孫茹茹 姜霽珊 徐葉 黃志雄 秦智

摘? 要： 氫能因具備高熱值、燃燒產(chǎn)物無(wú)污染、原料來(lái)源廣泛等優(yōu)點(diǎn)成為最具潛力的新能源之一。暗發(fā)酵因不受光照限制，產(chǎn)氫能力強(qiáng)，并可以解決環(huán)境污染問(wèn)題而成為研究的熱點(diǎn)。該文主要綜述了暗發(fā)酵制氫的代謝途徑及其研究進(jìn)展，重點(diǎn)闡述了產(chǎn)氫菌株關(guān)鍵酶或基因改造的最新研究成果，并對(duì)其未來(lái)的應(yīng)用進(jìn)行了展望。

關(guān)鍵詞： 微生物制氫; 暗發(fā)酵; 產(chǎn)氫途徑; 菌株改造

中圖分類(lèi)號(hào)： Q 939.9? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A? ? 文章編號(hào)： 1000-5137（2020）06-0614-08

Abstract： Hydrogen energy has become the most potential new energy source because of its high calorific value，non-polluting combustion products and wide sources of raw materials.Dark fermentation has become a research hotspot because it is not restricted by light，has strong hydrogen production capacity and can also solve some environmental pollution problems.In order to understand the dark fermentation process in depth，this paper mainly reviewed the metabolic pathways and key enzymes of dark fermentation for hydrogen production，and summarized the advances on the modification of key enzymes from hydrogen-producing strains.The prospects of their future application were given as well.

Key words： microbial hydrogen production; dark fermentation; hydrogen production pathway; strain modification

0? 引? 言

目前，全球約87%的能源消耗是通過(guò)煤炭、石油、天然氣等化石能源燃燒獲得的[1]。隨著社會(huì)的發(fā)展，人們對(duì)能源的需求越來(lái)越高，化石能源因其不可再生性而迅速減少[2]。此外，化石能源燃燒所帶來(lái)的環(huán)境污染問(wèn)題，如CO2的釋放造成的溫室效應(yīng)等日趨嚴(yán)重，開(kāi)發(fā)新的可再生綠色能源迫在眉睫[3]。氫能具有清潔、能量密度高、零排放、可再生等優(yōu)點(diǎn)，被視為最具發(fā)展?jié)摿Φ奈磥?lái)能源之一[4]。目前，制備氫氣主要采用化石燃料高溫裂解和水電解兩種方法[5-6]。這兩種制氫方法不僅需要消耗化石能源，轉(zhuǎn)化率低，還會(huì)污染環(huán)境[7]，從經(jīng)濟(jì)和環(huán)保等方面考慮，都不適合于氫能源的產(chǎn)業(yè)化。

利用某些微生物新陳代謝過(guò)程產(chǎn)生氫氣的制氫方法稱(chēng)作生物制氫，生物制氫過(guò)程大多在環(huán)境溫度和壓力下運(yùn)行，能耗較低。同時(shí)，生物制氫還可以利用高濃度有機(jī)廢水、工農(nóng)業(yè)廢棄物，以及市政垃圾等為原料，有利于廢物回收利用，對(duì)環(huán)境友好，為利用可再生能源開(kāi)辟了一條新的途徑[8]。生物制氫技術(shù)主要包括藻類(lèi)和藍(lán)細(xì)菌生物法光解水產(chǎn)氫、光合細(xì)菌產(chǎn)氫，以及厭氧細(xì)菌暗發(fā)酵產(chǎn)氫3種途徑[9-11]。微藻、藍(lán)細(xì)菌和光合細(xì)菌產(chǎn)氫都需要在光照條件下進(jìn)行，與暗發(fā)酵相比產(chǎn)氫速度較慢，效率較低。暗發(fā)酵過(guò)程是在沒(méi)有光照的情況下，通過(guò)厭氧微生物將有機(jī)化合物轉(zhuǎn)化為生物氫，同時(shí)生成各種有機(jī)酸或醇類(lèi)副產(chǎn)物。厭氧微生物可能是兼性或?qū)Ｐ缘?。能夠進(jìn)行暗發(fā)酵產(chǎn)氫的微生物有許多，主要包括：梭菌屬（Clostridium）、脫硫弧菌屬（Desulfovibrio）、埃希氏菌屬（Escherichia）、丁酸芽孢桿菌屬（Trdiumbutyricum）、檸檬酸細(xì)菌屬（Citrobacter）、克雷伯氏菌屬（Klebsiella）、腸桿菌屬（Enterobacter）、醋微菌屬（Acetomicrobium）、甲烷球菌屬（Methanococcus）等[12]。暗發(fā)酵生物制氫基質(zhì)來(lái)源廣泛、底物轉(zhuǎn)化率高、能量利用率高、產(chǎn)氫能力強(qiáng)、不需要光照，因此是目前最有發(fā)展?jié)摿Φ纳镏茪浞绞街弧?/p>

