董 亮 耿宇鳳 * 劉瀧澤 陳 炎 柴 多 徐獻兵 秦 磊

（1 大連工業(yè)大學食品學院 遼寧大連 116034

2 國家海洋食品工程技術(shù)研究中心 遼寧大連 116034）

麥芽是大麥成熟種子發(fā)芽干燥后的產(chǎn)品，是啤酒生產(chǎn)過程中的中間產(chǎn)品，其風味構(gòu)成直接影響啤酒的風味[1]。研究表明，制麥過程中外源微生物尤其是鐮刀菌屬微生物對成品麥芽的理化品質(zhì)及風味均有顯著影響[2-3]。Justé等[2]認為制麥過程由2個復雜的代謝系統(tǒng)組成，一是大麥種子發(fā)芽生長的代謝作用；另一個是制麥過程中微生物對綠麥芽的侵染代謝作用。制麥過程外源微生物對麥芽的影響具有雙面性，從總體上來看負面影響大于正面影響。正面影響為微生物可以分泌一定量的水解酶，包括淀粉酶、蛋白酶以及纖維素酶等。其中，β-葡聚糖酶的活力占總酶活的50%以上。同時，微生物還可以產(chǎn)生一定量的植物生長激素，如赤霉素等[4]。制麥過程中外源微生物對麥芽質(zhì)量的負面影響主要有以下幾點：使谷物在貯藏過程中產(chǎn)生霉變；產(chǎn)生真菌毒素[5]；產(chǎn)生細菌多糖，使糖化后的麥汁過濾困難；誘發(fā)發(fā)酵過程酵母提前絮凝[6]；造成啤酒產(chǎn)生噴涌現(xiàn)象[7]。

為探討鐮刀菌屬微生物對麥芽風味的影響，在前期研究中本課題組綜合評價了禾古鐮刀菌對麥芽揮發(fā)性化合物的影響，發(fā)現(xiàn)微生物對制麥過程麥芽嗅感風味的影響方式主要體現(xiàn)在以下兩點：一是其可能帶入源自微生物菌體自身的新的嗅感風味物質(zhì)；二是其可能改變麥芽原有嗅感風味物質(zhì)的含量，或者二者兼而有之[8]。為進一步評價鐮刀菌屬微生物對麥芽風味的影響，本文選擇有大量文獻報道的、對麥芽質(zhì)量有重大影響的梨孢鐮刀菌作為考察對象，分析其自身的嗅感風味物質(zhì)構(gòu)成，探討其在制麥過程中對麥芽嗅感風味的影響及其對麥芽風味物質(zhì)含量組成的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

加麥：Metacalfe，由中糧麥芽大連有限公司饋贈。

梨孢鐮刀菌（Fusarium poae），從大麥表面分離并由實驗室保藏。

氣相色譜標準品：乙醛、異丁醛、異戊醛、2-甲基丁醛、正己醛、糠醛、正庚醛、正辛醛、反辛烯醛、壬醛、異丁醇、環(huán)戊醇、異戊醇、正戊醇、正己醇、2，3-丁二酮、2，3-戊二酮、2-庚酮、正庚酮、甲基庚烯酮、乙酸、己酸、正庚酸、乙酸乙酯、苯甲醛、2-戊基呋喃、苯乙醛，以上標準品均為色譜純級；無水乙醚及無水Na2SO4為分析純級，以上試劑均購自大連北疆化學儀器有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

固相微萃取裝置、DVB-CAR-PDMS（涂層厚度50/30μm）萃取頭，美國Supelco公司；Agilent 7890A-5975C氣質(zhì)聯(lián)用色譜儀，美國安捷倫公司；HH-8型水浴鍋，國華電器有限公司；FA1004A型分析天平，上海精天科貿(mào)有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 培養(yǎng)基的配制

