孫小琴，孫 昕，李鵬飛，劉興社，成智文，李 青

(1.西安建筑科技大學 陜西省環(huán)境工程重點實驗室,教育部西北水資源和環(huán)境生態(tài)重點實驗室，西安 710055； 2.咸陽陶瓷研究設計院有限公司，陜西 咸陽 712000)

隨著化石能源的日益枯竭和人們對環(huán)境保護的不斷重視，生物柴油作為新型的清潔能源，受到廣泛關注[1-2]。小球藻油脂含量較高，生長速度快，是一種理想的能源微藻[3-4]。高昂的生產(chǎn)成本是微藻產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的一大阻礙，而提高油脂產(chǎn)量是有效的解決途徑之一[5]。有研究表明，脅迫生長可誘導微藻以中性脂質或多糖的形式積累能量[6]，而紫外線脅迫被視為是一種良好的處理方式，其操作簡單、突變率高，尤其在高脂微藻的培育中具有污染少、輻射劑量改變靈活、誘導快速等優(yōu)點[7-8]。葉麗等[9]用紫外線輻射三角褐指藻，得到總脂含量高達36.66%的突變藻株；Liu等[10]利用紫外線輻射小球藻，突變藻株的油脂含量增加了21.97%。然而在紫外誘變育種中，優(yōu)良性狀藻株的篩選過程耗時長，篩選后的藻株存在不穩(wěn)定性，這對能源微藻的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)造成一定的阻礙，如能省去復雜的篩選程序，利用紫外線直接對藻液進行輻射，既可提高微藻的油脂產(chǎn)量，又能縮短培育時間，將明顯發(fā)揮紫外誘變的優(yōu)勢，但目前大多研究仍停留在利用誘變篩選突變株這一層次上。本文創(chuàng)新利用紫外誘變的優(yōu)勢，避免了長時間的篩選過程，以期突破微藻產(chǎn)業(yè)化的瓶頸。

本文采用紫外線直接對小球藻藻液進行輻射，通過測定不同紫外輻射劑量下小球藻的生物量、葉綠素熒光參數(shù)、油脂含量以及脂肪酸組成及含量，確定最佳紫外輻射劑量，并利用熒光定量PCR檢測與油脂合成相關基因的表達情況，分析紫外輻射促進微藻產(chǎn)油的可能生化途徑，以期為高產(chǎn)油微藻的培育提供理論基礎，為微藻的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供應用依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

小球藻，購于中國科學院武漢水生生物研究所淡水藻種庫。BG11培養(yǎng)基，主要成分如下：(NH4)3C6H5O7，0.006 g/L；C6H7O8，0.006 g/L；EDTA-MgNa2，0.001 g/L；NaNO3，1.5 g/L；K2HPO4，0.039 g/L；MgSO4·7H2O，0.075 g/L；CaCl2·2H2O，0.036 g/L；Na2CO3，0.02 g/L；H3BO4，2.86 mg/L；MnCl2·4H2O，1.81 mg/L；ZnSO4·7H2O，0.222 mg/L；NaMoO4·2H2O，0.391 mg/L；CuSO4·5H2O，0.079 mg/L；Co(NO3)·6H2O，0.049 mg/L。

光照培養(yǎng)箱，SW-CJ-1D凈化工作臺，UVC-254型紫外輻照度計，UV2600型紫外可見分光光度計，真空冷凍干燥機，M系列IMAGING-PAM調(diào)制葉綠素熒光成像系統(tǒng)，7890A/7000B型氣相色譜質譜聯(lián)用儀，CFX96TM實時定量PCR儀。

1.2 實驗方法

1.2.1 小球藻的培養(yǎng)

采用BG11培養(yǎng)基接種小球藻獲得小球藻藻液。

將裝有小球藻藻液的500 mL三角錐形瓶，用無菌膜封閉瓶口，置于恒溫光照培養(yǎng)箱中，在平均光照強度70.7 μmol/(m·s)、光照周期12L/12D、培養(yǎng)溫度(25±1)℃條件下，采用半連續(xù)培養(yǎng)模式培養(yǎng)。每天隨機調(diào)換錐形瓶的位置并搖動3～4次，定時取樣進行分析。