1? 暗發(fā)酵制氫及制氫機(jī)理

GRAY等[13]最先開(kāi)展了微生物厭氧產(chǎn)氫途徑的理論研究。1965年，他們提出了丙酮酸脫羧產(chǎn)氫途徑，分為梭桿芽孢桿菌型和腸道桿菌型。2000年，TANISHO[14]提出了煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）和氫離子（H+）氧化還原產(chǎn)氫途徑，通過(guò)NADH的再氧化產(chǎn)氫（圖1）。

1.1 丙酮酸途徑產(chǎn)氫

丙酮酸產(chǎn)氫途徑在梭菌屬和古細(xì)菌中最常見(jiàn)。1 mol的葡萄糖經(jīng)糖酵解產(chǎn)生2 mol的丙酮酸，在丙酮酸脫氫酶的作用下，丙酮酸的羰基先被輔酶焦磷酸硫胺素（TPP）進(jìn)攻，形成丙酮酸與TPP的加成化合物。繼而，丙酮酸-TPP加成物脫羧形成羥乙基硫胺素焦磷酸，并將電子傳遞給鐵氧還蛋白（Fd），F(xiàn)d再將電子傳遞給氫化酶，最終在氫化酶的作用下，H+獲得電子，形成H2，如圖1（b）所示。在此途徑的基礎(chǔ)上，AKHTAR等[15]發(fā)現(xiàn)氫化酶、Fd和氧化還原酶等都含有Fe-S簇，負(fù)責(zé)合成Fe-S簇的基因過(guò)量表達(dá)可提高菌株的產(chǎn)氫能力。

在兼性厭氧菌（如大腸桿菌）中最常見(jiàn)的途徑是由丙酮酸-甲酸裂解酶（PFL）和甲酸氫裂解酶（FHL）兩種酶催化，如圖1（c）所示。丙酮酸在PFL的催化下形成乙酰CoA和甲酸，此后，在FHL的作用下甲酸裂解產(chǎn)生CO2和H2[16-17]，總體反應(yīng)如下：

C6H12O6+2H2O→4H2+2CO2。

1.2 NADH+H+平衡調(diào)節(jié)產(chǎn)氫

NADH/NAD+輔因子在微生物分解代謝中起主要作用，在有氧條件下，O2將作為最終的電子受體。在厭氧條件下，NAD+的再生是通過(guò)NADH還原代謝中間物來(lái)實(shí)現(xiàn)的[18]。在微生物厭氧發(fā)酵產(chǎn)氫體系中，葡萄糖在生成丙酮酸（圖1（a））的同時(shí)產(chǎn)生大量的NADH和H+。丙酮酸在不同酶的催化下發(fā)生不同的代謝途徑，其產(chǎn)物包括乙酸、乙醇、丁酸，以及乳酸等。在此過(guò)程中，NADH和H+被氧化成NAD+，從而調(diào)節(jié)微生物代謝過(guò)程中NADH和NAD+的平衡[19]。但是，當(dāng)NADH+H+氧化過(guò)程慢于NADH+H+的形成過(guò)程時(shí)，NADH+H+就會(huì)不斷積累，NADH通過(guò)氫化酶的作用將電子轉(zhuǎn)移給H+，從而釋放H2 （NADH+H+→NAD++H2）。

