卞書迅，韓曉蕾，袁高鵬，張利義，田義，張彩霞，叢佩華

蘋果U6啟動子的克隆及功能分析

卞書迅，韓曉蕾，袁高鵬，張利義，田義，張彩霞，叢佩華

（中國農(nóng)業(yè)科學院果樹研究所/農(nóng)業(yè)部園藝作物種質(zhì)資源利用重點實驗室/國家蘋果育種中心，遼寧興城 125100）

【】U6啟動子是CRISPR/Cas9基因組編輯載體系統(tǒng)中驅動sgRNA轉錄的重要元件，其可能存在物種特異性因子，且長度不同轉錄活性存在差異。迄今在蘋果（×）上對U6啟動子尚缺乏研究。因此，篩選出轉錄活性高且片段大小合適的蘋果U6啟動子，可以優(yōu)化蘋果CRISPR/Cas9基因編輯體系。利用軟件DNAMAN以及啟動子元件在線分析網(wǎng)站PLACE和plant CARE對蘋果U6啟動子進行比對分析；克隆并構建U6啟動子驅動螢火蟲熒光素酶基因（Firefly luciferase，）的融合表達載體，利用農(nóng)桿菌介導的瞬時轉化法分別轉染蘋果愈傷組織和本氏煙草（）葉片；通過檢測熒光素酶活性對各U6啟動子進行轉錄活性比較。蘋果基因組中共檢索到6條U6 snRNA（E-value＜3e-40），分別位于第6、7、9、10、15和17號染色體上，取5′端27 bp snRNA及其上游1 500 bp作為候選U6啟動子。序列比對結果顯示，蘋果U6啟動子與擬南芥相同，均具有兩個保守的元件，包括上游序列元件（Upstream sequence element，USE）和TATA-Like box。瞬時轉化后熒光素酶活性檢測結果顯示，10號染色體上的U6啟動子轉錄活性最高，10號染色體上5′端截短的U6啟動子（長度分別為1 500、959、275和116 bp）中275 bp的啟動子活性最強。另外，在蘋果愈傷組織中，蘋果U6啟動子的轉錄活性要顯著高于擬南芥U6啟動子。從蘋果基因組克隆6條U6啟動子，并篩選出一條轉錄活性高且片段長度較短的U6啟動子。