1.2.2 紫外輻射誘變

實驗用紫外燈管功率20 W，發(fā)射波長254 nm，實驗前將紫外燈打開照射30 min以穩(wěn)定光強并殺菌。取200 mL小球藻藻液于18 cm玻璃培養(yǎng)皿中，置于磁力攪拌器上，保證紫外線能均勻輻射藻液。通過改變紫外輻射時間設置5個輻射劑量梯度(0、20、40、60、80 mJ/cm2)，每個梯度設2個平行樣。藻液經(jīng)紫外輻射后用錫紙包裹培養(yǎng)皿置于恒溫光照培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)24 h避免“光復活”[11]，再轉移至500 mL三角錐形瓶中按1.2.1條件繼續(xù)進行培養(yǎng)。

本實驗中藻液與紫外燈的垂直距離為30 cm，通過紫外輻照度計測量培養(yǎng)皿圓心處和圓周4個切點處藻液表面處的紫外輻射強度，得到平均輻射強度(I)為0.27 mW/cm2，根據(jù)下式[12]計算輻射時間。

D=I×t

式中：D為輻射劑量，mJ/cm2；t為輻射時間，s。

1.2.3 生物量的測定

光密度法：取一定量的藻液于1 cm石英比色皿中，采用紫外可見分光光度計測定680 nm處的吸光度(OD)。

稱重法：將藻液在10 000 r/min、4℃下離心10 min，并用蒸餾水洗滌2～3次，除去原培養(yǎng)基中的代謝產(chǎn)物等雜質，再用冷凍干燥機獲得干燥藻粉，稱取藻粉質量。

1.2.4 葉綠素熒光參數(shù)的測定

采用調(diào)制葉綠素熒光成像系統(tǒng)測定小球藻的葉綠素熒光參數(shù)Fv/Fm、Y(Ⅱ)，檢測前將藻液暗適應5 min。

1.2.5 油脂含量的測定

采用改進的Bligh-Dyer法[13]測定油脂含量。取10 mg凍干的藻粉，加入1.6 mL蒸餾水、4 mL甲醇、2 mL氯仿，用渦旋振蕩器將混合液混勻振蕩2 min，超聲破碎5 min，再加入2 mL氯仿繼續(xù)渦旋振蕩1 min，加入2 mL蒸餾水渦旋振蕩1 min，使最終的氯仿、甲醇、蒸餾水體積比為1∶1∶0.9，再次離心，靜置分層，取下層氯仿相，再向原管中加入氯仿繼續(xù)萃取1次，合并氯仿相并在氮氣下吹脫，得到小球藻油，稱重計算小球藻油脂含量。

1.2.6 熒光定量PCR的測定

本次測定的目的基因是accD、gapA、Me、Pk。gapA是GADPH(甘油醛-3-磷酸脫氫酶)的編碼基因，GADPH是Calvin循環(huán)的重要參與酶，與碳代謝有密切聯(lián)系。accD是ACCase(乙酰輔酶A羧化酶)的編碼基因，在自養(yǎng)條件下，其轉錄量與油脂積累量呈正相關[11]。Me是ME(蘋果酸酶)的編碼基因，ME可將蘋果酸催化為丙酮酸鹽，并產(chǎn)生NADPH(還原型輔酶Ⅱ)，NADPH可以作為還原力和能量，對脂肪酸的生物合成過程是必要的。Pk是PK(丙酮酸激酶)的編碼基因，PK活性降低時，糖酵解途徑受阻，對油脂的積累產(chǎn)生一定的影響[13]。

