王小蕾，劉月煥，段會(huì)娟，劉立新，楊志遠(yuǎn)，趙際成，潘潔，劉瑞華，趙文奇，田方杰，呂金寶，林健

鴨坦布蘇病毒的血凝性

王小蕾1，劉月煥1，段會(huì)娟1，劉立新1，楊志遠(yuǎn)1，趙際成1，潘潔1，劉瑞華1，趙文奇2，田方杰2，呂金寶3，林健1

（1北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100097；2北京農(nóng)學(xué)院，北京 102206；3內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，呼和浩特 010018）

【】研究鴨坦布蘇病毒是否具有血凝性，確定其凝集的紅細(xì)胞種類和血凝反應(yīng)條件。鴨坦布蘇病毒以不同稀釋度經(jīng)腦內(nèi)途徑接種1—3日齡的BALB/c乳鼠，觀察乳鼠發(fā)病情況；收集發(fā)病乳鼠鼠腦，參照文獻(xiàn)記載的方法用蔗糖-丙酮提純病毒液；以適當(dāng)滅活劑滅活病毒，觀察滅活后的病毒液性狀，并以6日齡SPF雞胚進(jìn)行滅活檢驗(yàn)；參照文獻(xiàn)記載的方法初步測(cè)定病毒液與雞、鴨、鵝、鴿、豬紅細(xì)胞懸液的反應(yīng)性；比較并確定鴨坦布蘇病毒進(jìn)行血凝反應(yīng)的適宜紅細(xì)胞懸液濃度；比較pH6.0—7.0的反應(yīng)體系對(duì)病毒血凝效價(jià)的影響；比較4℃、室溫和37℃對(duì)病毒血凝反應(yīng)結(jié)果的影響。乳鼠接種鴨坦布蘇病毒后6日，1﹕10稀釋接種組的乳鼠出現(xiàn)嚴(yán)重的臨床癥狀，表現(xiàn)為四肢抽搐，癱瘓等。大部分乳鼠處于瀕死狀態(tài)，1﹕50和1﹕100稀釋接種組的乳鼠癥狀稍輕于1﹕10稀釋接種組乳鼠的癥狀；提純后鴨坦布蘇病毒液呈淡紅色澄明液體，用甲醛滅活后病毒液性狀無明顯改變，但用β-丙內(nèi)酯后產(chǎn)生大量絮狀沉淀，性狀發(fā)生明顯改變；病毒液可以凝集雞、鴨、鵝、鴿、豬紅細(xì)胞懸液；不同濃度紅細(xì)胞懸液的比較結(jié)果顯示，病毒液與0.33%的紅細(xì)胞懸液作用時(shí)凝集圖形清晰穩(wěn)定；通過不同pH反應(yīng)體系的比較，發(fā)現(xiàn)病毒液在pH 6.0—6.8時(shí)均可發(fā)生血凝反應(yīng)，當(dāng)pH為6.0—6.2時(shí)凝集效價(jià)最高；通過不同反應(yīng)溫度的比較，證實(shí)病毒液在4℃、室溫和37℃時(shí)均具有血凝性，但4℃時(shí)的血凝反應(yīng)時(shí)間明顯延長。乳鼠增殖的鴨坦布蘇病毒提純后具有廣譜的血凝性，可以凝集雞、鴨、鵝、鴿和豬的紅細(xì)胞，血凝性穩(wěn)定，在4℃、室溫和37℃下均可以與鵝紅細(xì)胞凝集，以0.33%濃度的紅細(xì)胞懸液血凝為宜，反應(yīng)最適pH為6.0—6.2。

