二烯丙基二硫醚對(duì)單增李斯特菌毒力基因表達(dá)的影響

魏麗娜 吳虹燕 李鑫鑫 郝洪順 萬(wàn)銹琳 高美玲 侯紅漫 張公亮 *

（1 大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院 遼寧大連 116034

2 大連工業(yè)大學(xué)紡織與材料工程學(xué)院 遼寧大連 116034

3 遼寧省水產(chǎn)品加工質(zhì)量安全與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 遼寧大連 116034）

硫醚類(lèi)香料在中國(guó)具有悠久的歷史，它除了賦予食品在感官上的特殊風(fēng)味及生理保健功能外，還具有抗菌消炎，提高機(jī)體免疫力，預(yù)防和治療心血管疾病等保健及藥理作用[1-2]。二烯丙基二硫醚（Diallyl disulfide，DADS）是一種典型的在大蒜中含量較高的一種硫醚類(lèi)香料。它含有兩個(gè)原子，可溶于脂類(lèi)，具有揮發(fā)性等特性[3]。

單核細(xì)胞增生性李斯特菌（Listeria monocytogenes，LM）簡(jiǎn)稱(chēng)單增李斯特菌，屬于革蘭陽(yáng)性無(wú)芽孢桿菌李斯特菌屬，是四大食源性致病菌之一[4-5]。該菌容易污染食物，引起食物中毒，臨床表現(xiàn)為人和動(dòng)物腦膜炎、敗血癥及孕婦流產(chǎn)等[6-7]。近年來(lái)，有關(guān)該菌引起的食物中毒事件頻頻發(fā)生，并造成了人員死亡，引起世界各國(guó)高度關(guān)注[8-11]。內(nèi)化素A（inlA）是單增李斯特菌特有的毒力侵襲因子，由inlA基因編碼。hlyA基因是單增李斯特菌的毒力標(biāo)志基因，它所編碼的溶血素（listeriolysion O，LLO）是單增李斯特菌的主要毒力因子。轉(zhuǎn)錄活化因子（PrfA）由prfA基因編碼，在單增李斯特菌感染的過(guò)程中，對(duì)許多毒力因子均有正調(diào)控作用[12-13]。

近年來(lái)針對(duì)DADS的研究，多側(cè)重于抗癌方面，比如在一些細(xì)胞（結(jié)腸、乳腺等細(xì)胞）癌變?cè)缙诤屯砥陔A段可以起到抑制作用。Altonsy等[14]發(fā)現(xiàn)DADS可通過(guò)干擾細(xì)胞循環(huán)生長(zhǎng)周期的方式，誘導(dǎo)MCF-7乳腺癌細(xì)胞凋亡。Nagaraj等[15]研究表明DADS通過(guò)影響B(tài)ax的線(xiàn)粒體途徑而導(dǎo)致人腫瘤細(xì)胞半胱天冬酶依賴(lài)性凋亡。然而，有關(guān)DADS等硫醚類(lèi)香料對(duì)食源性致病菌的研究相對(duì)較少。張公亮等[16]考察了DADS等8種常見(jiàn)的硫醚類(lèi)香料對(duì)大腸桿菌等的抑菌活性，結(jié)果表明：8種硫醚類(lèi)香料均具有抑菌效果。前期研究已明確硫醚類(lèi)香料對(duì)常見(jiàn)的致病菌具有良好的抑菌作用，對(duì)單增李斯特菌的抑菌機(jī)理方面的研究尚不明確。本文選用硫醚類(lèi)香料DADS為研究對(duì)象，以單增李斯特菌為供試菌株，采用RT-qPCR法研究該香料對(duì)毒力基因inlA、hlyA、prfA表達(dá)的影響。為進(jìn)一步探索外援物質(zhì)對(duì)單增李斯特菌毒力基因的調(diào)控提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）、瓊脂粉等，博諾試劑公司；RNAprep pure培養(yǎng)細(xì)胞/細(xì)菌總RNA提取試劑盒，天根生化科技（北京）有限公司；SYBRPremix Ex TaqTM、Primer ScriptTMRT reagent Kit With gDNA Eraser（Perfect Real Time）等，寶生物工程（大連）有限公司；RNase-free Water、DEPC水、熒光定量PCR引物等，生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

01J2003-04型高壓滅菌鍋，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；ZHWY-100B型恒溫培養(yǎng)振蕩器、ZHWY-2102C型雙層小容量全溫度恒溫?fù)u床，上海智城分析儀器制造有限公司；DRP-9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；UV-1750型紫外分光光度計(jì)，日本島津儀器有限公司；MyiQTM2型熒光定量PCR儀，美國(guó)BIO-RAD公司。