蘋果；U6啟動子；熒光素酶；本氏煙草；愈傷組織

0 引言

【研究意義】人工優(yōu)化后的II型CRISPR/Cas9基因編輯體系[1-2]，因操作簡單、效率高，以及脫靶效應低等優(yōu)點受到全世界的廣泛關注。目前，該系統(tǒng)已應用于多種植物[3-4]，在植物分子育種中展現(xiàn)出巨大的前景。具有雙鏈斷裂能力的Cas9蛋白和一個人工融合的小向導RNA（single guide RNA）構成了常規(guī)的CRISPR/Cas9基因編輯體系[5]，其中sgRNA起到靶向結合目的位點的功能，因此，篩選合適的啟動子來驅動sgRNA的轉錄對CRISPR/Cas9基因編輯體系發(fā)揮功能有至關重要的意義?！厩叭搜芯窟M展】U6 snRNA（Small nuclear RNA）是一種小的非編碼RNA，全長102 bp且序列非常保守[6]，受RNA聚合酶III的識別和轉錄，廣泛參與細胞核中mRNA前體（pre-mRNA）的剪接成熟[7-9]。驅動U6 snRNA轉錄的U6啟動子常作為CRISPR/Cas9基因編輯載體中驅動sgRNA轉錄的重要元件。U6啟動子在真核生物中發(fā)揮作用需具備兩個重要的序列元件USE（Upstream sequence element）和TATA-Like box[6,10]，均處于轉錄起始位點之前[11-12]。此外，U6啟動子具有明確的轉錄起始位點‘G’堿基，可以精確轉錄sgRNA[13]，但精確的起始轉錄要求轉錄起始位點周圍序列保持穩(wěn)定[14]，前人[15-16]對攜帶5′端不同長度snRNA（+1 bp，+19—+27 bp）的U6啟動子進行了轉錄活性比較，發(fā)現(xiàn)攜帶27 bp snRNA序列的U6啟動子轉錄活性較高。目前，已有多種植物的U6啟動子應用于CRISPR/Cas9基因編輯體系[17-21]，LI等[3]和FENG等[22]利用擬南芥中已克隆的啟動子驅動sgRNA的轉錄，在擬南芥中成功建立CRISPR/Cas9基因組編輯體系，并成功敲除擬南芥中和。JIANG等[17]克隆水稻U6啟動子驅動sgRNA的轉錄，并在水稻原生質(zhì)體中敲除和。JACOBS等[23]克隆了大豆U6啟動子，構建靶向敲除綠色熒光蛋白（GFP）基因的Cas9/sgRNA載體，并成功修飾9個大豆內(nèi)源基因。NISHTANI等[24]利用擬南芥U6啟動子驅動sgRNA的轉錄，成功突變了蘋果葉綠素合成相關基因。【本研究切入點】雖然多種植物的U6啟動子在CRISPR/Cas9基因編輯體系中得到應用，但U6啟動子在親緣關系較遠的物種中并不適用[6]，LI等[18]發(fā)現(xiàn)僅擬南芥U6啟動子具備保守的序列元件‘CAT框’，推測其可能是擬南芥U6啟動子的物種特異性因子。并且，不同序列長度、不同組織類型對U6啟動子的轉錄活性也存在一定影響[18,25-26]。目前，還未有蘋果內(nèi)源U6啟動子介導的CRISPR/Cas9基因編輯體系?！緮M解決的關鍵問題】對蘋果U6啟動子的轉錄活性比較，篩選到長度合適且轉錄活性高的蘋果U6啟動子，以期為進一步發(fā)展蘋果CRISPR/ Cas9基因編輯技術奠定基礎。

1 材料與方法

試驗于2018—2019年在中國農(nóng)業(yè)科學院果樹研究所/農(nóng)業(yè)部園藝作物種質(zhì)資源利用重點實驗室/蘋果育種中心實驗室進行。

1.1 試驗材料

試驗所用‘金冠’蘋果幼嫩葉片和本氏煙草種子于中國農(nóng)業(yè)科學院果樹研究所種質(zhì)資源圃及實驗室中保存；質(zhì)粒由新西蘭皇家植物和食品研究所博士惠贈；（Accession No. KR029101.1）質(zhì)粒由華南農(nóng)業(yè)大學劉耀光院士惠贈；pTOPO-Blunt Clone kit購于北京艾德萊生物科技有限公司；Prime STAR MAX高保真DNA聚合酶購于TaKaRa公司；DH5α和農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)購于莊盟生物科技有限公司；熒光素鈉鹽購于上海生工生物工程公司；測序及引物合成由天津金唯智生物公司完成。

1.2 蘋果U6啟動子克隆及表達載體構建

用擬南芥保守的102 bp U6 snRNA序列在薔薇科植物基因組數(shù)據(jù)庫GDR（http://www.rosaceae.org/ node/1）中檢索蘋果候選的U6啟動子，在基因組共檢索到超過10條U6 snRNA，選擇E-value＜3e-40的6條，分別取其5′端27 bp U6 snRNA以及上游1 500 bp作為候選蘋果U6啟動子全長序列，設計引物進行擴增（表1）。用植物基因組DNA提取試劑盒對蘋果品種‘金冠’基因組DNA進行提取，使用Prime STAR MAX高保真DNA聚合酶對蘋果U6啟動子進行擴增。電泳檢測正確的片段與pTOPO-Blunt載體連接，轉化DH5α感受態(tài)測序后進行質(zhì)粒提取。將T-MdU6-Ps和質(zhì)粒進行雙酶切鑒定（酶切位點見表1），確定正確后用T4 DNA連接酶16℃連接過夜，轉化DH5α感受態(tài)并提取質(zhì)粒。為比較蘋果和擬南芥U6啟動子的轉錄活性，本試驗以質(zhì)粒為模板克隆長度為301 bp的啟動子（表1），并連接至載體，命名為::。不同U6啟動子驅動熒光素酶基因的融合表達載體示意圖如圖1。

