30種，醛類2種，酮類11種，酸類5種，烴類25種，苯環(huán)類16種，其他類8種，其物質的種類與劉麗媛等[17]的研究結果類似，而李記明等[4]野生山葡萄酒的研究中沒有發(fā)現苯環(huán)類物質。3年共有揮發(fā)性成分24種。

表2 不同年份野生山葡萄酒揮發(fā)性成分Table 2 Volatile components of wild mountain wines in different years

續(xù)表2

序號名稱質量濃度/(μg·L-1)2016年2017年2018年風味特征匹配度RI值RI檢索值27琥珀酸二乙酯160.57--清淡的葡萄味[30]931324.171723[42]28水楊酸甲酯23.13--香脂味[31]901352.131771[43]29亞氨基二碳酸,二乙酯7.06--871357.0630丁二酸羥基二乙酯106.07287.02-871388.4431亞砷酸三酯931399.75322-甲基,3-甲基丁酯-4.57-911409.1433辛酸甲酯7.517.8122.34柔軟,蘋果皮味[30]931419.101483[20]34氯甲酸辛酯59.13--971426.6635甲酸辛酯-30.74-香橙味[29]971437.3236辛酸乙酯555.59477.92274.89果香,菠蘿,梨,花香[30]991442.051414[43]372-(5-甲基-5-乙烯基四氫呋喃-2-基)丙-2-基碳酸乙酯70.87--851458.5238乙酸2-苯乙基酯19.43--831529.991805[43]39癸酸甲酯--48.32蠟香,皂香,果香[31]991583.571584[43]40壬酸乙酯--42.17果香,玫瑰香[33]881603.651533[43]41己酸己酯--1.93蘋果皮,桃味[20]971621.511723[20]42癸酸乙酯34.3322.66739.35脂肪味,果香,舒適的醋味[33]991652.411648[43]43十一烷酸乙酯--5.16椰子香[31]841758.621782[42]44戊二酸二酯55.75--861775.0045十二烷酸乙酯(月桂酸)--706.25花香,果香[33]931867.841843[43]46β-丙氨酸,N-甲基-乙酯-14.79-962005.5347琥珀酸2,4-二甲基戊-3-基異丁酯30.75--992013.3548十五烷酸,3-甲基丁酯--10.66微弱油香和脂香[35]832022.162092[41]49十四烷酸乙酯6.79-103.36椰子香,脂香[37]942086.132060[43]50十六烷酸乙酯94.6840.97266.7微弱蠟香,奶油香氣[35]992201.072241[43]519-十六烯酸乙酯--15.56992221.442251[43]52丁二酸乙基甲基酯29.8421.7-822539.9653琥珀酸2-庚基乙基酯139.36--862736.4554十八烷酸乙酯20.37-5.61蠟香[35]992746.332247[43]55亞油酸乙酯--28.22902759.732531[43]56己二酸4-甲氧基-2-甲基丁基丙酯7.1--992761.19醇類57乙醇793.18593.75551.53刺激醇味,輕微藥味[38]90955.73976[41]581-丙醇45.6131.3319.63具有淡淡的醇香[22]81965.121029[43]592-甲基-1-丙醇116.71107.0660.4790995.111083[43]60環(huán)丁醇6.254.833.1990993.3261異丁醇13.7114.9426.46苦味[20]981008.001094[43]621-丁醇25.17--酒精味[33]811003.981162[43]63異戊醇-0.750.8指甲油,威士忌味[33]981044.001214[43]643-甲基-1-丁醇1790.882127.32007.2有不愉快氣味[35]861092.991201[44]651-戊醇6.83--雜醇油氣味[38]861109.951254[43]66反式3-己烯-1-醇138.06--青草氣味[31]831089.951360[43]671-己醇399.63218.67392.13青草味,土司味[33]971095.071350[43]683-己烯-2-醇,(E)14.04-8.35青葉香氣[33]971108.6369順式-3-己烯-1-醇113.98--青草氣味[31]881129.001459[20]702-己烯-1-醇,(E)19.25--青蘋果味[39]871146.6471反式3-庚烯-1-醇158.49--871171.47722-(1-甲基乙氧基)-1-丙醇-164.68-931175.59731,3-二氧戊環(huán)-4-甲醇--115.76811281.42742-辛醇406.4139.49蘑菇味[38]861293.081546[44]751-辛醇--31.55柑橘香,玫瑰花香,甜草藥味[33]861305.021561[43]763,4-二羥基苯基乙二醇20.649.09-861314.31771-溴-7-辛醇10.41--851320.76