表1 DADS的結(jié)構(gòu)Table1 The structure of DADS

1.3 抑菌劑的制備和菌種活化

將DADS進(jìn)行稀釋?zhuān)凑展角蟪鏊柙撓懔系捏w積后進(jìn)行半數(shù)稀釋?zhuān)芊鈧溆?。?jì)算方法見(jiàn)公式（1）：

式中，n——摩爾質(zhì)量，mol/L；M——分子質(zhì)量；m——原液質(zhì)量，g；ρ——密度，g/mL；V1——加入硫醚類(lèi)香料的體積，L；V總-V1——加入溶劑的體積，L。

將-80℃凍存的供試菌取出，吸取50μL菌液至5mL的TSB液體培養(yǎng)基中，37℃，150 r/min搖床培養(yǎng)24 h。將該菌液劃平板，37℃下恒溫過(guò)夜培養(yǎng)。挑取單菌落至液體培養(yǎng)基，搖床培養(yǎng)至菌體終濃度為2×109CFU/mL，備用。

1.4 最低抑菌濃度（MIC）的測(cè)定

參照王鑫[17]的方法，采用微量肉湯稀釋法測(cè)定DADS對(duì)單增李斯特菌的最低抑菌濃度。用DMSO將硫醚類(lèi)香料配成初始濃度為8mmol/L儲(chǔ)備液。用液體培養(yǎng)基將硫醚類(lèi)香料儲(chǔ)備液稀釋至終濃度為4，2，2mmol/L，直至62.5 μmol/L。無(wú)菌條件下，將100μL不同濃度的硫醚類(lèi)香料對(duì)應(yīng)加在無(wú)菌的96孔板中，加菌液至每孔細(xì)菌終濃度達(dá)5×104CFU/mL。以TSB液體培養(yǎng)基作陰性對(duì)照，TSB液體培養(yǎng)基及5μL菌懸液作生長(zhǎng)對(duì)照孔。每個(gè)濃度3組平行，結(jié)果取平均值。接種后的96孔板置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后測(cè)定OD600，以細(xì)菌生長(zhǎng)的為“+”，無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)的為“-”來(lái)確定MIC。

1.5 DADS作用下單增李斯特菌生長(zhǎng)曲線(xiàn)的測(cè)定

參考Qiu等[18]的方法。根據(jù)已測(cè)定出的MIC的結(jié)果將DADS稀釋成適當(dāng)亞抑菌濃度，吸取菌液1mL于99mL TSB液體培養(yǎng)基，再分別添加30μL不同濃度的DADS，以添加等體積的DMSO作為對(duì)照組，搖床培養(yǎng)12 h，每隔4 h，利用紫外分光光度計(jì)測(cè)定菌液OD600值，以O(shè)D600值為縱坐標(biāo)，時(shí)間t為橫坐標(biāo)，繪制試驗(yàn)組和對(duì)照組生長(zhǎng)曲線(xiàn)。

1.6 RNA的提取

RNA的提取參考Upadhyay等和Anne等[19-20]的方法。在TSB培養(yǎng)基中分別添加不同亞抑菌濃度的DADS，以未添加DADS的作為對(duì)照組，培養(yǎng)12 h。吸取1 mL菌液于1.5 mL無(wú)菌離心管中，12 000 r/min下4℃離心2min后棄上清。向菌體沉淀物中添加500μL的DEPC水以去除液體培養(yǎng)基的干擾，后續(xù)操作按照細(xì)菌總RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行，除雜后反轉(zhuǎn)錄為cDNA。

1.7 RT-qPCR法研究DADS對(duì)單增李斯特菌毒力基因表達(dá)的影響

以對(duì)照組的cDNA為模板，采用RT-qPCR法對(duì)inlA、hlyA、prfA引物進(jìn)行特異性驗(yàn)證。具體的引物片段如下表2所示。不同試驗(yàn)組的cDNA為模板，利用方程2-⊿⊿Ct計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量[23-24]。

表2 本研究所用引物Table2 List of primers used in this study

2 結(jié)果與分析

2.1 DADS對(duì)單增李斯特菌MIC的測(cè)定

表3為DADS對(duì)單增李斯特菌生長(zhǎng)影響的結(jié)果：當(dāng)濃度≥2mmol/L時(shí)，無(wú)單增李斯特菌生長(zhǎng)跡象。當(dāng)濃度低于2mmol/L時(shí)，單增李斯特菌仍可以生長(zhǎng)。因此DADS對(duì)單增李斯特菌的MIC為2 mmol/L。Upadhyay等[19]研究表明，植源性成分反式肉桂醛、香芹酚、麝香草酚作用于單增李斯特菌的MIC 分別為0.90，0.75，0.60mmol/L，抑菌作用顯著。同樣Rohani等[25]研究發(fā)現(xiàn)大蒜精油對(duì)單增李斯特菌的MIC為0.10mg/L。