具體測定按如下流程進行操作：①用Trizol法提取總RNA。②反轉錄。反轉錄體系見表1，添加試劑成分見表2。③引物設計。設計內(nèi)參基因18SRNA和目的基因的引物[14]，如表3所示。④熒光定量PCR。按表4配制qPCR反應體系，將樣品放入CFX96TM實時定量PCR儀中檢測，設置檢測參數(shù)為95℃預變性5 min，95℃變性10 s，60℃退火30 s，循環(huán)54次。

表1 反轉錄體系

表2 添加試劑成分

表3 內(nèi)參基因和目的基因的引物序列

表4 qPCR反應體系

1.2.7 小球藻油脂肪酸組成分析

將抽提的小球藻油用NaOH-CH3OH溶液皂化，加入30%的二氧化碳乙醚絡合物甲醇溶液進行酯化，再加入2 mL正己烷振蕩5 min，靜置后取上層的正己烷液上機分析[15]。用氣相色譜質譜聯(lián)用儀測定脂肪酸的組成和含量。GC條件：DB-23石英毛細管色譜柱(60 m×0.25 mm×250 μm)；進樣量1 μL；分流比50∶1；進樣口溫度210℃；氦氣流速1 mL/min；升溫程序為80℃保持5 min，以4℃/min的速度升到290℃，并在290℃條件下保持5 min。MS條件：電子能量70 eV；四極桿溫度150℃；離子源溫度250℃；溶劑延遲2 min。質譜圖利用NIST標準譜庫進行檢索，采用面積歸一化法定量。

2 結果與分析

2.1 不同紫外輻射劑量下的小球藻藻液的吸光度

圖1為不同紫外輻射劑量下小球藻藻液吸光度隨培養(yǎng)時間的變化情況。

圖1 不同紫外輻射劑量下小球藻藻液吸光度隨培養(yǎng)時間的變化

由圖1可見，經(jīng)過紫外輻射后，小球藻的生長受到了不同程度的抑制，輻射劑量越大，抑制作用越強。20、40 mJ/cm2劑量對小球藻的抑制作用較弱，2 d后小球藻即可恢復生長，生長速度與對照組(紫外輻射劑量為0 mJ/cm2，下同)基本一致。60、80 mJ/cm2劑量對小球藻的抑制作用較強，需經(jīng)4 d恢復生長，生長速度慢于對照組。從22 d開始，小球藻的生長速度變慢，進入穩(wěn)定期，劑量為20、40 mJ/cm2的小球藻吸光度與對照組的基本相等，劑量為60、80 mJ/cm2的小球藻吸光度明顯低于對照組的。Liu等[10]用紫外誘變小球藻，突變藻株的生物量比原始藻株提高了7.6%。說明在適宜的紫外輻射條件下，微藻的生長并不會受到抑制。

2.2 不同紫外輻射劑量下小球藻的葉綠素熒光參數(shù)

2.2.1Fv/Fm

Fv/Fm反映植物潛在的最大光合作用能力。不同紫外輻射劑量下小球藻的Fv/Fm隨培養(yǎng)時間的變化情況見圖2。

圖2 不同紫外輻射劑量下小球藻Fv/Fm隨培養(yǎng)時間的變化

由圖2可見，紫外輻射劑量越大，小球藻的Fv/Fm值越低，說明紫外輻射使小球藻的光合作用能力降低，降低程度隨紫外輻射劑量增大而增強。不同紫外輻射劑量下的Fv/Fm在一定培養(yǎng)時間內(nèi)會恢復到相對穩(wěn)定值，劑量越大，恢復時間越長，最終的穩(wěn)定值越低。這可能是小球藻的光系統(tǒng)啟動了各種熱耗散形式的光保護途徑，受損的光系統(tǒng)逐漸修復，但修復能力隨紫外輻射劑量的增加而削弱。20、40 mJ/cm2劑量下的最高Fv/Fm值分別為0.593、0.588，與對照組的相當，表明其光合性能良好。而60、80 mJ/cm2劑量下的Fv/Fm值較對照組的低，說明其光合性能變差。

2.2.2Y(Ⅱ)

