多粘菌素耐藥基因mcr-1的研究進(jìn)展

王新興，翟真真，常維山，王巧云，蔣漢明

（1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，泰安 271018；2.山東第一醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，泰安 271016；3.泰安市中心醫(yī)院，泰安 271000；4.中國人民解放軍960醫(yī)院，泰安 271001；5.山東第一醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，泰安 271016）

在養(yǎng)殖業(yè)上，多粘菌素類藥物曾常常被添加到飼料中以預(yù)防動物疾病和利于動物生長[1]。mcr-1基因是由我國學(xué)者首次在人、豬及生豬肉中發(fā)現(xiàn)的，可以讓細(xì)菌對多粘菌素類藥物產(chǎn)生耐藥性的一種新基因[2]。mcr-1基因的發(fā)現(xiàn)引起了科學(xué)界對多粘菌素耐藥基因研究的關(guān)注，也引起了全球政府部門制定遏制耐藥基因流行應(yīng)急政策的舉措，同時也引發(fā)了公眾對于食品安全的隱憂。2017年4月起，中國禁止多粘菌素用于促進(jìn)禽畜生長[2-4]，隨著研究的深入，更多的變異體基因被發(fā)現(xiàn)，鑒于mcr-1基因的獨特重要性，本文就其發(fā)現(xiàn)、分布、流行、耐藥性等方面的研究進(jìn)展進(jìn)行簡要綜述，以期能夠為人類共同遏制多粘菌素類藥物耐藥基因的流行，及抗生素的安全用藥提供可參考依據(jù)[3]。

1 mcr-1基因的發(fā)現(xiàn)及其在全球的分布

mcr-1基因是一種可介導(dǎo)腸桿菌科細(xì)菌對多粘菌素類藥物產(chǎn)生耐藥的基因，這種基因廣泛存在于自然界中，在一些引發(fā)流行病的細(xì)菌中也常見[4]。

過去研究多認(rèn)為，耐抗生素的細(xì)菌可以通過染色體突變的形式進(jìn)行增殖、富集，但這種耐藥性不具備在細(xì)菌間傳播的能力，也并無基因水平的感染和傳播。當(dāng)細(xì)菌局限于染色體突變時，耐抗生素細(xì)菌的數(shù)量不穩(wěn)定，則不會大規(guī)模擴(kuò)散至其他菌株。2016年，Liu等[2]首次發(fā)表了關(guān)于mcr-1基因介導(dǎo)多粘菌素類藥物耐藥的研究成果。隨后，又有學(xué)者通過對已知的基因和基因組結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較，對該基因的傳播機制進(jìn)行了探究，發(fā)現(xiàn)mcr-1由獨立于細(xì)菌染色體的質(zhì)粒所攜帶，可以在腸道菌群間水平轉(zhuǎn)移，從而使得受體菌獲得多粘菌素耐藥性[2-5]。

除了南極洲外，全球六大洲約40個國家都有關(guān)于mcr-1的報道：在亞洲，中國、日本、老撾、越南、泰國、馬來西亞、柬埔寨、印度、韓國、巴基斯坦和阿曼蘇丹國等先后有發(fā)現(xiàn)mcr-1的證據(jù)；在歐洲，荷蘭、比利時、意大利、瑞士、丹麥、波蘭、瑞典、西班牙、葡萄牙、德國、法國、立陶宛、英國、匈牙利和挪威也有mcr-1的流行，在比利時甚至發(fā)現(xiàn)mcr-1的變異體mcr-2；在非洲，突尼斯、埃及、阿爾及利亞、尼日利亞和南非等國已有發(fā)現(xiàn)mcr-1的相關(guān)報道；北美洲的加拿大和美國，南美洲阿根廷、厄瓜多爾和巴西，以及大洋洲的澳大利亞等國家也有攜帶mcr-1菌株在禽畜甚至人中出現(xiàn)的相關(guān)報道[2]。在動物源菌株中發(fā)現(xiàn)mcr-1的比例高于染病人源菌株[5]。養(yǎng)殖場中的濫用抗生素被認(rèn)為是mcr-1基因廣泛出現(xiàn)的原因之一。

