缺氧條件下巨噬細胞移動抑制因子對肉雞肺動脈平滑肌細胞增殖的影響

李嘉威，任 昊，李麗芳，張瑞強，王 濤，王文魁*

（1.山西農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，山西太谷 030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學信息學院，山西太谷 030801）

肉雞肺動脈高壓綜合征（Pulmonary Hypertension Syndrome，PHS）是一種以肺動脈高壓、右心衰竭和體腔內(nèi)積聚大量淡黃色液體為主要特征的代謝性疾病[1]。PHS 嚴重影響肉雞養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展，一直以來都受到國內(nèi)外專家學者的高度重視，但迄今為止肉雞PHS 的發(fā)病機理尚有待補充。目前趨于一致的看法是體內(nèi)外諸多因素共同作用導致機體相對缺氧或絕對缺氧，缺氧刺激肺動脈血管內(nèi)皮細胞及管壁平滑肌細胞異常增殖引起肺動脈重構(gòu)，導致肺動脈平滑肌異常增殖、管腔狹窄、阻力增大，最終形成肺動脈高壓[2]。

經(jīng)由前期PHS 患病雞組織采樣研究發(fā)現(xiàn)，其肺組織中，巨噬細胞移動抑制因子（MIF）表達顯著高于同群健康肉雞[3]。MIF 在肺動脈高壓形成過程中具有極其關(guān)鍵的作用。在低氧誘導小鼠PHS 模型中，肺組織MIF的mRNA 表達和血漿MIF 蛋白水平顯著增加[4]；抑制MIF 可顯著減弱肺血管重構(gòu)、心臟肥大和右心室收縮壓。

肺動脈重構(gòu)是肉雞PHS 的重要特征之一，而血管壁平滑肌細胞異常增殖是引發(fā)血管重構(gòu)的主要原因之一[5]。肺動脈平滑肌細胞（PASMCs）的增殖受多種因素影響，如內(nèi)皮素-1、5-羥色胺以及一氧化氮等生物活性因子的調(diào)節(jié)[6]。細胞周期蛋白D1（CyclinD1）可以加速細胞由G1 期向S 期過渡，與細胞增殖關(guān)系密切。CyclinD1 能夠與細胞周期依賴性激酶（Cyclin-Dependent Kinases，CDK）中的CDK4 與CDK6 結(jié) 合并形成Cyclin-CDK[7]復合物，該復合物通過磷酸化成視網(wǎng)膜細胞蛋白（Retinoblastoma Protein，RB）使其無法與轉(zhuǎn)錄因子E2F 形成復合體，抑制E2F 活性，使E2F 發(fā)揮轉(zhuǎn)錄功能促進細胞增殖[8-10]。本試驗選用肉雞肺動脈平滑肌細胞，研究缺氧條件下肺動脈平滑肌細胞MIF、CyclinD1 表達量變化和細胞增殖水平的變化，進一步研究缺氧條件下肉雞肺動脈平滑肌細胞增殖是否符合“缺氧→MIF 分泌增加→促進CyclinD1 分泌→細胞增殖”這一猜想。

1 材料與方法

1.1 試驗動物與試劑 試驗采用14～16 日齡AA 肉雞雞胚，購自山西康牧種雞場。

主要試劑包括DMEM 高糖培養(yǎng)基（HyClone，SH30022.01）、新生牛血清（Gibco，16010-159）、P/S雙抗青鏈霉素（Solarbio，P1400）、膠原酶Ⅱ（Solarbio，C8150）、氯化鈷（Sigma，C8661）、RIPA 裂解液（Beyotime，P0013）、PMSF（Solarbio，P8340）、蛋白上樣緩沖液（Solarbio，P1015）、凝膠配置試劑盒（Solarbio，AR0138）、蛋白預染marker（BBI，C610013）、ECL高敏發(fā)光試劑盒（Bioss，AR111）、BCA 蛋白濃度測定試劑盒（Beyotime，P0010）、MTT 細胞增殖檢測試劑盒（Beyotime，C0009）、Anti-HIF-1α（BBI，D262108）、Anti-CyclinD1（Sigma，C7464）、Goat Anti-rabbit IgG（Bioss，BS-0295G），兔抗雞MIF 多克隆抗體為實驗室自制。