細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)NADH和NAD+的平衡過(guò)程和發(fā)酵產(chǎn)物酸性末端數(shù)量是影響發(fā)酵類(lèi)型的主要因素[20]。根據(jù)發(fā)酵液相末端產(chǎn)物的組成，可以將厭氧產(chǎn)氫的發(fā)酵類(lèi)型分為丁酸型、丙酸型，以及乙醇型發(fā)酵。

1.2.1 丁酸型發(fā)酵

當(dāng)?shù)孜镆云咸烟?、蔗糖、淀粉、乳糖等可溶性碳水化合物為基質(zhì)時(shí)，大多會(huì)呈現(xiàn)丁酸型發(fā)酵。丁酸型發(fā)酵的主要末端產(chǎn)物是乙酸、丁酸、CO2和H2。丁酸型發(fā)酵的優(yōu)勢(shì)種群是梭狀芽孢桿菌（Clostridium），主要包括丁酸梭狀芽胞桿菌（Clostridium butyricum）和酪丁酸梭狀芽胞桿菌（Clostridium tyrobutyricum）[21]。其中，在丁酸梭狀芽胞桿菌的發(fā)酵途徑中，乙酰CoA經(jīng)一系列的酶催化可產(chǎn)生丁酸、丁醇和乙酸，乙酸又可以和丁酰CoA反應(yīng)，生成丁酸和乙酰CoA，如圖1（d）所示。其中3-羥基丁酰CoA脫氫酶和丁酰CoA脫氫酶是關(guān)鍵的產(chǎn)氫酶，可將NADH催化為NAD+，從而產(chǎn)生H2。

1.2.2 丙酸型發(fā)酵

在厭氧發(fā)酵過(guò)程中，當(dāng)基質(zhì)中的含氮有機(jī)物（如肉膏、明膠、酵母膏）或者纖維素等難降解的碳水化合物含量較高時(shí)，發(fā)酵類(lèi)型主要表現(xiàn)為丙酸型。丙酸型發(fā)酵的主要特征是不產(chǎn)生氣體或產(chǎn)生氣體很少，丙酸為主要的液端發(fā)酵產(chǎn)物，伴有乙酸、琥珀酸、CO2等副產(chǎn)物生成，如圖1（e）所示。丙酸發(fā)酵主要是丙酸桿菌屬（Propionibacteria）[22]。研究發(fā)現(xiàn)，丙酸產(chǎn)量較高的菌株主要集中在丙酸桿菌屬中的幾個(gè)種，如特氏丙酸桿菌（Propionibacteria thoenii）、費(fèi)氏丙酸桿菌（Propionibacteria freudenreichii）、薛氏丙酸桿菌（Propionibacteria shermanii）和產(chǎn)酸丙酸桿菌（Propionibacteria acidipropionici）等[23]。

1.2.3 乙醇型發(fā)酵

經(jīng)典的乙醇發(fā)酵代謝途徑是指經(jīng)糖酵解途徑（EMP），酵母菌屬降解碳水化合物形成丙酮酸，再經(jīng)一系列酶催化形成乙醇，末端發(fā)酵產(chǎn)物只有乙醇和CO2。REN等[24]對(duì)厭氧發(fā)酵反應(yīng)器的優(yōu)勢(shì)菌群進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn)：經(jīng)厭氧訓(xùn)化后，污泥中的優(yōu)勢(shì)菌群為梭狀桿菌屬（Clostridium）和擬桿菌屬（Bacteroides），并沒(méi)有觀察到酵母菌（Saccharomyces）;同時(shí)，在產(chǎn)生的氣體中檢測(cè)出大量氫氣，液相末端的主要發(fā)酵產(chǎn)物為乙醇和乙酸，如圖1（f）所示，因此，他們將這種產(chǎn)氫途徑命名為乙醇型發(fā)酵。乙醇型發(fā)酵的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌為產(chǎn)乙醇桿菌屬（Ethanoligenens），如哈爾濱產(chǎn)乙醇桿菌（Ethanoligenens harbinense）[25]。乙醇型發(fā)酵的關(guān)鍵酶為乙醛脫氫酶和乙醇脫氫酶。