鴨坦布蘇病毒；血凝；反應(yīng)條件

0 引言

【研究意義】2010 年春季開始，在浙江、江蘇、山東、河北和北京等地區(qū)相繼暴發(fā)了一種以鴨產(chǎn)蛋下降為主要特征的疫病，經(jīng)病原學(xué)研究證實(shí)該病是由黃病毒科黃病毒屬中鴨坦布蘇病毒（duck Tembusu virus，DTMUV）引起[1-3]。北京鴨、櫻桃谷鴨、金定鴨、麻鴨、康貝爾鴨和鵝等禽類均可發(fā)病，給養(yǎng)鴨業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[4]。黃病毒屬成員多數(shù)具有血凝性，如黃熱病病毒、流行性乙型腦炎病毒、登革熱病毒等可以凝集雞紅細(xì)胞[5]，利用這種血凝特性可以進(jìn)行疫病的診斷與抗體檢測(cè)[6-10]，具有操作簡單、敏感性高、特異性強(qiáng)、結(jié)果易于判定的優(yōu)點(diǎn)。鴨坦布蘇病毒同屬于黃病毒屬，研究其是否具有血凝特性，進(jìn)而利用該特性研制鴨坦布蘇病毒抗體檢測(cè)方法，對(duì)該病的實(shí)驗(yàn)室血清學(xué)診斷和免疫監(jiān)測(cè)等將有重要的實(shí)際臨床應(yīng)用價(jià)值?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】坦布蘇病毒首次于1968年在Sarawak地區(qū)的蚊子體內(nèi)分離到，曾一度認(rèn)為家禽可能是病毒的自然宿主[11]。2000年，研究人員報(bào)道了一種新的名為Sitiawan的黃病毒感染雞后能夠引起雞生長發(fā)育受阻[12]，Sitiawan病毒與坦布蘇病毒核酸的同源性為92%。我國從鴨體內(nèi)分離到的坦布蘇病毒與Bagaza病毒的核酸高度同源[13-14]。在鴨坦布蘇病防控上，有多家單位投入了對(duì)疫苗及其免疫效果的研究[15-18]，市場(chǎng)上也有了商品化的疫苗，但在鴨坦布蘇病毒抗體檢測(cè)技術(shù)方面，姬希文和LI等進(jìn)行了ELISA 抗體檢測(cè)試劑盒的研究[19-20]，WANG等建立了一種乳膠凝集診斷方法用于抗體的快速檢測(cè)[21]，DENG等研制了檢測(cè)DTMUV抗體的雙抗原夾心式免疫層析試紙條[22]，目前還沒有商品化的診斷試劑。在鴨坦布蘇病毒血凝性研究方面，現(xiàn)有資料表明，普通方法增殖的鴨坦布蘇病毒對(duì)紅細(xì)胞無凝集特性[23-28]，尚無鴨坦布蘇病毒血凝抑制試驗(yàn)的研究報(bào)道?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】現(xiàn)有資料報(bào)道鴨坦布蘇病毒通過接種鴨胚、雞胚、鴨胚成纖維細(xì)胞、vero細(xì)胞和BHK-21細(xì)胞等增殖[23,25-27,29]，本研究通過改進(jìn)鴨坦布蘇病毒增殖工藝，將鴨坦布蘇病毒接種乳鼠腦組織，收獲含病毒的腦組織，經(jīng)丙酮處理后暴露病毒的血凝活性。【擬解決的關(guān)鍵問題】對(duì)鴨坦布蘇病毒是否具有血凝性進(jìn)行研究，確定其凝集的紅細(xì)胞種類和血凝反應(yīng)條件。

1 材料與方法

本研究于2015年8月至2016年10月在北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所完成。

1.1 材料

1.1.1 病毒 鴨坦布蘇病毒HB株F4代，由北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所分離、鑒定和保存。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 1—3日齡的BALB/c乳鼠，由購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司的成年BALB/c鼠繁殖而來。6日齡SPF雞胚，購自北京梅里亞維通實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

1.1.3 紅細(xì)胞 鵝、鴨、鴿、豬紅細(xì)胞分別采自北京周邊養(yǎng)殖場(chǎng)的健康動(dòng)物，雞紅細(xì)胞采自SPF雞，購于北京梅里亞維通實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

1.1.4 96孔U型微量板 購自Greiner公司

1.1.5 主要試劑 丙酮購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑北京有限公司；甲醛購自北京益利精細(xì)化學(xué)品有限公司；β-丙內(nèi)酯購自Alfa Aesar公司；阿氏液、PBS（0.01 mol·L-1, pH 7.2）、0.5%乳漢液按常規(guī)方法配制；pH 9.0 BABS配制方法：1.5 mol·L-1NaCl溶液80 ml，0.5 mol·L-1H3BO3溶液100 mL，1 mol·L-1NaOH溶液24 mL，牛血清白蛋白1 g，加蒸餾水至1 000 mL ；VAD的配制方法參見文獻(xiàn)[30]，使反應(yīng)體系的pH為6.0—7.0。