1.2 試驗方法

1.2.1 肉雞肺動脈平滑肌細胞分離培養(yǎng) 根據(jù)曾健瀅酶消化法[11]適當改進，選用雞胚替代成年肉雞以避免生長環(huán)境、生活規(guī)律、飲食喜好等后天因素的干擾，采用胰蛋白酶與II 型膠原酶分步消化以提高位于肺動脈中層的平滑肌細胞純度。取14～16 日齡雞蛋，用75% 酒精對蛋殼進行消毒，轉(zhuǎn)移到超凈工作臺上，無菌取出雞胚。用眼科剪刀暴露胸腔，剝離Y 形肺動脈，置于預冷的PBS 緩沖液（無鈣、鎂）中清洗，除去殘留的脂肪和結(jié)締組織。用PBS 緩沖液（無鈣、鎂）漂洗3 次后置于無菌青霉素小瓶內(nèi)并剪成直徑約1 mm 大小的組織塊，用濃度為0.25%的胰蛋白酶與0.1%的II 型膠原酶混合消化液37℃水浴靜置5 min，以等體積37℃預熱的完全培養(yǎng)基終止消化，棄上清后加入0.1% Ⅱ型膠原酶37℃水浴震蕩消化40 min 后，再次加等體積37℃預熱的完全培養(yǎng)液終止消化，移液槍吹打直至組織塊呈絮狀為止。經(jīng)200 目篩網(wǎng)過濾，濾去未消化的組織團塊，常溫1 000 r/min 離心10 min 后棄上清，加入適量完全培養(yǎng)基使得細胞重新懸浮，以1×106個/mL 接種于6 孔培養(yǎng)板，37℃、5% CO2培養(yǎng)并于24 h、48 h 更換培養(yǎng)液。

1.2.2 建立肺動脈平滑肌細胞化學缺氧模型 第2 次換液后可獲得符合造模條件的肉雞肺動脈平滑肌細胞，換不含血清的DMEM 高糖培養(yǎng)基饑餓處理，等待24 h 后給予試驗組不同濃度（400、600、800、1 000 μmol/L）CoCl2，正常組加入無血清培養(yǎng)基作對照，37℃、5%CO2培養(yǎng)24 h，摸索氯化鈷法缺氧的最佳濃度。

1.2.3 MIF 阻斷試驗 給予缺氧模型不同濃度的MIF 阻斷劑ISO-1（10、50、100、150、200 μmol/L），一組加入無血清的DMEM 高糖培養(yǎng)基做對照，37℃、5%CO2培養(yǎng)24 h。

1.2.4 蛋白免疫印跡檢測 用RIPA 裂解經(jīng)氯化鈷處理的肺動脈平滑肌細胞各試驗組與無血清培養(yǎng)基處理的對照 組，冰 浴20 min，4 ℃ 12 000 r/min 離心10 min 后取上清，測量蛋白濃度；加SDS 上樣緩沖液，100℃變性8 min，跑SDS-PAGE 膠，轉(zhuǎn)至NC 膜，5% 脫脂奶粉室溫封閉90 min，4℃搖床孵育一抗過夜，TBST 洗膜10 min×3 次，室溫搖床孵育二抗1 h，TBST 洗膜10 min×3 次，ECL 顯色。

1.2.5 細胞增殖水平檢測 在常氧對照組與缺氧模型組上均給予不同濃度的MIF 阻斷劑ISO-1（0、10、50、100 μmol/L），37℃、5% CO2培養(yǎng)24 h 后使用細胞計數(shù)方法與MTT 試劑盒，以檢測細胞增殖水平。