2? 暗發(fā)酵產(chǎn)氫菌株改造

暗發(fā)酵制氫存在非常大的優(yōu)勢(shì)，圍繞暗發(fā)酵制氫已經(jīng)做了很多方面的研究。大多是從接種物[26]、反應(yīng)底物[26-27]、反應(yīng)器類(lèi)型[27-28]、金屬離子[28]、溫度[29]和pH值[29]等方面進(jìn)行研究和報(bào)道的。發(fā)酵產(chǎn)氫菌株是制氫的核心，近年來(lái)，研究人員開(kāi)始利用分子生物學(xué)方法開(kāi)展氫酶，以及其他產(chǎn)氫相關(guān)酶的分子遺傳學(xué)研究，為揭示產(chǎn)氫機(jī)理提供了重要信息[30]。

2.1 利用基因敲除提高菌株產(chǎn)氫量

暗發(fā)酵微生物將碳分解代謝中的電子導(dǎo)入氫離子來(lái)合成H2。該產(chǎn)氫途徑的關(guān)鍵酶主要包括氫化酶、Fd和氧化還原酶等，這些都常含有Fe-S簇。例如，在梭狀芽孢桿菌中，F(xiàn)e-Fe氫化酶，[4Fe-4S]-Fd和丙酮酸：Fd氧化還原酶催化丙酮酸依賴(lài)的H2合成，[4Fe-4S]-Fd和氧化還原酶都含有兩個(gè)Fe-S簇[31]。在細(xì)菌中，F(xiàn)e-S簇的組裝和合并由3個(gè)操縱子編碼的酶催化，它們是NIF（固氮）、SUF（硫利用因子）和ISC（Fe-S簇）。在這3種酶中，由ISC操縱子編碼的酶在大腸桿菌的正常生長(zhǎng)條件下，起到Fe-S輔因子組裝和插入的作用。IscR的缺失會(huì)導(dǎo)致ISC操縱子的過(guò)度表達(dá)，然而ISC的過(guò)度表達(dá)可能增強(qiáng)了暗發(fā)酵菌類(lèi)合成Fe-S簇的能力。AKHTAR等[15]研究了IscR缺失對(duì)重組梭狀芽胞桿菌[FeFe]氫酶的活性，和對(duì)大腸桿菌BL21產(chǎn)氫的能力影響。結(jié)果表明，在厭氧條件下，IscR缺失可將合成[FeFe]氫酶的酶活性提高3倍，IscR的缺失能促進(jìn)重組的梭狀芽孢桿菌中[4Fe-4S]-Fd的合成;在缺氧條件下，IscR的缺失還增強(qiáng)了特異性、總的氫化酶的積累和其活性。因此，IscR缺失是刺激產(chǎn)氫的有效策略。

梭菌產(chǎn)酸階段或指數(shù)增長(zhǎng)階段產(chǎn)生氫氣、乙酸、丁酸和二氧化碳。理論上，當(dāng)發(fā)酵末端產(chǎn)物為乙酸時(shí)，每摩爾葡萄糖可得到4 mol H2。當(dāng)最終發(fā)酵產(chǎn)物為丁酸時(shí)，每摩爾葡萄糖可得到2 mol H2[32]。丁酸梭狀芽胞桿菌（C.butyricum）是發(fā)酵產(chǎn)氫的常用微生物之一。在產(chǎn)生氫氣的同時(shí)，可以產(chǎn)生酸（乳酸、乙酸和丁酸）、二氧化碳，以及少量的乙醇。HALLENBECK[33]認(rèn)為丁酸鹽形成途徑是制氫過(guò)程中的主要競(jìng)爭(zhēng)途徑，因?yàn)樗绕渌緩较母嗟腘ADH，從而降低了氫氣的產(chǎn)量，除此之外末端產(chǎn)物丁酸鹽還會(huì)抑制微生物的生長(zhǎng)。因此，消除丁酸途徑可以提高梭狀芽孢桿菌的產(chǎn)氫能力。由丁酸型發(fā)酵途徑可知3-羥基丁酰CoA脫氫酶是丁酸生成途徑中第一個(gè)氧化NADH的酶。CAI等[34]通過(guò)與大腸桿菌的種間結(jié)合，將質(zhì)粒（pMTL007）轉(zhuǎn)移至丁酸梭狀芽胞桿菌（C.butyricum），并敲除該菌中編碼3-羥基丁酰CoA脫氫酶基因HBD。結(jié)果表明：丁酸梭狀芽胞桿菌中HBD的缺失導(dǎo)致丁酸途徑失活，與野生型菌株相比，乳酸、乙酸產(chǎn)量增加，而H2產(chǎn)量明顯下降，并產(chǎn)生大量乙醇。敲除HBD基因的菌株產(chǎn)氫量急劇下降，因此可以通過(guò)工藝優(yōu)化來(lái)提高產(chǎn)氫量。生物反應(yīng)器液相和頂空的氫分壓是影響產(chǎn)氫能力的關(guān)鍵因素之一，因此采用N2噴射來(lái)降低H2分壓。優(yōu)化后的工藝表明：在低的H2分壓下，缺乏HBD菌株的H2產(chǎn)量增加，乙醇產(chǎn)量下降，這表明抑制丁酸梭狀芽胞桿菌（C.butyricum）的丁酸途徑對(duì)其自身的生長(zhǎng)并無(wú)影響，其H2產(chǎn)量可能與乙醇途徑競(jìng)爭(zhēng)NADH。