2 mcr-1基因的特征及側(cè)翼區(qū)序列的多樣性

該基因在不同細(xì)菌菌株之間的側(cè)向基因轉(zhuǎn)移方式包括兩種，由攜帶耐藥基因質(zhì)粒所介轉(zhuǎn)移或是僅mcr-1[2-4]基因及其上游序列單獨轉(zhuǎn)移[6]。Liu等[2]首次自中國大腸桿菌所攜帶的質(zhì)粒中檢測到mcr-1基因，其上游有一個插入序列ISApl1，下游有一個hp假設(shè)蛋白。隨后，Liu等[2]對多粘菌素的抗性菌株進(jìn)行大規(guī)模篩查，并對檢測到的含mcr-1的菌株進(jìn)行質(zhì)粒測序，結(jié)果表明，在不同質(zhì)粒中，mcr-1的側(cè)翼基因并不一致，而是各有差異，推測mcr-1側(cè)翼區(qū)基因可能不參與mcr-1的轉(zhuǎn)移。ISApl1基因通常存在于mcr-1的上游，基因數(shù)目以單拷貝為主，在部分已測序質(zhì)粒中也存在雙拷貝基因。完整的ISApl1基因通常包括左側(cè)反向重復(fù)序列（IRL）、右側(cè)反向重復(fù)序列（IRR)和一個轉(zhuǎn)座酶基因tnpA，大部分菌株攜帶完整的ISApl1基因，但是有部分菌株只含有部分ISApl1基因片段，提示經(jīng)歷了二次重組。mcr-1下游的hp假設(shè)單蛋白也并非普遍存在，僅存在于部分MCR-1陽性菌株中[7]。

3 mcr-1陽性細(xì)菌并非是新病菌變種

mcr-1基因是國際上最早發(fā)現(xiàn)通過質(zhì)粒來完成對于多粘菌素類藥物產(chǎn)生耐藥性的基因，能夠介導(dǎo)腸桿菌科細(xì)菌對多粘菌素產(chǎn)生耐藥，并可通過質(zhì)粒進(jìn)行水平轉(zhuǎn)移[1]。攜帶mcr-1基因的細(xì)菌不是“超級細(xì)菌”，也不是“無敵細(xì)菌”，仍可以使用對該菌敏感的多粘菌素類藥物之外的其他抗生素來殺死該菌株[8]。近年來研究發(fā)現(xiàn)mcr-1基因可以由IncI2、IncX4和IncHI2等流行性質(zhì)粒以及可移動元件，在世界各地40多個國家不同來源的腸桿菌中迅猛傳播。這些研究為深入了解mcr-1基因介導(dǎo)的黏菌素耐藥和傳播機制、全球流行分布特征奠定了基礎(chǔ)，豐富了耐藥性形成理論[9]。不同來源腸桿菌科細(xì)菌中mcr-1基因的分布流行情況、耐藥和傳播機制、基因環(huán)境臨床風(fēng)險性等方面的研究，以及后續(xù)應(yīng)對措施的采用，有助于科學(xué)應(yīng)對耐藥基因的流行。

4 mcr-1基因的耐藥機制及傳播特點

學(xué)者們在食物鏈傳播模式、環(huán)境和人群的流行現(xiàn)狀及攜帶mcr-1基因的肺炎克雷伯菌感染爆發(fā)研究等方面的研究取得了諸多成果[10]。MCR-1蛋白通過5個TMHS錨定到質(zhì)膜周質(zhì)。細(xì)菌LPS在細(xì)胞質(zhì)中被合成，然后通過ABC轉(zhuǎn)運蛋白MSBA轉(zhuǎn)化為周質(zhì)。脂多糖中的脂質(zhì)A在周質(zhì)中被磷酸乙醇胺共價修飾。被修飾的脂多糖和多粘菌素親和力降低，對多粘菌素產(chǎn)生抗性[11]。

為進(jìn)一步了解該基因的分布、多粘菌素的敏感程度以及攜帶該耐藥基因的質(zhì)粒載體特點，運用分子層面的技術(shù)手段，對2000多株來源于人類的高致病性菌株，包括血液感染致病菌大腸桿菌和肺炎克雷伯菌進(jìn)行了分析研究，從中選出具有耐多粘菌素和攜帶mcr-1基因的21株耐多粘菌素菌株。研究發(fā)現(xiàn)，耐多粘菌素mcr-1基因通過質(zhì)粒作為載體存在于自然界微生物中，以水平基因轉(zhuǎn)移方式在不同菌株間進(jìn)行質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移和基因的交換[12]。這種轉(zhuǎn)移模式不同于傳統(tǒng)遺傳物質(zhì)由親代傳到子代的轉(zhuǎn)移，傳播速度更快。這一傳播特點與幾年前在東南亞發(fā)現(xiàn)的耐抗生素基因blaNDM-1情況類似，但blaNDM-1的情況更加嚴(yán)峻，攜帶有blaNDM-1基因的微生物幾乎對絕大多數(shù)抗菌物質(zhì)不敏感，包括被認(rèn)為是細(xì)菌殺手锏的碳青霉烯類。