Y(Ⅱ)表征光系統(tǒng)的實際光能捕獲效率，是植物光合能力的重要衡量指標[16]。不同紫外輻射劑量下小球藻的Y(Ⅱ)隨培養(yǎng)時間的變化情況見圖3。

圖3 不同紫外輻射劑量下小球藻Y(Ⅱ)隨培養(yǎng)時間的變化

由圖3可見，在3～5 d，不同紫外輻射劑量下小球藻的Y(Ⅱ)不同程度地降低，劑量越大，Y(Ⅱ)值越低，說明光系統(tǒng)PSⅡ因紫外輻射而受到損傷，光能轉化效率降低，且PSⅡ的損傷程度隨紫外輻射劑量的增加而增大。PSⅡ的損傷可能表現(xiàn)在兩方面：一是光合器官受到損傷，光系統(tǒng)中的捕光色素蛋白復合體自身解體甚至失去捕光功能[17]；二是紫外線導致PSⅡ核心復合體的反應中心D1蛋白甚至D2蛋白受損，為避免這種損傷，藻類會相應地提高D1蛋白的周轉速度以促進自我修復[18]。因此，在5～11 d，Y(Ⅱ)逐漸升高，不同劑量間的差異縮小。在11～23 d，Y(Ⅱ)基本達到穩(wěn)定，23 d開始，小球藻進入生長后期，光化學反應不如對數(shù)生長期活躍，Y(Ⅱ)逐漸降低。與Fv/Fm 的變化特性類似，劑量低于40 mJ/cm2下的Y(Ⅱ)最終穩(wěn)定在較高值，20、40 mJ/cm2劑量下的Y(Ⅱ)最高值分別為0.598、0.594，與對照組的相當，表明光系統(tǒng)的光能捕獲效率高；劑量高于40 mJ/cm2下的Y(Ⅱ)則相反。

2.3 不同紫外輻射劑量下小球藻的干重與產(chǎn)油情況

對不同紫外輻射劑量下的小球藻培養(yǎng)28 d，測定其干重和產(chǎn)油情況，結果見圖4、圖5。

圖4 不同紫外輻射劑量下小球藻的干重與油脂含量

圖5 不同紫外輻射劑量下小球藻的油脂產(chǎn)量

由圖4可見，20、40 mJ/cm2劑量下小球藻的干重分別為530、515 mg/L，與對照組相差不大，其他劑量下的干重則小于對照組。20、40 mJ/cm2劑量下的油脂含量均有提升，其中40 mJ/cm2劑量下的油脂含量最高，為46%，比對照組提高了39.40%，之后隨著紫外輻射劑量的增大，小球藻的油脂含量下降。由圖5可見，與對照組相比，20～40 mJ/cm2劑量下的油脂產(chǎn)量均有提高，其中40 mJ/cm2劑量下油脂產(chǎn)量最高，達237 mg/L，比對照組提高了39.22%，之后隨著紫外輻射劑量的增大，小球藻的油脂產(chǎn)量下降。Sharma等[19]利用適宜的輻射劑量對小球藻進行紫外誘變，得到突變藻株的總脂含量幾乎加倍。這些研究結果說明適宜的紫外輻射可在一定程度上提高微藻的產(chǎn)油能力，可能是紫外線輻射導致小球藻內(nèi)與油脂代謝相關的基因或其調(diào)控序列發(fā)生突變，基因產(chǎn)物的活性發(fā)生變化，從而引起油脂含量的變化[20]。