1.2 病毒增殖

將F4代毒種用滅菌PBS 進(jìn)行1﹕10、1﹕50、1﹕100稀釋，以0.025 mL/只的劑量分別經(jīng)腦內(nèi)途徑接種1—3日齡乳鼠。乳鼠接種后繼續(xù)由母鼠哺乳，攻毒后4—10日，觀察不同稀釋度的病毒液接種乳鼠后，乳鼠出現(xiàn)臨床癥狀、死亡時(shí)間和死亡數(shù)。

1.3 病毒提純

接種后6日，觀察到接種的乳鼠出現(xiàn)癱瘓等臨床癥狀，二氧化碳安樂死后收獲乳鼠。取鼠腦，參照文獻(xiàn)記載的方法[30-31]用蔗糖-丙酮處理腦組織，提取病毒液。

1.4 滅活劑和滅活時(shí)間的確定

將上述制備的病毒液平均分為6組，其中3組分別加入終濃度為0.05%、0.1%、0.15%的甲醛，另外3組分別加入終濃度為0.0125%（1/8000）、0.025%（1/4000）和0.05%（1/2000）的β-丙內(nèi)酯溶液，搖勻后置2—8℃條件下滅活。于滅活后24、48、72、96、120 h分別取樣進(jìn)行滅活檢，每份樣品經(jīng)卵黃囊途徑接種5枚6日齡SPF雞胚，每胚0.2 mL，置37℃孵育。24 h照胚，在24 h內(nèi)死亡的雞胚判為非特異性死亡，非特異性死亡應(yīng)不超過1枚。24 h后，每日照胚2次，觀察至168 h，雞胚全部存活，判為滅活完全。24—168 h有死胚及時(shí)取出，收獲胚體，盲傳1代，如無雞胚死亡，判為滅活完全。

1.5 紅細(xì)胞懸液的制備

將采集的各種動(dòng)物血液，分別與等量阿氏液混合。使用前用PBS洗滌3次，前兩次1 500 r/min，離心10 min，最后1次以同樣的轉(zhuǎn)速離心15 min，根據(jù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，將沉積的紅細(xì)胞分別用VAD配制成所需濃度的紅細(xì)胞（V/V）懸液，置4—8℃?zhèn)溆谩?/p>

1.6 HA測(cè)定

96孔U型微量板，從第1孔至第12孔，每孔加入BABS 50 μL，吸取滅活后的病毒液50 μL，依次作2倍系列稀釋。按試驗(yàn)設(shè)計(jì)加入不同種、不同濃度或不同pH值VAD配制的紅細(xì)胞。設(shè)不加樣的紅細(xì)胞對(duì)照孔。立即在微量板振搖器上搖勻，放入濕盒，置設(shè)定溫度下作用50—60 min，觀察凝集反應(yīng)。當(dāng)對(duì)照孔中的紅細(xì)胞呈顯著紐扣狀時(shí)判定結(jié)果。以使紅細(xì)胞完全凝集的最高稀釋度作為判定終點(diǎn)。比較凝集圖形、清晰度和穩(wěn)定程度。

2 結(jié)果

2.1 病毒增殖

接種后6日，1﹕10稀釋組的20只乳鼠出現(xiàn)嚴(yán)重的臨床癥狀，表現(xiàn)為四肢抽搐，癱瘓等。除3只乳鼠死亡（3/20）外，其余乳鼠處于瀕死狀態(tài)。1﹕50和1﹕100稀釋組的193只和120只乳鼠癥狀稍輕于1﹕10稀釋組乳鼠的癥狀，分別有6只（6/193）和4只（4/120）乳鼠死亡（表1）。死亡鼠棄去，進(jìn)行無害化處理，發(fā)病鼠收獲用于制備抗原。

表1 毒種不同稀釋倍數(shù)接種后乳鼠發(fā)病情況

N表示乳鼠狀態(tài)正常；A表示少量乳鼠出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)失調(diào)；B表示部分乳鼠出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)失調(diào)；C表示有個(gè)別乳鼠死亡，其余乳鼠出現(xiàn)行動(dòng)困難、蹬腿、驚厥現(xiàn)象

N: The status of the sucking mice is normal; A: A few of the sucking mice appear ataxia; B: Some of the sucking mice appear ataxia; C: A small part of the sucking mice are dead, and others appear difficulty in moving, kicking and convulsions