圖1 U6啟動子驅動LUC報告基因的融合表達載體構建

表1 本研究使用的引物序列

小寫字母為限制性酶切位點序列 Restriction site sequences are indicated by lowercase letters

1.3 MdU6啟動子序列元件分析

利用DNAMAN軟件對BLAST檢索到的6條蘋果U6啟動子進行序列比對，分析其保守的序列元件。利用PLACE和Plant CARE啟動子在線分析網(wǎng)站預測蘋果U6啟動子序列元件。

1.4 本氏煙草種植

本氏煙草種子于濕潤環(huán)境中避光發(fā)芽后移入土中（蛭石﹕腐殖土﹕田園土=1.5﹕1﹕1）。溫度23℃，光照強度12 000 lx，濕度70%，16 h光照/8 h黑暗條件下培養(yǎng)4—6周，選取第4片之后的功能葉進行注射。

1.5 本氏煙草葉片中瞬時表達分析

將鑒定正確的表達載體轉化至農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)。于液體YEB培養(yǎng)基中搖至OD600值為0.8—1.0，離心收集菌體，重懸浮于注射緩沖液（10 mmol?L-1MgCl2+200 μmol?L-1AS）中。將重懸液于28℃靜置3 h，注射本氏煙草葉片，避光過夜后于23℃光照培養(yǎng)箱進行16 h光照/8 h黑暗培養(yǎng)96 h。每片葉為一次重復，3次重復。

1.6 蘋果愈傷組織中瞬時表達分析

方法同1.5，待目的菌液搖至OD600值為0.6—0.8，離心收集菌體，重懸浮于注射緩沖液中，28℃靜置活化3 h，取狀態(tài)良好的蘋果‘王林’愈傷組織放入其中，于28℃震蕩侵染15 min，無菌水沖洗后用濾紙吸干，置于愈傷培養(yǎng)基中28℃避光共培養(yǎng)96 h，再次沖洗并吸水后放于無抗性愈傷培養(yǎng)基上，重復3次。

1.7 生物發(fā)光檢測

對瞬時轉化96 h后的植物組織的熒光信號進行檢測。將植物材料與100 mmol?L-1熒光素鈉鹽進行反應，煙草葉片浸泡3—5 min，蘋果愈傷組織浸泡10 min。通過高分辨力制冷CCD檢測系統(tǒng)進行數(shù)據(jù)采集（Tanon 5200Multi，中國），運用成像軟件對采集的數(shù)據(jù)進行分析，將數(shù)據(jù)轉換成彩色圖像。

1.8 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2016進行分析, 并采用SPSS 18.0進行單因素方差分析（＜0.05）。

2 結果

2.1 MdU6啟動子序列比對分析

基于‘金冠’蘋果基因組中的BLAST結果，對E-value＜3e-40的6條U6 snRNA進行分析，發(fā)現(xiàn)其分別位于蘋果第6、7、9、10、15和17號染色體上（表2），全長均為102 bp且序列保守，另外，其轉錄起始位點均為‘G’堿基。參照PAUL等[15]的結論，本試驗選取各U6 snRNA的5′端27 bp及其上游 1 500 bp作為蘋果U6啟動子候選序列，分別命名為MdU6-6P、MdU6-7P、MdU6-9P、MdU6-10P、MdU6- 15P和MdU6-17P。選取轉錄起始位點前后150 bp序列進行比對，發(fā)現(xiàn)其均存在-30位點的TATA-like box和-60位點的USE（5′-GTCCCACATCG-3′），且兩個元件之間的距離較為保守（圖2），其中TATA- like box與RNA聚合酶III的識別和結合相關。