2.2 利用蛋白工程提高產(chǎn)氫量

在厭氧發(fā)酵產(chǎn)氫微生物中，[FeFe]氫酶催化質(zhì)子接受電子產(chǎn)生氫氣，是產(chǎn)氫代謝途徑中的關(guān)鍵步驟，其活性直接影響著微生物的產(chǎn)氫效率[35]。然而該酶對(duì)氧的高敏感性一直是厭氧發(fā)酵制氫技術(shù)實(shí)施的主要障礙之一。[FeFe]氫酶中含有574個(gè)氨基酸殘基和5個(gè)Fe-S簇。有文獻(xiàn)報(bào)道，蛋氨酸氧化會(huì)影響蛋白質(zhì)的功能特性[36-37]。KOO等[38]通過(guò)氨基酸殘基突變提高了氫化酶對(duì)O2的耐受性。將蛋氨酸替換為亮氨酸，因?yàn)樗鼈兙哂邢嗨频氖杷院拖嗤笮〉墓倌軋F(tuán)，并且能將對(duì)蛋白質(zhì)折疊的影響降到最低。結(jié)果表明：突變后的[FeFe]氫酶對(duì)O2的忍耐性提高了2倍以上。雖然產(chǎn)氫量與對(duì)照組相比并無(wú)明顯上升，但是為產(chǎn)氫酶的研究提供了一種新思路。

2.3 構(gòu)建高效產(chǎn)氫菌株

依賴(lài)丙酮酸的氫氣合成是暗發(fā)酵產(chǎn)氫微生物最重要的產(chǎn)氫途徑。與NAD（P）H依賴(lài)的H2途徑相比，丙酮酸途徑H2合成受最終產(chǎn)物抑制的影響要小很多。大腸桿菌BL21（DE3）中ydbK的缺失會(huì)導(dǎo)致H2的積累顯著減少;IscR是負(fù)責(zé)編碼ISC操縱子的負(fù)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，IscR的缺失有利于氫化酶和[4Fe-4S]-Fd的合成、積累和活性的增強(qiáng)。KALIM等[15]構(gòu)建了一個(gè)高產(chǎn)的合成物，質(zhì)粒pA攜帶一個(gè)合成操縱子，編碼Fe-Fe氫化酶HydA及其所需的成熟因子HydF，HydE和HydG。質(zhì)粒pAF含有一個(gè)額外的基因，編碼巴斯德尿桿菌（CpFdx）的[4Fe-4S]-Fd（CpFdx）。大腸桿菌YdbK與HydA，HydA成熟因子（HydE，HydF和HydG）共同表達(dá)，在密閉血清瓶中培養(yǎng)17～24 h，與不表達(dá)重組YdbK或CpFdx的菌株相比，YdbK和CpFdx共表達(dá)的菌株產(chǎn)氫量提高了9倍以上。在IscR缺失的菌株中H2的積累進(jìn)一步增強(qiáng)。