1.3 統(tǒng)計分析 蛋白免疫印跡檢測后使用凝膠成像系統(tǒng)拍照，用Image J 軟件計算蛋白條帶灰度值，所得數(shù)據(jù)均以平均值± 標準差表示。MIF 表達量及細胞增殖數(shù)據(jù)用SPASS 19.0 軟件進行方差分析和顯著性檢驗。P＜0.05 表示差異顯著，P＜0.01 表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 肉雞肺動脈平滑肌細胞的鏡下觀察 分離消化初時的肺動脈平滑肌細胞呈類圓形且于培養(yǎng)液中懸??；培養(yǎng)24 h 后細胞大部分貼壁，呈梭形及不規(guī)則形，有明顯立體感且具有較強折光性（圖1-A），48 h 后肺動脈平滑肌細胞狀態(tài)良好（圖1-B）。

2.2 肺動脈平滑肌細胞缺氧模型的構(gòu)建 Western boltting檢測結(jié)果顯示（圖2），與正常組相比，800 μmol/L CoCl2處理后HIF-1α表達量極顯著提高。

2.3 ISO-1 阻斷MIF 試驗 Western blotting 檢測結(jié)果顯示（圖3），與正常組相比，CoCl2組MIF 表達量極顯著提高；與CoCl2處理組相比，MIF 阻斷劑（ISO-1）處理后各組MIF 表達量均極顯著降低。

2.4 阻斷MIF 對CyclinD1 表達量的影響 Western blotting 檢測結(jié)果顯示（圖4），與正常組相比，缺氧組CyclinD1 表達量顯著提高；ISO-1（100 μmol/L）處理缺氧組后CyclinD1 表達量較單純?nèi)毖踅M極顯著降低。

2.5 阻斷MIF 對肺動脈平滑肌細胞增殖水平的影響MTT 法與細胞計數(shù)結(jié)果顯示，單純?nèi)毖蹩娠@著促進PASMCs 增殖，ISO-1 處理后可明顯降低PASMCs 增殖水平（圖5）。

3 討 論

為研究缺氧刺激對PASMCs 增殖的影響，首先需要分離和培養(yǎng)肉雞原代PASMCs。體外培養(yǎng)PASMCs有助于更加直觀地探討缺氧對PASMCs 的影響，為肉雞PHS 的病理變化研究提供試驗依據(jù)。關(guān)于培養(yǎng)肉雞原代PASMCs，文獻多以10 日齡左右雛雞為取材對象。本試驗選雞胚為取材對象主要基于以下考慮：雞胚在蛋殼內(nèi)處于密閉環(huán)境，與外界相對隔絕，不易受外界因素影響；同時也避免了雛雞因個體生活習慣和飲食喜好等后天因素對試驗結(jié)果造成的影響，使樣本的均勻度更高，結(jié)果更可靠。

缺氧是肉雞PHS 的重要誘因之一。現(xiàn)代集約化養(yǎng)殖條件下，肉雞常常處于相對缺氧或絕對缺氧的生長環(huán)境，可引起其血液學變化和肺動脈重構(gòu)，進而導致肺動脈高壓并產(chǎn)生腹水。試驗采用CoCl2化學缺氧模擬劑在上述體外培養(yǎng)肉雞原代PASMCs 的基礎上構(gòu)建缺氧模型，由于HIF-1αODD 區(qū)域的脯氨酸在脯氨酸羥化酶（Proline Hydroxylase Inhibitors，PHD）作用下產(chǎn)生的脯氨酸殘基能夠與希佩爾林-道林蛋白（von Hippel-Lindau Protein,pvHL）底物識別元件結(jié)合后快速降解HIF-1α[12]，由于PHD 依賴于亞鐵離子，故利用氧化還原性使鈷離子競爭亞鐵離子抑制PHD 活性，使HIF-1α無法與pvHL 結(jié)合，從而避免HIF-1α的降解[13]，在常氧條件下以HIF-1α為指標摸索CoCl2最佳濃度建立肉雞PASMCs 缺氧模型。試驗結(jié)果顯示，使用濃度在500～1 000 μmol/L 的CoCl2處理肺動脈平滑肌細胞時，HIF-1α表達量顯著增加，且在500～800 μmol/L 內(nèi)HIF-1α表達量逐漸增大；超過一定濃度（1 000 μmol/L）時HIF-1α表達量反而降低，因此，選取800 μmol/L 處理肉雞PASMCs，獲得了肉雞PASMCs 體外缺氧模型。