1.3.1.1 PDA培養(yǎng)基（g/100mL） 馬鈴薯 20，葡萄糖2，瓊脂粉2。

1.3.1.2 肉湯培養(yǎng)基（g/100mL） 牛肉膏0.5，蛋白胨1，氯化鈉0.5。

1.3.2 梨孢鐮刀菌的培養(yǎng)及破碎 采用PDA培養(yǎng)基固體培養(yǎng)。將梨孢鐮刀菌以劃線法接種于平皿中。接種后28℃下培養(yǎng)，培養(yǎng)至3 d和5 d時分別收集各自菌體。收集菌體時使用三角耙輕輕地將培養(yǎng)基上的菌體刮下，收集菌體于-4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

菌體破碎采用液氮研磨法。將收集的菌絲體倒入研缽內(nèi)加入一定量的液氮，在低溫下研磨3次，收集菌體，置于-4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 制麥工藝 稱取大麥200 g，用自來水清洗去除表面污垢，再用3%的次氯酸鈉浸泡10min去除大麥表面微生物，后用無菌水反復清洗，直至大麥無異味為止。浸麥階段采用浸4斷8工藝（共48 h）。浸麥階段試驗組加入含有萌發(fā)好的梨孢鐮刀菌孢子液200mL，對照組加入200mL無菌水，充分混勻。發(fā)芽階段16℃下培養(yǎng)144 h，濕度控制為90%。發(fā)芽期間，每12 h翻一次麥，對照組噴灑無菌水，試驗組噴灑孢子液以保持發(fā)芽大麥表面濕潤。每培養(yǎng)24 h取樣40 g，取樣后置于-20℃冰箱中保存。

1.3.4 菌體及菌體內(nèi)溶物嗅感物質(zhì)的定性分析1.3.4.1 SPEM預處理 精確稱量收集后的菌體或菌體破碎物3.0 g裝入20mL萃取瓶中，用聚四氟乙烯襯里的硅橡膠墊密封，然后加入20%NaCl 2 mL混合均勻后，置于（18±1）℃恒溫水浴鍋平衡30min，插入裝有纖維頭的手動SPME進樣器進行采樣吸附60min，采樣完畢立即進入氣相色譜儀，在250℃解吸5min進行GC-MS分析[9]。

1.3.4.2 嗅感物質(zhì)的GC-MS檢測分析

1）色譜條件：30m×0.25mm×0.25μm HP-5MS彈性石英毛細管柱；載氣He氣，流速2mL/min；進樣口以及檢測器溫度250℃；程序升溫起始溫度40℃，保持5min，以2℃/min升至50℃，后以5℃/min升至250℃。

2）質(zhì)譜條件：EI源電子轟擊能量70 eV；離子源溫度230℃；掃描間隔0.25 s；四極桿150℃；掃描范圍40～400 u。

3）化合物的定性：化合物結(jié)構(gòu)采用計算機Nist 08譜庫檢索、色譜保留指數(shù)、人工解析比對鑒定[10]。

1.3.5 制麥過程嗅感物質(zhì)的定性分析

1.3.5.1 SPME預處理 試驗條件同1.3.4.1。

1.3.5.2 嗅感物質(zhì)的GC-MS檢測分析 試驗條件同1.3.4.2。

1.3.6 制麥過程嗅感物質(zhì)的定量分析 采用外標法對各化合物進行定量分析[11]，具體方法參考文獻[12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 梨孢鐮刀菌菌體風味的測定

為了更好地反映出揮發(fā)性物質(zhì)的來源，將梨孢鐮刀菌不同培養(yǎng)時期的菌體進行破碎，比較菌體內(nèi)外揮發(fā)物的區(qū)別。揮發(fā)性成分的總離子流色譜圖見圖1。