續(xù)表2

序號名稱質量濃度/(μg·L-1)2016年2017年2018年風味特征匹配度RI值RI檢索值784-甲基-4-庚醇-7.47-881330.81795-壬醇-36.38-821349.59802,6-二甲基-4-庚醇56.92--971369.421546[44]811-壬醇41.2833.31-強烈的水果清香,薔薇香味[33]921376.151695[42]823-乙基-3-辛醇38.34--801494.87834-萜品醇14.44--951509.121559[20]84香茅醇11-13.49花香,柑橘香[35]801599.861883[20]852-甲基丙氧基醇231.4863.1-87862-(甲氨基)乙醇--30.2895醛類87乙醛146.5394.3540.55青草香,水果味[33]83944.271082[43]88糠醛-25.15-熏香味,果香,花香[33]831040.571452[43]酮類893-甲基-2-惡唑烷酮--8.2821011.56903-羥基-2-丁酮16.64--奶油味[20]971050.241342[20]918-壬烯-2-酮5.41--841532.07923H-吡唑-3-酮20.16--881643.0893α-紫羅蘭酮18.79--香脂味,花味[21]801643.11942-庚烯-4-酮1026.83656.92248.65801681.1495反式2-丁烯-1-酮28.657.43-971711.61962-丁烯-1-酮-215.2315.5871710.9597大馬士酮3--樹皮味,甜蘋果味[33]921711.641818[43]982,5-環(huán)己二烯-1-酮3.94--802017.36993-甲基-環(huán)庚酮,-3.22-91酸類100醋酸144.26--刺激性酸味[37]81818.011441[43]101丁酸11.27--奶油[31]839661627[43]102己酸35.1221.8731.96奶酪味,脂肪味[31]871095.691849[43]103辛酸5.168.7218.14酸臭味脂肪味[31]981623.412066[43]1041-環(huán)己烯-1-羧酸60.06--821633.74烴類105環(huán)丙烷41.31--87810.59106環(huán)戊烷15.86--90800.66107乙氧基-乙烯-6.28-90850.09108環(huán)己烯5.18--941058.771097-氧雜二環(huán)[2.2.1]庚烷4.39--871073.931102-丁氧基戊烷12.35--971075.591111,3,3-三甲氧基丁烷9.86--961093.081122-乙氧基丙烷15.01--911175.641133,4-二乙基-2-己烯2.42--801207.811142,3-二氫-1-氧代-1H-非那烯11.68--831209.67115雙環(huán)[4.2.0]辛-1,3,5-三烯--10.99881309.861161,1-二乙氧基-3-甲基丁烷13.2--801319.041062[34]1173-甲基-1-辛烯--8.69831338.501189-硼雙環(huán)[3.3.1]壬烷50.42--851446.421221[42]119d檸檬烯11.8--有類似檸檬的香味[35]971478.56120鄰傘花烴19.91--851556.57121雙環(huán)(4.4.0)癸烷-5.33--901690.121237[43]1221,1-二乙氧基乙烷-415.23-831649.38889[36]1231,4,7,10,13,16-六氧雜環(huán)十八烷1.74--831673.841289[34]124十三烷13.657.9511.42801680.211387[34]125十四烷11.8711.399.31801687.60126十五烷9.025.967.68831676.93

續(xù)表2

序號名稱質量濃度/(μg·L-1)2016年2017年2018年風味特征匹配度RI值RI檢索值127丁香烯33.75--971855.561281,3,2-二氧雜硼雜環(huán)戊烷--16.81832061.401291,3-二氧雜環(huán)庚烷-20.17-832052.72苯類130苯酚294.1876.916.63似膠水,墨汁[40]931007.901970[32]131苯甲醇63.87--苦杏仁味[33]931091.041879[43]1324-甲氧基-苯酚-82.48-951153.742081[44]133苯甲酰溴-72.169.41881107.751342-丙烯基-苯73.18--891153.74135甲硫基-苯24.26149.45-871217.75136苯乙醇890.11.85-淡雅清幽的玫瑰花香味[33]951234.121929[43]137苯乙烯-119.36-芳香氣味[38]931282.651296[42]1382-氯乙氧基苯4.71--971302.751392-(1-甲基-2-丁烯基)-4-甲氧基-苯酚-24.3811316.97140苯甲酸乙酯65.15--果香[35]931470.241651[44]141苯甲醛43.63-34.84苦杏仁味[38]981507.751510[43]1421-甲基乙基苯175.1--881564.081434-烯丙基-2-甲氧基苯酚3.02-65.84871567.371442,4-二叔丁基苯酚57.64-4.23891897.502279[44]1451-(1,5-二甲基-4-己烯基)-4-甲基-苯10.73--882726.66其他146二甲基二硫化物-4.59-998291011[41]147丙氨酰甘氨酸62.24--84976.11148二異丙醚15.55--861005.401491,5-二甲基-1H-咪唑48.92--861341.521502-乙烯基四氫呋喃10.86--851497.401526[41]1512-肼基-4,6-二甲基嘧啶-13.39-961514.81152嗎啡-雙(三甲基甲硅烷基)醚7.5--801561.531531,1,5-三甲基-1,2-二氫化萘-19.72-861649.57