3? 結(jié)論與展望

與其他生物制氫途徑相比，暗發(fā)酵制氫具有產(chǎn)氫能力高、產(chǎn)氫速率快、產(chǎn)氫持續(xù)穩(wěn)定、反應(yīng)裝置簡(jiǎn)單、操作方便、原料來(lái)源廣泛等優(yōu)點(diǎn)，容易實(shí)現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)。目前，暗發(fā)酵產(chǎn)氫研究大多處于實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的分批、半連續(xù)或連續(xù)過(guò)程，還沒(méi)有大規(guī)模或工業(yè)規(guī)模的暗發(fā)酵制氫研究的報(bào)道。主要原因是：在利用純菌種為主的生物制氫方法中，純菌種分離增加了成本;并且純菌多為嚴(yán)格厭氧菌，工業(yè)規(guī)?；瘯?huì)使操作變得困難;小型實(shí)驗(yàn)易取得高產(chǎn)氫率，但較難達(dá)到長(zhǎng)期運(yùn)行并持續(xù)產(chǎn)氫的效果。目前正在研發(fā)將混合菌發(fā)酵、暗發(fā)酵和其他產(chǎn)氫途徑相耦合的運(yùn)行機(jī)制。

參與暗發(fā)酵的微生物有兼性和專(zhuān)性厭氧菌、純菌（分離菌株）、混合菌（來(lái)自厭氧消化污泥、堆肥土壤等）、嗜熱和中溫微生物。與混合菌發(fā)酵相比，使用純菌發(fā)酵的主要優(yōu)勢(shì)是生產(chǎn)率更高，但是存在污染、保存過(guò)程中代謝途徑改變和突變等問(wèn)題?；旌暇l(fā)酵可以降低大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)過(guò)程中的操作難度，可以積極地利用各種有機(jī)物，直接利用廢水，并且能夠適應(yīng)更大范圍的工藝參數(shù)（有機(jī)物負(fù)荷、pH值和溫度）。因此，混合菌發(fā)酵不需要介質(zhì)滅菌，工藝成本低，更適合大規(guī)模應(yīng)用。厭氧消化污泥、土壤和屠宰場(chǎng)污泥的混合培養(yǎng)物都是工業(yè)廢水生物制氫的有利來(lái)源[25]。

在暗發(fā)酵過(guò)程中，厭氧細(xì)菌將食品或農(nóng)業(yè)廢物，或者農(nóng)業(yè)、造紙或制糖業(yè)的廢水中的復(fù)雜碳化合物分解為簡(jiǎn)單的有機(jī)酸（乙酸、丙酸和丁酸等可揮發(fā)脂肪酸），導(dǎo)致pH值降低，抑制厭氧細(xì)菌生長(zhǎng)和產(chǎn)氫。然而，這些揮發(fā)性脂肪酸可以被微藻類(lèi)用作底物，用于生產(chǎn)化學(xué)藥品和能源。黑暗發(fā)酵產(chǎn)生的代謝物可以被藻類(lèi)利用，藻類(lèi)又可以作為額外的生物量再次進(jìn)行發(fā)酵過(guò)程。微藻培養(yǎng)主要利用葡萄糖和果糖等單糖，這使得藻類(lèi)制氫過(guò)程成本高昂，工業(yè)化吸引力降低。利用暗發(fā)酵后富含有機(jī)酸的廢水作為微藻培養(yǎng)基，可以降低有機(jī)酸積累對(duì)暗發(fā)酵制氫的抑制，同時(shí)降低微藻培養(yǎng)成本，可謂一舉兩得[39]。

今后暗發(fā)酵制氫的研究重點(diǎn)主要為：利用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)研究發(fā)酵產(chǎn)氫途徑，利用生物工程技術(shù)選育高效產(chǎn)氫菌株，發(fā)展混合微生物菌群有機(jī)廢水發(fā)酵的規(guī)?；a(chǎn)，探索不同菌種間的相互作用，深入推進(jìn)聯(lián)合生物制氫研究。

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（責(zé)任編輯：馮珍珍，顧浩然）