2.2 梨孢鐮刀菌對麥芽風味影響方式

由表1可知，整個培養(yǎng)期內(nèi)、在菌體及菌體內(nèi)部共檢測出43種揮發(fā)性物質(zhì)，其中前期檢測出35種揮發(fā)物，穩(wěn)定期檢測出21種揮發(fā)物，這些揮發(fā)物主要由9碳及其以下碳鏈的醇、酮以及芳香族類物質(zhì)所構(gòu)成，同時還有一些有機酸類和烯烴類化合物。比較不同培養(yǎng)階段的揮發(fā)物質(zhì)組成可以看出，大部分的醛、酮以及有機酸類揮發(fā)物產(chǎn)生于菌體培養(yǎng)早期，而培養(yǎng)后期菌體則釋放出一些烯烴類物質(zhì)，如：3-乙基-2-甲基-1，3-己二烯；而一些菌體特征揮發(fā)物的含量則明顯高于培養(yǎng)早期，如：異戊醇、1-辛烯-3-醇、3-辛酮等。

從培養(yǎng)后期的菌體破碎結(jié)果來看，在菌體破碎物中可以檢測到絕大部分揮發(fā)性物質(zhì)，說明在培養(yǎng)晚期、菌體揮發(fā)物主要來源于胞內(nèi)，此時菌體細胞代謝緩慢，代謝物多為分子組成復雜的次生代謝產(chǎn)物。

圖1 梨孢鐮刀菌菌體揮發(fā)性物質(zhì)的總離子流色譜圖Fig.1 Total ion current chromatogram in the analysis of volatiles of Fusarium poae

表1 原料大麥、成品麥芽與梨孢鐮刀菌菌體揮發(fā)性物質(zhì)鑒定結(jié)果Table1 Analysis of volatile compounds emitted from raw material barley，finished and Fusarium poae

（續(xù)表1）

比較不同培養(yǎng)階段的菌體及破碎后菌體內(nèi)溶物揮發(fā)物的組成發(fā)現(xiàn)，破碎后，2-甲基丁醛、異戊醛、3-甲硫基-丙醛、壬醛、苯甲醛、苯乙醛及甲硫基環(huán)己烷等揮發(fā)物的含量均明顯高于破碎前，說明這些物質(zhì)主要來源于菌體內(nèi)部。而破碎后，乙醇、異丁醇、異戊醇、1-辛烯-3-醇和3-辛酮等揮發(fā)物的含量則明顯低于破碎前，說明這些物質(zhì)主要來自于菌體外部。菌體破碎前、后，其它揮發(fā)物的含量變化不大。正戊醇、正己醇和苯乙醇只在培養(yǎng)后期未破碎的菌體中檢出，反-2-壬烯醛、3，5-辛二烯-2-酮及乙基苯只在培養(yǎng)后期破碎的菌體中檢出，并且這些揮發(fā)物的含量都相對較低。

上述結(jié)果表明，從數(shù)量上看梨孢鐮刀菌的揮發(fā)物中占原料大麥所檢出揮發(fā)物的60%以上，占麥芽揮發(fā)物總量的87.5%，基本覆蓋大部分大麥品種所鑒定出的揮發(fā)物成分。從而得知梨孢鐮刀菌對麥芽風味的影響方式是改變麥芽原有嗅感風味物質(zhì)的含量，而不是帶入源自梨孢鐮刀菌體自身的新的嗅感風味物質(zhì)。

2.3 制麥過程中梨孢鐮刀菌對麥芽風味含量的影響

制麥過程中梨孢鐮刀菌對麥芽醛類、醇類、酮類、有機酸類以及其它類嗅感物質(zhì)含量均有影響，然而，對醛類嗅感物質(zhì)的影響最大，故本文只對梨孢鐮刀菌對制麥過程中醛類嗅感物質(zhì)含量的影響作分析，含量變化見圖2。

由圖2可以看出：在制麥結(jié)束時，浸染梨孢鐮刀菌綠麥芽中的大部分醛類揮發(fā)物的含量均低于正常制麥條件下綠麥芽中醛類物質(zhì)的含量。因此，在制麥過程中梨孢鐮刀菌抑制了醛類揮發(fā)物質(zhì)的生成。雖然在發(fā)芽開始時及在發(fā)芽過程中，梨孢鐮刀菌對麥芽中醛類嗅感風味物質(zhì)的影響并無規(guī)律，但在發(fā)芽結(jié)束時與對照組（正常制麥條件）麥芽中醛類含量相比較，可以看出梨孢鐮刀菌對綠麥芽中醛類物質(zhì)的生成有抑制作用。