表2 蘋果U6 snRNA染色體定位

圖2 MdU6啟動子序列分析

2.2 蘋果U6啟動子的克隆及鑒定

從‘金冠’基因組DNA中成功克隆出MdU6-6P、MdU6-7P、MdU6-9P、MdU6-10P、MdU6-15P和MdU6-17P，測序結果顯示序列正確。將各啟動子片段分別連入載體，并命名為::、::、::、::、::和::（圖3）。

2.3 蘋果U6啟動子轉錄活性鑒定

將各::載體通過農(nóng)桿菌介導轉化法注射于煙草葉片，并以::為陽性對照，空載體為陰性對照。96 h后進行熒光素酶活性檢測，發(fā)現(xiàn)MdU6-10P熒光信號最強，MdU6-9P僅次于MdU6-10P，而MdU6-6P、MdU6-7P、MdU6-15P以及MdU6-17P的熒光信號均較弱（圖4）。

A：M：2 kb DNA標準分子量M: DL2000 DNA marker; 1: MdU6-6P; 2: MdU6-7P; 3: MdU6-9P; 4: MdU6-10P; 5: MdU6-15P; 6: MdU6-17P: B：M：5 kb DNA標準分子量M: DL5000 DNA marker; 1: MdU6-6P::LUC; 2: MdU6-7P::LUC; 3: MdU6-9P::LUC; 4: MdU6-10P::LUC; 5: MdU6-15P::LUC; 6: MdU6-17P::LUC

6P: MdU6-6P::LUC; 7P: MdU6-7P::LUC; 9P: MdU6-9P::LUC; 10P: MdU6-10P::LUC; 15P: MdU6-15P::LUC; 17P: MdU6-17P::LUC

為比較MdU6-9P和MdU6-10P在蘋果中的轉錄活性，進一步將::和::載體瞬時轉化蘋果愈傷組織，對熒光素酶活性進行檢測并將熒光信號數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析（圖5）。發(fā)現(xiàn)::的熒光信號強度顯著高于::，證明MdU6-10P具有較高的轉錄活性，因此，選取蘋果10號染色體上的U6啟動子用于后續(xù)試驗。

不同小寫字母表示差異顯著（P＜0.05）。下同 Different lowercase letters indicate significant difference (P＜0.05). The same as below

2.4 MdU6-10P元件分析

為分析序列長度對MdU6-10P轉錄活性的影響，使用PLACE和Plant CARE啟動子元件在線分析網(wǎng)站對MdU6-10P進行元件分析，以預測的‘CAT框’為依據(jù)，對其進行5′端截短（截短長度分別為959、275和116 bp）。截短后的蘋果U6啟動子分別命名為MdU6-10-2P、MdU6-10-3P和MdU6-10-4P（圖6）。

2.5 MdU6-10-Ps的克隆及鑒定

從‘金冠’蘋果基因組中成功克隆出MdU6-10-2P、MdU6-10-3P和MdU6-10-4P，將各啟動子片段分別連至載體，將測序正確的各載體分別命名為::、::C和::（圖7）。

2.6 MdU6-10-Ps轉錄活性鑒定

利用農(nóng)桿菌介導轉化法，將::、、::和-::載體注射煙草葉片。檢測熒光素酶活性并進行分析，發(fā)現(xiàn)注射后的煙草葉片均具有較強的熒光信號，但并無顯著差異（圖8）。

圖6 5′端截短的蘋果U6啟動子示意圖

進一步在蘋果愈傷組織中驗證各長度蘋果U6啟動子轉錄活性，熒光素酶活性檢測結果與煙草葉片不同，如圖9所示。MdU6-10-Ps轉染后的愈傷組織熒光信號強度存在顯著差異（MdU6-10-3P＞MdU6-10-2P＞MdU6-10P＞MdU6-10-4P），其中，MdU6-10-3P熒光信號最強，而MdU6-10-4P熒光信號強度最弱，但仍可檢測到熒光信號。