研究表明[13]，中國臨床血液感染患者中感染大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌MCR-1陽性菌株數(shù)量較少，發(fā)病率為零星分布。另一研究報道，18位感染產(chǎn)碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌的病人，其中7位在僅使用多粘菌素一種藥物進(jìn)行治療后，僅有一位患者康復(fù)；其余11位患者中使用多種抗生素聯(lián)合治療后，有8位患者獲得痊愈，這說明聯(lián)合使用多粘菌素效果優(yōu)于單獨使用多粘菌素，但因為該臨床試驗的樣本量不充分，還需要更多試驗結(jié)果支持結(jié)論的合理性[14]。

最近研究表明，由質(zhì)粒攜帶的mcr-1基因在基因水平上可以在大部分自然界微生物中移動。目前，世界各地報道的人源腸桿菌mcr-1基因發(fā)現(xiàn)率一般都還很低，小于2%，遠(yuǎn)低于動物源的腸桿菌的mcr-1基因攜帶率，這可能與多粘菌素對于人類細(xì)菌疾病治療使用較少有關(guān)[15]。研究發(fā)現(xiàn)MCR-1陽性菌往往與其他耐藥基因同時出現(xiàn)在一個菌株內(nèi)，由于多種耐抗生素基因同時傳播可能會讓其他抗生素對mcr-1基因也有選擇作用，單一的多粘菌素?zé)o法對細(xì)菌進(jìn)行篩選，使得mcr-1基因的擴(kuò)散問題更加嚴(yán)峻[16]。人源耐多粘菌素細(xì)菌的出現(xiàn)，可能與多粘菌素在細(xì)菌感染中的大量使用以及醫(yī)院內(nèi)耐抗生素菌株的傳播有關(guān)[22]。

5 mcr-1基因的溯源

研究發(fā)現(xiàn)，最早攜帶mcr-1的菌株是30年前我國雞體內(nèi)分離的大腸桿菌，當(dāng)時，多粘菌素才被在養(yǎng)殖業(yè)中使用。此后直到2004～2006年才開始有偶爾出現(xiàn)，2009年出現(xiàn)大爆發(fā)。研究人員對500多株產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶大腸桿菌（采自2004～2014年間，歐洲牛糞細(xì)菌分離樣品）進(jìn)行流行病學(xué)檢查，發(fā)現(xiàn)mcr-1基因出現(xiàn)概率高達(dá)21%，從已經(jīng)公開的包括宏基因組在內(nèi)的細(xì)菌基因數(shù)據(jù)中追溯該基因，發(fā)現(xiàn)1000多份來自全球各地的人類糞便樣品中，有3位中國人的腸道細(xì)菌的質(zhì)粒中發(fā)現(xiàn)了mcr-1基因[18]。此外，研究者也在24位中國人的腸道細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)mcr-1片段。據(jù)考據(jù)這部分研究成果都是2011年8月前發(fā)表，因此，采集病例至少應(yīng)該發(fā)生在2011年以前[19]。這些研究成果充分說明耐多粘菌素基因已經(jīng)在國內(nèi)小規(guī)模擴(kuò)散，且在健康人的腸道中也被發(fā)現(xiàn)，因此腸道將成為耐抗生素基因儲蓄池和質(zhì)粒水平傳播的潛在場所[20]。從300名5歲以下幼兒大便中分離出常見腸道細(xì)菌共300多株，其中有5株大腸埃希菌被檢測出抗多粘菌素，即攜帶mcr-1基因。這些耐藥攜帶者年齡都在3歲以下，最小的只有2個月，戶籍所在地都不同，從出生開始沒有接觸過任何動物，其中有2名嬰兒分別是2月齡和10月齡，尚未接觸常規(guī)食品和食源性微生物，但其腸道細(xì)菌中卻發(fā)現(xiàn)了耐多粘菌素基因，由此次調(diào)查結(jié)果推斷，該耐藥基因已經(jīng)在環(huán)境中普遍出現(xiàn)并小規(guī)模擴(kuò)散，通過細(xì)菌中的質(zhì)粒長期寄居于人體腸道內(nèi)，并可以通過生育傳播給子代[21]。有學(xué)者通過PCR技術(shù)檢測20世紀(jì)70年代到2014年間中國各地養(yǎng)殖場的雞源大腸埃希菌是否攜帶mcr-1基因時發(fā)現(xiàn)，并多數(shù)大腸桿菌為MCR-1陽性菌。