表3 DADS對(duì)單增李斯特菌MIC的結(jié)果Table3 Results of DADS on MIC of Listeria monocytogenes

2.2 DADS對(duì)單增李斯特菌生長(zhǎng)曲線(xiàn)的影響

根據(jù)上一步的MIC結(jié)果，選取不同的亞抑菌濃度的DADS作用于單增李斯特菌，進(jìn)行生長(zhǎng)曲線(xiàn)的繪制。繪制結(jié)果如圖1所示。MIC～1/16MIC的試驗(yàn)組，不同培養(yǎng)時(shí)間，對(duì)單增李斯特菌的抑制程度不同。當(dāng)DADS濃度為MIC時(shí)，DADS完全抑制了單增李斯特菌的生長(zhǎng)。當(dāng)濃度為1/2MIC～1/16MIC時(shí)，DADS對(duì)單增李斯特菌的抑制作用呈現(xiàn)明顯的濃度依賴(lài)性。與對(duì)照組相比，當(dāng)1/2MIC組在0～9 h的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期過(guò)程中，DADS明顯地抑制了單增李斯特菌的生長(zhǎng)。1/4MIC及其更低濃度的組分在9～12 h過(guò)程中進(jìn)入穩(wěn)定期，生長(zhǎng)曲線(xiàn)幾乎與對(duì)照組完全重合。

圖1 DADS對(duì)單增李斯特菌生長(zhǎng)曲線(xiàn)的影響Fig.1 DADS on the growth curve of Listeria monocytogenes

2.3 RNA完整性檢測(cè)

將經(jīng)不同亞抑菌濃度DADS處理后所提取出單增李斯特菌的RNA，經(jīng)1%瓊脂凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖2a，所提出的對(duì)照組、1/4MIC、1/8MIC、1/16MIC的總RNA，23S rRNA和16S rRNA條帶較清晰，然而有明顯的拖尾現(xiàn)象，即各試驗(yàn)組分總RNA中有不同程度的DNA等雜質(zhì)污染，需進(jìn)一步處理。如圖2b所示，總RNA經(jīng)DNA酶處理后，DNA等雜質(zhì)污染情況得到明顯改善，條帶拖尾程度降低，即RNA除雜處理成功，可進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖2 不同濃度單增李斯特菌RNA的提取及純化Fig.2 Extraction and purification of Listeria monocytogenes RNA from different concentrations

2.4 毒力基因引物特異性驗(yàn)證

3對(duì)毒力基因引物的特異性驗(yàn)證結(jié)果如圖3所示。圖3a為inlA引物的熔融曲線(xiàn)圖，結(jié)果顯示為單峰，說(shuō)明該引物無(wú)二聚體。圖3b，3c分別是hlyA，prfA引物的熔融曲線(xiàn)圖，結(jié)果與圖3a相似。綜上所述，inlA，hlyA，prfA引物特異性良好，可應(yīng)用于后續(xù)試驗(yàn)。

圖3 RT-qPCR法引物驗(yàn)證：熔融曲線(xiàn)Fig.3 RT-qPCR primer validation：the melting curve

2.5 DADS對(duì)單增李斯特菌毒力基因inlA、hlyA、prfA表達(dá)的影響

采用RT-qPCR的方法來(lái)探討DADS對(duì)單增李斯特菌毒力基因inlA、hlyA、prfA表達(dá)的影響。對(duì)inlA作用的結(jié)果如圖4所示，較對(duì)照組，其它試驗(yàn)組分經(jīng)DADS處理后，毒力基因inlA的表達(dá)均受到抑制作用，且抑制趨勢(shì)呈濃度依賴(lài)性。其中1/4MIC較其它試驗(yàn)組的抑制程度均顯著（P＜0.05），inlA的表達(dá)量為對(duì)照組的19%，1/8MIC及1/16MIC組分中inlA的表達(dá)量分別為68%，93%。Duodu等[26]采用RT-qPCR法，將經(jīng)人工污染單增李斯特特菌的鮭魚(yú)分別置于4℃，20℃下貯藏后得出類(lèi)似結(jié)論，經(jīng)外源因子處理后的inlA表達(dá)顯著降低。