A：M：2 Kb DNA 標準分子量M: DL2000 DNA marker; 1: MdU6-10-2P; 2: MdU6-10-3P; 3: MdU6-10-4P; B：M：5Kb DNA標準分子量M: DL5000 DNA marker; 1: MdU6-10P::LUC; 2: MdU6-10-2P::LUC; 3: MdU6-10-3P::LUC; 4: MdU6-10-4P::LUC

A: MdU6-10P::LUC; B: MdU6-10-2P::LUC; C: MdU6-10-3P::LUC; D: MdU6-10-4P::LUC

2.7 蘋果和擬南芥U6啟動子轉錄活性比較

為比較擬南芥和蘋果U6啟動子在蘋果中的轉錄活性，將::和::載體分別瞬時轉化至蘋果愈傷組織，結果如圖10所示。::轉染的愈傷組織熒光信號強度顯著高于::。說明在蘋果愈傷組織中，蘋果U6啟動子的轉錄活性高于擬南芥U6啟動子。

3 討論

RNA介導的第3代人工核酸酶技術CRISPR/Cas9在植物基因功能驗證及定向育種中展現(xiàn)出巨大的潛力，但由于序列較長（大于4 000 bp），且驅動轉錄的35S啟動子長度也有800 bp，如果構建同時編輯多個靶點的CRISPR/ Cas9基因編輯載體，序列長度將達到15 000 bp，載體過長將會對細菌轉化和植物組織轉染造成困難。因此，篩選合適的啟動子驅動sgRNA轉錄將為該體系的應用提供便利。U6啟動子常被用來驅動sgRNA的轉錄。U6啟動子屬于RNA聚合酶III識別的啟動子，III型啟動子主要是對tRNA、5S rRNA等含發(fā)夾結構的小RNA進行轉錄[8]，因此，U6啟動子在轉錄含發(fā)夾結構的sgRNA時具有天然優(yōu)勢，并且可以確保轉錄的sgRNA在細胞核中發(fā)揮功能。

圖10 AtU6-1P::LUC和MdU6-10-3P::LUC在蘋果愈傷組織中瞬時表達

此外，U6啟動子具有精確的轉錄起始位點‘G’堿基，可以有效降低CRISPR/Cas9基因編輯體系的脫靶效應。本試驗將擬南芥啟動子和蘋果6條候選U6啟動子進行序列比對，發(fā)現(xiàn)6條候選的蘋果U6啟動子的轉錄起始位點均為‘G’堿基，且均具有RNA聚合酶III發(fā)揮作用所需的上游序列元件USE和TATA-like box。由于U6 snRNA序列高度保守，通過熒光定量PCR來比較各U6啟動子的轉錄活性并不可行，因此，本試驗通過利用U6啟動子驅動報告基因表達的方式對蘋果U6啟動子的轉錄活性進行比較。目前，常用于啟動子活性檢測的報告基因有[27][28-29]和[30]，本試驗選擇為報告基因，通過瞬時轉化后檢測熒光素酶活性對各啟動子的轉錄活性進行比較，發(fā)現(xiàn)所選的6條蘋果U6啟動子均具有轉錄活性，但轉錄活性存在差異，其中MdU6-10P具有較高的轉錄活性。前人研究表明，U6啟動子在具備必要元件時即具有轉錄活性，反而序列過長可能存在一些抑制因子，使較長的U6啟動子的轉錄活性下降[18]。在番茄[21]上，U6啟動子被截取到200 bp左右時仍具有較高的活性，而在棉花[31]上，U6啟動子截取到105 bp仍具有較高的活性。KHAOULA等[32]將擬南芥U6啟動子截取到79 bp仍可應用于基因編輯體系。本研究對蘋果10號染色體上的U6啟動子進行5′端截短，并進行轉錄活性比較，發(fā)現(xiàn)在蘋果愈傷組織中，長度為275 bp的蘋果U6啟動子轉錄活性最高，表明在蘋果U6啟動子中可能存在一些抑制因子，且存在于5′末端。熒光素酶活性檢測結果還顯示，116 bp長度的U6啟動子活性雖減弱，但并未喪失轉錄活性，說明蘋果U6啟動子具有必要元件即有轉錄活性，而在序列較短時轉錄活性下降可能是因為缺少了一些增強轉錄活性的元件。至于在本氏煙草和蘋果愈傷組織中瞬時轉染展現(xiàn)出不同的結果，或許是因為某些物種特異性因子參與其中，導致U6啟動子在親緣關系較遠的物種中轉錄活性存在一定差異，這與前人得出的結論一致[6]。植物的不同組織類型可能對U6啟動子的轉錄活性也存在一定影響[18]，而蘋果不同組織類型對U6啟動子轉錄活性的影響程度還有待進一步研究。