注：“-”表示未檢測出。

圖3 不同年份野生山葡萄酒揮發(fā)性成分質量濃度比較Fig.3 Comparis on of the concentration of volatile components in wild mountain wines in different years

2016年檢出揮發(fā)性物質104種，質量濃度為12 296.62 μg/L；2017年檢出64種，質量濃度為9 666.88 μg/L；2018年檢出59種，質量濃度為8 144.12 μg/L，由此可見，山葡萄酒年份越久，揮發(fā)性物質種類和質量濃度越多，香氣更加飽滿。

2.2.1 酯類物質分析

酯類化合物對提升葡萄酒香氣復雜性至關重要，被認為是葡萄酒香氣的重要貢獻者，也是葡萄酒果香主要來源之一[18-19]。發(fā)酵香氣中酯類大部分是酵母等微生物活動產生的中性酯，類似水果香氣[20]。由表2可知，2016年檢出酯類物質32種，質量濃度為4 528.05 μg/L；2017年檢出香氣物質26種，質量濃度為4 207.06 μg/L；2 018年檢出香氣物質27種，質量濃度為4 004.28.12 μg/L。可見山葡萄酒酯類物質的種類和質量濃度所占比例較大，對野生山葡萄酒風味的貢獻不容忽視。

2.2.2 醇類物質分析

高級醇又稱雜醇油，是酵母在發(fā)酵過程中形成的代謝副產物，對葡萄酒的風味和品質有重要影響，雜醇油含量適中，葡萄酒不僅香氣優(yōu)雅，而且會增加酒體的協(xié)調性；若含量過高則會帶來異味，并易使人頭疼和醉酒[21]。表2中2016年檢出醇類物質23種，質量濃度為4 106.40 μg/L；2017年檢出香氣物質15種，質量濃度為3 419.04 μg/L；2018年檢出香氣物質14種，質量濃度為3 330.33 μg/L。可見山葡萄酒年份越久生成的高級醇越多；醇類物質的種類和質量濃度僅次于酯類物質，也是野生山葡萄酒重要的揮發(fā)性成分之一。

2.2.3 醛類、酮類、酸類、烴類、苯環(huán)類和其他類物質分析

醛類、酮類、酸類、烴類、苯環(huán)類和其他類物質對山葡萄酒的風味也具有重要作用，主要起到補充和修飾的作用。表2中2016年、2017年和2018年野生山葡萄酒酮類分別檢出7、4和3種，共有物質為2-庚烯-4-酮。酮類物質主要呈現桉葉味、脂肪味和焦燃味，且酮類香氣成分貢獻率較高[22]，可能會增加野生山葡萄酒風味的醇厚感。適量的酸會增加葡萄酒的滋味與口感，還會參與酯化反應，賦予葡萄酒水果香氣[23]。表2中2016年、2017年和2018年分別檢出5、2和2種酸類物質，2016年酸類的質量濃度和種類均高于其它2年；烴類物質芳香成分貢獻率較低[24]，雖然含量豐富但對樣品風味貢獻率較小，有些雜環(huán)化合物的重要中間體有利于提升葡萄酒的整體風味品質。表2中2016年、2017年和2018年分別檢出烴類19、6和6種，苯環(huán)類12、6和6種，其他類4、3和0種，質量濃度均較低，對風味貢獻不大。

綜合來看，野生山葡萄酒的年份不同，呈現的風味也不同，其中酯類和醇類物質是主要的風味成分；隨著年份的增加，其風味更加豐富濃郁。這一結果與張眾[25]、席艷如[26]和郭松年[27]等人的研究結果大體一致。而蔣寶等[28]對黃土高原不同地形的赤霞珠葡萄進行揮發(fā)性成分分析，得出醇類是主要成分，其次是酯類和脂肪酸類，與本文結果略有不同。

3 結論

電子鼻結合SPME-GS-MS技術可以高效準確地檢測長白山野生山葡萄酒的揮發(fā)性成分。結合PCA和LDA等化學計量學方法可定性區(qū)分不同年份野生葡萄酒的揮發(fā)性成分；2016年揮發(fā)性成分的區(qū)分效果好于其他2年。

本研究檢測出2016年、2017年和2018年野生山葡萄酒中存在153種揮發(fā)性成分，共有的揮發(fā)性成分為24種；酯類和醇類物質是主要的風味成分，隨著年份的增加，揮發(fā)性物質的種類和質量濃度也增加，其風味更加豐富濃郁；與電子鼻定性測定的結果相符。