2.4 不同紫外輻射劑量下小球藻的熒光定量PCR結果

圖6顯示了不同紫外輻射劑量下小球藻目的基因的相對表達情況(以對照組的基因表達量為標準)。

圖6 不同紫外輻射劑量下小球藻目的基因的相對表達量

由圖6可見：各輻射劑量下accD、gapA的相對表達量均提高，其中40 mJ/cm2劑量的提升幅度最大，分別提高了約2.5倍和5倍；除了80 mJ/cm2劑量下Me的相對表達量降低，40 mJ/cm2劑量下Me的相對表達量基本變化不大外，其他劑量下的Me相對表達量均提高，其中60 mJ/cm2劑量的提升幅度最大，提高了約1倍；除40 mJ/cm2劑量下Pk的相對表達量未降低外，其他劑量下Pk的相對表達量均有較大幅度的降低。理論而言，小球藻的油脂積累可能與ACCase有關，ACCase所催化的反應是脂肪酸合成的第一步，在脂肪酸的合成與代謝中發(fā)揮重要作用[21]，accD表達量的提高會促進藻體內(nèi)脂肪酸的合成。Calvin循環(huán)為自養(yǎng)藻類提供合成油脂的碳源，相關酶的作用可能與油脂積累密切相關，GAPDH是Calvin循環(huán)的作用酶之一，gapA表達量的提高會促進更多碳源流向油脂合成。與Calvin循環(huán)密切相關的戊酮磷酸途徑，可產(chǎn)生大量NADPH，為油脂合成提供能量，所以Me表達量的提高可能使小球藻的油脂合成具備更多的能量，有研究表明Me與脂質積累量顯著相關，其表達情況會影響脂質的積累[22]。PK是將磷酸烯醇式丙酮酸轉化為丙酮酸的酶，丙酮酸的一部分進行發(fā)酵產(chǎn)生NAD+，一部分轉化為乙酰輔酶A，這兩種物質均與油脂合成密切相關，因此Pk表達量的提高可能會促進油脂合成。在40 mJ/cm2劑量下，accD和gapA的相對表達量呈較大幅度提高，Me和Pk的相對表達量基本不變，說明accD和gapA表達量的提高是促進油脂積累的主要驅動力。雖然80 mJ/cm2劑量下accD和gapA的表達量有所提升，但Me和Pk的表達量均下降，說明Me和Pk表達量的降低可能對油脂的積累產(chǎn)生一定的抑制。

2.5 不同紫外輻射劑量下小球藻油的脂肪酸組成和含量(見表5)

表5 不同紫外輻射劑量下小球藻油的脂肪酸組成和含量

由表5可見，共檢測出10種主要脂肪酸，包括5種飽和脂肪酸(SFA)、2種單不飽和脂肪酸(MUFA)、3種多不飽和脂肪酸(PUFA)。小球藻油主要的脂肪酸為棕櫚酸(C16∶0)、棕櫚油酸(C16∶1)、油酸(C18∶1)、亞油酸(C18∶2)和亞麻酸(C18∶3)。其中，C16∶1和C18∶1變化較大，與對照組相比，20～60 mJ/cm2劑量下的C16∶1和C18∶1含量明顯增加，40 mJ/cm2劑量下的提升幅度最大，MUFA含量達到40.17%，比對照組提高了16.5%。而MUFA更有利于生物柴油的生產(chǎn)，表明該劑量條件適合培育制備生物柴油的小球藻，在實際應用方面具有較高的價值。

3 結 論

綜合比較小球藻液紫外輻射后小球藻的生長、光合性能、油脂積累以及脂肪酸含量，確定40 mJ/cm2為最佳紫外輻射劑量。在40 mJ/cm2劑量下，小球藻的生長情況及光合性能較好，生物量與對照組(未進行紫外輻射)基本相等，葉綠素熒光參數(shù)降低幅度較小，且在很短的時間內(nèi)即可恢復，最終的Fv/Fm，Y(Ⅱ)與對照組的熒光參數(shù)值接近。另外，輻射劑量為40 mJ/cm2的小球藻產(chǎn)油性能最佳，相對于對照組，油脂含量和油脂產(chǎn)量分別提高了39.40%和39.22%；與油脂合成相關的accD和gapA基因的相對表達量分別提高了約2.5倍和5倍，Me和Pk基因的相對表達量基本不變。而且，紫外輻射劑量對小球藻油脂肪酸組成及含量有一定影響，輻射劑量為40 mJ/cm2的小球藻油脂肪酸組成中的MUFA含量有較大幅度的提升，含量達到40.17%，比對照組提高了16.5%。