2.2 病毒提純及滅活

約74 g鼠腦組織勻漿，經(jīng)蔗糖-丙酮提純，共提取出408 mL病毒液，呈淡紅色澄明液體（圖1）。用終濃度為0.05%、0.1%、0.15%的甲醛，分別滅活24、48、72、96和120 h，滅活后的病毒液性狀無明顯改變，滅活檢驗(yàn)接種的5枚雞胚均存活。

其余病毒液原計(jì)劃用β-丙內(nèi)酯溶液滅活，由于加入終濃度為0.0125%的β-丙內(nèi)酯后瞬間病毒液產(chǎn)生大量絮狀沉淀，性狀發(fā)生明顯改變（圖2），其他2種濃度的試驗(yàn)未繼續(xù)進(jìn)行（表2）。

2.3 HA測(cè)定

2.3.1 不同動(dòng)物紅細(xì)胞測(cè)定滅活病毒液的HA效價(jià)和凝集圖形 雞、鵝、鴨、鴿、豬的紅細(xì)胞用反應(yīng)終體系為pH 6.2的VAD配制成0.33%的紅細(xì)胞懸液，分別與甲醛滅活后的病毒液在37℃作用50—60 min。結(jié)果顯示，病毒液可以凝集上述紅細(xì)胞，且HA效價(jià)基本一致，為1﹕256—1﹕512（表3）。其中，豬紅細(xì)胞沉降慢，在同一反應(yīng)時(shí)間和條件下，對(duì)照孔紅細(xì)胞不能完全沉降至孔底形成實(shí)心點(diǎn)狀，而是形成環(huán)狀，結(jié)果不易判定；鴿、鵝、鴨和雞（雛雞和育成雞）的紅細(xì)胞的凝集圖形清晰穩(wěn)定。

圖1 滅活前的病毒液

圖2 β-丙內(nèi)酯滅活（左）和甲醛滅活（右）的病毒液

表2 病毒液的滅活試驗(yàn)

A表示死亡雞胚數(shù)；B表示滅活檢驗(yàn)所用的雞胚數(shù)；ND表示沒有進(jìn)行相關(guān)檢驗(yàn)

A: No. of dead chicken embryo; B: No. of total chicken embryo used in inactivation test; ND: Not done

表3 不同動(dòng)物紅細(xì)胞的HA效價(jià)和凝集圖形

2.3.2 不同濃度鵝紅細(xì)胞的HA效價(jià)和凝集圖形 用反應(yīng)終體系為pH 6.2的VAD配制成0.2%、0.33%、0.5%、1%的鵝紅細(xì)胞懸液，分別與甲醛滅活后的病毒液在37℃作用50—60 min。結(jié)果顯示，0.2%鵝紅細(xì)胞的HA效價(jià)最高，為1:1 024，但血凝圖形過小，不清晰，結(jié)果不易判定；1%鵝紅細(xì)胞的HA效價(jià)最低，為1:128，出現(xiàn)解凝現(xiàn)象。0.33%鵝紅細(xì)胞的HA效價(jià)為1:512，凝集圖形清晰穩(wěn)定，是比較理想的紅細(xì)胞濃度（表4）。

2.3.3 不同pH值反應(yīng)體系對(duì)HA效價(jià)的影響 鵝紅細(xì)胞用不同VAD配制0.33%的紅細(xì)胞懸液，分別與甲醛滅活后的病毒液在37℃作用50—60 min。試驗(yàn)結(jié)果表明，反應(yīng)體系的pH值對(duì)HA效價(jià)和凝集圖形有顯著的影響，隨著pH值的升高，病毒液的HA效價(jià)降低，凝集圖形變得不穩(wěn)定（表5）。

2.3.4 不同反應(yīng)溫度對(duì)HA效價(jià)的影響 用反應(yīng)終體系為pH 6.2的VAD配制成0.33%的鵝紅細(xì)胞懸液，分別與甲醛滅活后的病毒液在4℃、37℃及室溫作用50—60 min，觀察反應(yīng)結(jié)果。37℃及室溫下反應(yīng)病毒液的HA效價(jià)及凝集圖形差別不大；4℃條件下作用60 min后，病毒液與紅細(xì)胞出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，但紅細(xì)胞對(duì)照沉降不完全，無法判定HA效價(jià)，過夜作用后，紅細(xì)胞對(duì)照沉降完全，凝集圖形清晰，HA效價(jià)與37℃反應(yīng)時(shí)相同。這表明鴨坦布蘇病毒在4℃時(shí)仍具有血凝性（表6）。