DADS對(duì)hlyA作用的結(jié)果如圖5。整體與對(duì)照相比，不同DADS的亞抑菌濃度下，hlyA的表達(dá)均受到顯著抑制。濃度為1/8MIC及1/4MIC時(shí)，hlyA的表達(dá)量分別為對(duì)照組的4%，2%，抑制效果極顯著（P＜0.05）。1/16MIC 較 1/8MIC及1/4MIC 試驗(yàn)組，hlyA的表達(dá)量差異顯著。DADS對(duì)單增李斯特菌毒力基因hlyA的表達(dá)整體呈濃度依賴(lài)性。這與Xu等[24]研究結(jié)論一致，即石榴皮中鞣酸也可顯著抑制單增李斯特菌毒力基因hlyA的表達(dá)。Miladi等[27]采用RT-PCR法來(lái)研究不同貯藏溫度對(duì)其毒力基因表達(dá)的影響，得出類(lèi)似結(jié)論：?jiǎn)卧隼钏固鼐鶶2，S3均隨著溫度的降低，其毒力基因的表達(dá)量也逐漸降低。同樣，Slama等[28]將手工奶酪置于-20℃下貯存6個(gè)月后，發(fā)現(xiàn)其毒力基因iap的表達(dá)量受到了顯著抑制，而對(duì)hlyA也具有抑制作用，然而抑制程度弱于iap。

圖4 DADS對(duì)單增李斯特菌毒力基因inlA表達(dá)的影響Fig.4 Effect of DADS on the gene expression of inlA in Listeria monocytogenes

DADS對(duì)單增李斯特菌毒力基因prfA表達(dá)同樣具有抑制作用（圖6）。經(jīng)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，添加DADS后的試驗(yàn)組 1/4MIC，1/8MIC，1/16MIC的prfA表達(dá)量均下調(diào)，下調(diào)量差異顯著（P＜0.05），整體下調(diào)趨勢(shì)呈濃度依賴(lài)性。1/4MIC組被抑制程度最大。當(dāng)濃度為1/8MIC及1/16MIC時(shí)，prfA的表達(dá)量為對(duì)照組的7%，34%。Upadhyay等[19]研究明確了反式肉桂酸、香芹酚、麝香草酚分別作用于單增李斯特菌后，prfA、actA、intA等毒力基因的表達(dá)量也顯著降低，這與本結(jié)論基本一致。同樣，Anne等[20]研究證明當(dāng)500 U/mL的乳酸鏈球菌素在4℃下作用于單增李斯特菌后，其毒力基因prfA的表達(dá)量顯著降低，僅為對(duì)照組的47%，當(dāng)作用溫度升至37℃時(shí)，表達(dá)量為對(duì)照組的86%。

DADS對(duì)單增李斯特菌毒力基因inlA，hlyA，prfA的表達(dá)均有抑制作用。同一濃度下，DADS對(duì)不同毒力基因的抑制程度不同。與對(duì)照組相比，1/16MIC的DADS對(duì)inlA，hlyA，prfA的抑制量分別為7%，40%，66%。而經(jīng)1/8MIC及1/4MIC處理后，inlA的抑制量是對(duì)照組的32%，81%，hlyA及prfA的抑制量高達(dá)93%～99%。因此，DADS對(duì)毒力基因hlyA及prfA的抑制作用更明顯，這可能與其分屬不同毒力島有關(guān)，inlA屬于第二毒力島（LIPI-2），而hlyA和prfA屬于第一毒力島（LIPI-1）[29-30]。

圖5 DADS對(duì)單增李斯特菌毒力基因hlyA表達(dá)的影響Fig.5 Effect of DADS on the gene expression of hlyA in Listeria monocytogenes

圖6 DADS對(duì)單增李斯特菌毒力基因prfA表達(dá)的影響Fig.6 Effect of DADS on the gene expression of prfA in Listeria monocytogenes

3 結(jié)論

本文采用微量肉湯稀釋法確定出DADS在96孔板中對(duì)單增李斯特菌的最低抑菌濃度為2 mmol/L，并在搖瓶體系下測(cè)定其生長(zhǎng)曲線(xiàn)，結(jié)果顯示DADS對(duì)單增李斯特菌的抑制作用呈濃度依賴(lài)性。當(dāng)濃度為2mmol/L時(shí)，單增李斯特菌完全被抑制，這與96孔板中的抑菌試驗(yàn)結(jié)論一致。以RT-qPCR為技術(shù)手段，探索不同濃度的DADS對(duì)單增李斯特菌毒力基因表達(dá)的影響。結(jié)果表明：亞抑菌濃度下DADS可顯著地抑制單增李斯特菌毒力基因inlA，hlyA，prfA的表達(dá)，抑制程度呈濃度依賴(lài)性。其中與對(duì)照組相比，1/16MIC組的毒力基因inlA的表達(dá)量分別被抑制了近81%，而hlyA，prfA的抑制量遠(yuǎn)超過(guò)inlA，毒力基因hlyA和prfA對(duì)DADS的作用更敏感。本研究為其它含硫香料對(duì)致病菌的作用及毒力基因的表達(dá)提供了新思路。