6 mcr-1的變異體及其特征

mcr-2基因在歐洲被發(fā)現(xiàn)，且僅在局部地區(qū)流行，其轉(zhuǎn)座機制以及耐藥機制尚不清楚[22]。研究人員合成了該基因及周邊序列，分析了該基因可能通過兩個IS1595類似的插入序列（ISEc69）形成的環(huán)狀中間體進(jìn)行傳播。研究發(fā)現(xiàn)其與mcr-1類似，跨膜區(qū)和底物結(jié)合位點也是mcr-2介導(dǎo)黏菌素耐藥性所必須的區(qū)域，而且兩個基因都與天然產(chǎn)黏菌素菌株的脂質(zhì)體A轉(zhuǎn)移酶非常相似，提示mcr-1和mcr-2基因都可能起源于多粘菌素。而且，mcr-1基因的變異體逐步被發(fā)現(xiàn)，從mcr-3、mcr-4基因到最新研究的變異體mcr-8，雖然在流行率和引起的耐藥性上普遍不及mcr-1，但是從生物學(xué)特征上講，都是mcr-1的變異體，可以使用多重PCR，同時檢測多個變異體耐藥基因[23]。

7 共攜帶現(xiàn)象及危害

多粘菌素被認(rèn)為是治療鮑氏不動桿菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌等革蘭陰性菌感染的最后防線；多種細(xì)菌均能攜帶mcr-1基因，其能與其他耐藥基因共存于質(zhì)粒上，產(chǎn)生多重耐藥，使臨床患者難以找到有效的治療藥物，這在全世界來說都是巨大挑戰(zhàn)[24]。

8 總結(jié)

隨著抗生素濫用，細(xì)菌耐抗生素問題日益明顯。特別是多重耐藥革蘭陰性菌的感染，對人體健康構(gòu)成極大威脅，劉健華[1]認(rèn)為，在對抗細(xì)菌的戰(zhàn)斗中，多粘菌素曾是最后一張王牌，但如今來看已經(jīng)淪為笑柄。雖然我們的研究局限于中國大陸，但是并不說明，mcr-1基因沒有成為第二個blaNDM-1的可能，演變?yōu)槭澜缧钥股啬退庪y題[25]。細(xì)菌抗藥性成為21世紀(jì)世界最為關(guān)注的的公共健康問題之一。2020年初，世界衛(wèi)生組織（WHO）發(fā)布了“未來十年內(nèi)全球健康挑戰(zhàn)清單”，其中涵蓋了13項與公共健康相關(guān)的問題。這份清單是在世界衛(wèi)生組織專家的支持下制定的，其中指出抗菌素耐藥性是一項持續(xù)而緊迫的挑戰(zhàn)，有可能使現(xiàn)代醫(yī)學(xué)退回到幾十年前的抗生素時代，對此WHO正在與國家環(huán)境、農(nóng)業(yè)和動物部門和國際當(dāng)局合作，從而減少抗生素耐藥性的威脅。而在此過程中耐藥基因的篩查成為首當(dāng)其沖的重要的研究課題。而“后抗生素時代”可能到來，狀況不容樂觀。這在引起我們擔(dān)憂的同時，也讓我們對抗生素耐藥性問題做出了預(yù)警。

綜上所述，mcr-1是位于質(zhì)粒上的可水平轉(zhuǎn)移的黏菌素耐藥基因，它引起的對多粘菌素耐藥性并不強，卻可能導(dǎo)致無藥可醫(yī)的地步，對mcr-1基因的研究豐富了人們對耐藥性機制的認(rèn)知，引起了政府社會對于防控抗生素耐藥的重視[26]。mcr-1基因新的變異體在世界范圍內(nèi)不斷被發(fā)現(xiàn)、檢測和報道，有利于人們對可移動性多粘菌素耐藥基因更好的進(jìn)行防控，也反映了人類與耐藥細(xì)菌斗爭的長期性和復(fù)雜性。細(xì)菌耐藥性是一個全人類面臨的嚴(yán)峻問題，只有全社會共同認(rèn)識、通力合作、綜合防控，才能夠有效遏制耐藥性的蔓延。