表4 不同濃度鵝紅細(xì)胞的HA效價(jià)和凝集圖形

表5 不同pH值反應(yīng)體系對(duì)HA效價(jià)的影響

表6 不同反應(yīng)溫度對(duì)HA效價(jià)的影響

3 討論

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，黃病毒大多能夠凝集鵝、鴿和新生雛雞的紅細(xì)胞，但其血凝素易于破壞，而且血凝反應(yīng)要求比較嚴(yán)格的pH域[32]。鴨坦布蘇病毒屬于黃病毒屬Ntaya病毒群，但在前期的報(bào)道中，用雞胚、鴨胚、鴨胚成纖維細(xì)胞、vero細(xì)胞和BHK－21增殖的鴨坦布蘇病毒不能凝集雞、鴨、鵝的紅細(xì)胞[23-28]。筆者參考流行性乙型腦炎病毒血凝抑制試驗(yàn)抗原的制備方法，用乳鼠腦組織增殖鴨坦布蘇病毒并用丙酮處理提純病毒液，進(jìn)行了血凝性的研究。

為保證生物安全，對(duì)病毒液先進(jìn)行滅活。β-丙內(nèi)酯和甲醛是兩種常用的病毒滅活劑，出人意料的是，提純后澄明的病毒液加入β-丙內(nèi)酯很快就有異物產(chǎn)生，該現(xiàn)象表明，提純的病毒液中可能存在與β-丙內(nèi)酯起化學(xué)反應(yīng)的物質(zhì)或者病毒可直接與β-丙內(nèi)酯發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，因此，β-丙內(nèi)酯不能用于滅活提純的鴨坦布蘇病毒液。終濃度為0.05%的甲醛2—8℃作用24h即可完全滅活病毒，且后續(xù)的試驗(yàn)結(jié)果表明，滅活后的病毒液仍具有血凝性。

提純的病毒液可與雞、鴨、鵝、鴿等禽紅細(xì)胞發(fā)生凝集反應(yīng)，也可以凝集哺乳動(dòng)物豬的紅細(xì)胞，相比之下與禽紅細(xì)胞的血凝反應(yīng)更穩(wěn)定。我們?cè)扇⊥瑯拥姆椒ㄌ幚眸喤咴鲋车牟《疽海蚰乙海?，但病毒沒有暴露出對(duì)鵝紅細(xì)胞的凝集特性（內(nèi)部資料），可能與尿囊液中抑制物的化學(xué)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)不同（對(duì)丙酮的敏感性）有關(guān)。

紅細(xì)胞濃度會(huì)影響血凝圖形。紅細(xì)胞濃度過低，紅細(xì)胞對(duì)照孔的沉淀圖形過小，不利于觀察判定。本研究中，采用0.33%或0.5%的紅細(xì)胞與鴨坦布病毒進(jìn)行血凝反應(yīng)易于觀察到血凝現(xiàn)象，因采用0.5%紅細(xì)胞懸液時(shí)有解凝跡象，0.33%紅細(xì)胞懸液更為合適。黃病毒對(duì)血凝反應(yīng)的pH要求比較嚴(yán)格，如東方馬腦炎病毒、西方馬腦炎病毒要求pH 6.4左右，登革熱病毒1型和2型、流行性乙型腦炎病毒、西尼羅河病毒等要求pH 7.0[5]。通過研究發(fā)現(xiàn)，鴨坦布蘇病毒血凝反應(yīng)適宜的pH為6.0—6.8，當(dāng)pH為6.0—6.2時(shí)，HA效價(jià)最高，且凝集圖形清晰穩(wěn)定。某些病毒的血凝作用具有溫度依賴性，只能在某個(gè)溫度范圍內(nèi)才出現(xiàn)血凝現(xiàn)象；但另一些病毒可以在4℃、室溫和37℃呈現(xiàn)統(tǒng)一的血凝作用[32]。試驗(yàn)結(jié)果表明鴨坦布蘇病毒可以在4℃、室溫和37℃與鵝紅細(xì)胞凝集。鈕慧敏等用蔗糖丙酮法提純的鼠腦抗原也能凝集0.5%鵝紅細(xì)胞，HA效價(jià)為1:32[29]，可能與具體操作方法和血凝條件不同有關(guān)。