4 結論

從蘋果品種‘金冠’中克隆獲得6條長度為1 500 bp的U6啟動子，均具有轉錄活性，其中10號染色體上的U6啟動子轉錄活性最高，將該啟動子從5′端進行截短（長度分別為959、275和116 bp），其中275 bp的啟動子轉錄活性最高。此外，在蘋果愈傷組織中，蘋果U6啟動子的轉錄活性高于擬南芥U6啟動子。

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Cloning and Functional Analysis of U6 Promoter in Apple

BIAN ShuXun, HAN XiaoLei, YUAN GaoPeng, ZHANG LiYi, TIAN Yi, ZHANG CaiXia, CONG PeiHua

(Institute of Pomology, Chinese Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Fruit Germplasm Resources Utilization, Ministry of Agriculture/National Apple Breeding Center, Xingcheng 125100, Liaoning)

【】U6 promoter is an important element for the transcription of sgRNA in the CRISPR/Cas9 genome editing system. There may be species-specific factors in U6 promoter, and the activity of U6 promoter would be altered when its length changed. So far, in apple (), the transcriptional characterization of U6 promoters has not been reported. Therefore, selecting an apple U6 promoter with high transcriptional activity and suitable fragment size would provide a basis for optimizing apple CRISPR/Cas9 gene editing technology system. 【】DNAMAN, promoter cis element online predicting website PLACE and plant CARE were used to do the comparative analysis of apple U6 promoters; U6 promoters were cloned and constructed into firefly luciferase vector; the apple callus and tobacco () leaves were transformed via-mediated transient transformation; the transcriptional activity of U6 promoter was determined according to the luciferase activity. 【】There were six alternative U6 promoters in apple genome (E-value＜3e-40), which were located on chr 6, chr 7, chr 9, chr 10, chr 15 and chr 17, respectively. 27 bp snRNA at 5′ end and its upstream 1 500 bp were selected as candidate U6 promoter. Sequence analysis results showed that the upstream sequence element (USE) and TATA-like elements were contained in six U6 promoters of apple, the same as. After transient transformation, the luciferase activity assay showed that, the U6 promoter on chromosome 10 had the highest transcriptional activity. Among all U6 promoters which were shortened at 5′ end (1 500 bp, 959 bp, 275 bp, and 116 bp) on chromosome 10, the 275 bp one had the highest transcriptional activity. In addition, compared with the Arabidopsis U6 promoter, in apple callus, the transcriptional activity of the apple U6 promoter was higher. 【】Six U6 promoters were cloned from the apple genome, and a U6 promoter with high transcriptional activity and suitable sequence fragment was obtained.

; U6 promoter; luciferase;; callus

10.3864/j.issn.0578-1752.2019.23.016

2019-07-31；

2019-09-19

國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術體系建設專項資金（CARS-27）、中國農(nóng)業(yè)科學院科技創(chuàng)新工程（CAAS-ASTIP-2016-RIP -02）、遼寧省博士科研啟動基金（20180540030）、中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務費專項（1610182019007）

卞書迅，E-mail：bb18236767941@163.com。韓曉蕾，E-mail：hanxiaolei@caas.cn。卞書迅與韓曉蕾為同等貢獻作者。

張彩霞，Tel：0429-3598135；E-mail：cxzhang-bj@163.com。通信作者叢佩華，Tel：0429-3598103；E-mail：congph@163.com

（責任編輯 趙伶俐）