Welford 等[14]研究發(fā)現(xiàn)，小鼠MIF 啟動子區(qū)域特異性低氧反應元件（HRE）可以與HIF-1α結(jié)合，以促進自身轉(zhuǎn)錄表達。本試驗顯示，使用濃度在500～1 000 μmol/L的CoCl2處理肺動脈平滑肌細胞時，MIF 表達量顯著增加，且在500～800 μmol/L 內(nèi)MIF 表達量逐漸增大；超過一定濃度（1 000 μmol/L）時MIF 表達量反而降低，結(jié)合之前HIF-1α表達變化，在500～1 000 μmol/L CoCl2時MIF 與HIF-1α變化趨勢呈現(xiàn)高度擬合，提示肉雞MIF 基因也存在相關(guān)低氧反應元件，通過缺氧促進HIF-1α表達可調(diào)控MIF 表達量增加。

CyclinD1 作為細胞增殖的“主開關(guān)”，是左右血管平滑肌細胞增殖的關(guān)鍵因素。其受多條上游信號通路的調(diào)控，其中絲裂原活化激酶（MAPK）信號通路占有很重要的地位且與細胞增殖的調(diào)控有著密切的關(guān)系[15-16]。試驗前期PHS 患病肉雞組織采樣研究發(fā)現(xiàn)，其肺組織中MIF、CyclinD1 表達量均高于同群健康雞[3]。Qin 等[17]研究發(fā)現(xiàn)，抑制MAPK-CyclinD1 通路可以抑制原代大鼠血管平滑肌細胞的增殖。Huang 等[18]研究發(fā)現(xiàn)，敲除小鼠肝癌細胞中MIF基因可抑制CyclinD1 的表達與肝癌細胞增殖。由此可以猜測，在原代肉雞肺動脈平滑肌細胞中阻斷MIF 分泌能抑制其CyclinD1 表達，進而抑制其增殖。為了驗證這一猜想，試驗首先采用不同濃度的MIF 抑制劑ISO-1（10、50、100、150、200 μmol/L）對MIF 進行阻斷，篩選結(jié)果顯示，與正常組相比，CoCl2模擬缺氧組MIF 表達量顯著提高；與CoCl2模擬缺氧組相比，在使用不同濃度的ISO-1 后，各組MIF 表達量均顯著降低，選用中間濃度（100 μmol/L）ISO-1 進行后續(xù)試驗；結(jié)果與正常組相比，缺氧組CyclinD1 表達量顯著提高；與單純?nèi)毖踅M相比，缺氧+ISO-1 處理組CyclinD1 表達量極顯著降低。缺氧組PASMCs 的增殖對比常氧組顯著提升，ISO-1 阻斷MIF 后PASMCs 增殖對比缺氧組顯著降低。

本試驗摸索出肉雞PASMCs 體外培養(yǎng)的最佳條件，在此基礎上以HIF-1α為標志建立肺動脈平滑肌缺氧模型，利用此模型研究了MIF 與CyclinD1 的相關(guān)性，提示缺氧條件下肉雞PASMCs 分泌MIF 增多，MIF 通過促進CyclinD1 的表達，引起PASMCs 的增殖。