以乳鼠增殖的鴨坦布蘇病毒具有血凝性，HA效價(jià)較高，為后續(xù)建立檢測(cè)鴨坦布蘇病毒抗體的血凝抑制試驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)，這將有助于對(duì)該病的實(shí)驗(yàn)室血清學(xué)診斷和免疫監(jiān)測(cè)。

4 結(jié)論

乳鼠增殖的鴨坦布蘇病毒提純后具有廣泛的血凝性，可以凝集雞、鴨、鵝、鴿和豬的紅細(xì)胞，血凝性穩(wěn)定，在4℃、室溫和37℃下均可以與鵝紅細(xì)胞凝集，以0.33%濃度的紅細(xì)胞懸液血凝為宜，反應(yīng)最適pH為6.0—6.2。

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Hemagglutinating Activity of Duck Tembusu Virus

WANG XiaoLei1, LIU YueHuan1, DUAN HuiJuan1, LIU LiXin1, YANG ZhiYuan1, ZHAO JiCheng1, PAN Jie1, LIU RuiHua1, ZHAO WenQi2, TIAN FangJie2, Lü JinBao3, LIN Jian1

(1Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine, Beijing Academy of Agricultural and ForestrySciences, Beijing 100097；2Beijing University of Agriculture, Beijing 102206;3Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010018)

【】The objective of this paper was to study the hemagglutinating activity of duck Tembusu virus (DTMUV). 【】The DTMUV was inoculated intracerebrally in the 1-3-day-old sucking mice of BALB/c in different dilution to observe the morbidity. The brains of sucking mice were collected and purified according to the referenced methods. The purified virus fluid was inactivated by suitable inactivator, followed by the inactivated inspection in 6-day-old SPF chicken embryo. The virus fluid was evaluated the hemagglutinating activity with the erythrocyte suspension of chicken, duck, goose, pigeon and swine. The concentration of the erythrocyte suspension used in the hemagglutination test was compared to select the proper concentration. The pH value of the reaction system between 6.0-7.0 and the reaction temperature including 4℃, room temperature and 37℃were compared. 【】In the 6 day after inoculation , the sucking mice inoculated with 1:10 dilution appeared severe clinical symptoms including twitch, paralysis, and most of them were in agonal stage, while the symptoms of the sucking mice inoculated with 1:50 and 1:100 dilution were slighter. The purified DTMUV fluid was pinkey and clarified. It could be inactivated by formaldehyde but not β-propiolactone that would produce lots of flocks and change the property of the fluid. The DTMUV could hemagglutinate with the erythrocyte suspension of chicken, duck, goose, pigeon and swine, and the agglutination graphics was clear and stable when the concentration of the erythrocyte suspension was 0.33%. The hemagglutinating activity of DTMUV could be showed when the reaction system pH value was 6.0-6.8, while the highest hemagglutination titer appeared during the pH 6.0-6.2. Furthermore, the hemagglutinating activity could be appeared at 4℃, room temperature and 37℃, respectively, although the time required for hemagglutination at 4℃ was much longer. 【】The DTMUV proliferated in the sucking mice of BALB/c had a broad spectrum of hemagglutinating activity that could hemagglutinate with the erythrocyte suspension of chicken, duck, goose, pigeon and swine. The hemagglutinating activity was stable and could hemagglutinate with the goose erythrocyte at 4℃, room temperature and 37℃. The suitable reaction conditions were 0.33% concentration of the erythrocyte suspension and pH 6.0-6.2 of the reaction system.

duck Tembusu virus; hemagglutinating activity;reaction conditions

10.3864/j.issn.0578-1752.2019.23.022

2019-04-23；

2019-07-01

國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2016YFD0500800）、北京市農(nóng)林科學(xué)院科技創(chuàng)新能力建設(shè)專項(xiàng)（KJCX20160401）

王小蕾，E-mail：wangxl227@126.com。

林健，E-mail：dblinjian@sina.com

（責(zé)任編輯 林鑒非）