由圖2a所示，發(fā)芽結(jié)束時，對照組乙醛含量為2 321μg/100g DW，而此時侵染梨孢鐮刀菌試驗組的乙醛含量僅為1 162μg/100g DW，相對于對照組乙醛含量下降了50%。由圖2b可知，在制麥過程中，侵染梨孢鐮刀菌對綠麥芽中異丁醛生成的抑制作用較大，發(fā)芽結(jié)束時其含量為41.3mg/100g DW，相對于對照組異丁醛含量下降了50.6%。

圖2 制麥過程中梨孢鐮刀菌對醛類嗅感物質(zhì)的影響Fig.2 Effects of Fusarium poae aldehydes during malting process

從圖2c，2d可以看出，梨孢鐮刀菌對2-甲基丁醛和異戊醛含量的影響同樣較大。至發(fā)芽結(jié)束時，正常發(fā)芽條件下綠麥芽中2-甲基丁醛和異戊醛的含量分別為325μg/100g DW和1902μg/100g DW；浸染梨孢鐮刀菌的綠麥芽中2-甲基丁醛的含量為100μg/100g DW。發(fā)芽結(jié)束時，浸染梨孢鐮刀菌的綠麥芽中異戊醛的含量為427μg/100g DW，僅為正常發(fā)芽下異戊醛含量的22.4%。

正己醛是麥芽風味的重要組成物質(zhì)[12]。由圖2e所示，至發(fā)芽結(jié)束時，正常發(fā)芽條件下，麥芽中正己醛的含量為2 148μg/100g DW，而梨孢鐮刀菌侵染組正己醛含量為1 079μg/100g DW。

從圖2f可知，在發(fā)芽過程中，梨孢鐮刀菌對正辛醛的生成表現(xiàn)為一定的抑制作用。雖然在發(fā)芽前期，侵染梨孢鐮刀菌的綠麥芽正辛醛的含量高于正常發(fā)芽對照組，但在發(fā)芽過程后期，它對正辛醛的生成有很大的抑制作用。至發(fā)芽結(jié)束時，試驗組的正辛醛含量為220μg/100g DW，正常發(fā)芽對照組為562μg/100g DW。在發(fā)芽結(jié)束時，梨孢鐮刀菌組的正辛醛含量僅為正常發(fā)芽時的39.1%。

如圖2g所示，在發(fā)芽過程中，梨孢鐮刀菌試驗組反-2-辛烯醛的含量波動較大。從圖2h可以看出，梨孢鐮刀菌對壬醛的生成也表現(xiàn)出抑制作用。至發(fā)芽結(jié)束時，正常發(fā)芽組綠麥芽中的壬醛含量為92μg/100g DW，侵染梨孢鐮刀菌的壬醛含量為61μg/100g DW。侵染組壬醛的含量為對照組的60%左右。

綜上，造成上述現(xiàn)象的原因是在制麥后期，梨飽鐮刀菌大量的繁殖消耗了麥層中大量的氧氣，使綠麥芽處于缺氧狀態(tài)下進行厭氧呼吸，產(chǎn)生了大量的有機酸，從而導致其生理代謝降低，抑制了醛類風味代謝物的產(chǎn)生。

3 結(jié)論

本文應用固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)（SPEM/GC-MS）分析鑒定了梨孢鐮刀菌在不同培養(yǎng)時期自身所產(chǎn)生的嗅感物質(zhì)的構(gòu)成，并測定了被梨孢鐮刀菌浸染后麥芽風味物質(zhì)的含量。結(jié)果表明：梨孢鐮刀菌對麥芽風味的影響方式是改變麥芽原有嗅感風味物質(zhì)的含量，而不是帶入源自梨孢鐮刀菌體自身的新的嗅感風味物質(zhì)。其自身產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)可以基本覆蓋大部分大麥品種所能夠鑒定出的揮發(fā)性成分，對麥芽風味的形成和積累均產(chǎn)生一定影響。