張玖漪 蔡曉鋒 徐晨曦 王全華 王小麗

摘? 要： 從菠菜（Spinacia oleracea L.）基因組數(shù)據(jù)庫中篩選鑒定了與菠菜葉酸合成轉運，及與C1代謝相關的25個基因，并對其編碼的蛋白做進化樹和保守域分析，發(fā)現(xiàn)葉酸蛋白在進化上表現(xiàn)出保守型和復雜性。用實時熒光定量聚合酶鏈式反應（qRT-PCR）分析了葉酸含量不同的菠菜的葉酸相關基因表達量，發(fā)現(xiàn)在轉錄水平上只有少數(shù)葉酸基因表達量與菠菜葉酸含量有關。

關鍵詞： 菠菜（Spinacia oleracea L.）; 葉酸; 基因表達

中圖分類號： S636.1; Q563+.8? 文獻標志碼： A? 文章編號： 1000-5137（2020）06-0637-13

Abstract： In this paper，25 genes related to spinachs（Spinacia oleracea L.） folate synthesis and transport，and to C1 metabolism were identified in the spinach genome database.The evolutionary tree and conserved domain analysis of the encoded protein showed that the folate protein showed conservative type and complexity in evolution.Using the technology of quantitative real-time polymerase chain reaction （qRT-PCR） to analyze the expression of folate-related genes in spinach with different folate content，it was found that only a few folate gene expression levels were related to the content of spinach folate at the transcription level.

Key words： spinach（Spinacia oleracea L.）; folate; gene expression

0? 引? 言

葉酸是水溶性B族維生素，在生物體內主要作為一碳單位的供體和受體，參與DNA合成、氨基酸代謝，以及各類化合物的甲基化過程。植物缺乏葉酸，則葉綠素、木質素等物質不能合成，光呼吸和氮代謝將受阻[1-3]。葉酸還在種子萌發(fā)、幼苗形成，以及植物開花等過程中發(fā)揮重要作用[4-5]。葉酸同時是人體自身不能合成但必不可缺的營養(yǎng)素，缺乏葉酸會導致巨幼紅細胞性貧血和神經(jīng)管畸形，還會導致體內同型半胱氨酸量降低[6-7]。針對植物葉酸積累規(guī)律的研究，對充分發(fā)揮葉酸在植物生長發(fā)育過程中的作用，增加作物產(chǎn)量和品質，提高葉酸在可食部位的積累水平，開發(fā)高葉酸作物新品種具有重要意義。

植物葉酸合成途徑與細菌類似，葉酸的合成包括對氨基苯甲酸（pABA）的合成、蝶呤的合成，及葉酸的組裝、加尾與轉化三部分，分別定位在細胞質、質體和線粒體上[8]。葉酸合成會受到酶、基因等水平的反饋調控，合成后的代謝還涉及體內運轉、降解與回補。單谷氨酸尾形式的四氫葉酸（THF）是唯一酶活性形式[9]，它既可以在亞細胞中合成各種形式的葉酸衍生物，也可以作為C1受體參與絲氨酸和甘氨酸的轉化過程，接受C1基團后合成5，10-亞甲基四氫葉酸（5，10-CH2-THF）[10]。葉酸聚谷氨酸鹽（THF-Glun）進入細胞質后有可能被光降解，降解產(chǎn)物可以在酶的作用下重新加入葉酸合成途徑，蝶呤醛還原酶（PTAR）和γ-谷氨酸水解酶（GGH）是參與該途徑的重要酶[8-11]。

過表達葉酸合成途徑限速酶可以提高植物葉酸含量。編碼三磷酸鳥苷（GTP）環(huán)化水解酶的基因（GCHI）在番茄、生菜、玉米中過表達，能將番茄果實、水稻胚乳，和生菜、玉米胚乳中的葉酸含量分別提高4，8.5和2倍[12-14]。共表達蝶呤合成分支的GCHI和pABA合成分支的氨基脫氧膽酸合成酶（ADCS）兩個基因，能使水稻胚乳中的葉酸含量提高15～100倍[15]，是迄今為止利用轉基因技術提高植物中葉酸含量最成功的例子。將GCHI與ADCS單表達后的轉基因番茄進行雜交，也能夠提高番茄果實葉酸含量達25倍，顯著高于GCHI和ADCS單基因表達的番茄中葉酸的含量[16]。過表達兩個葉酸組裝過程中編碼關鍵酶的基因二氫葉酸合成酶與葉酰聚谷氨酸合成酶雙功能酶（DHFS/FPGS），二氫蝶呤合成酶（DHPS），發(fā)現(xiàn)轉基因擬南芥中的葉酸含量分別較對照提高了20.6%～29.4%和19.0%～42.6%[17]。此外，葉酸主要以多尾形式存在，抑制GGH的活性，可使葉酸谷氨酸尾的平均長度增加，并且使葉酸的含量提高30%[18]。但大量研究發(fā)現(xiàn)：上述基因在不同植物中過表達對其葉酸含量的提高效果差異很大，說明植物葉酸合成代謝調控機制復雜，需要針對特定植物開展葉酸合成代謝機制的研究。

菠菜（Spinacia oleracea L.）是重要的世界性葉用蔬菜，是公認的葉酸含量較高的蔬菜（http：//www.nal.usda.gov/fnic/foodcomp/search/）。提高菠菜中的葉酸含量，可以在攝食較少的情況下，保證足量葉酸的攝取。此外，菠菜生育期短，適宜的溫度下可種植8～10茬，實現(xiàn)全年供應，因此研究菠菜葉酸積累規(guī)律具有重要意義。目前關于菠菜葉酸積累規(guī)律的研究很少。WATANABE等[19]通過在水培菠菜中添加苯丙氨酸，促進了蝶呤合成路徑和pABA合成路徑的流量，從而提高菠菜中的葉酸含量，表明通過調節(jié)葉酸的合成與代謝路徑可以實現(xiàn)菠菜中葉酸含量的提高。本研究擬通過同源序列比對和生物信息學分析，鑒定菠菜葉酸合成代謝相關基因，并分析其表達量與葉酸總量的關系，為揭示菠菜葉酸合成代謝機制，以及通過遺傳改造途徑提高菠菜葉酸含量，奠定初步基礎。

1? 材料與方法

1.1 基因序列獲取與生物信息學分析

從擬南芥（Arabidopsis thaliana）、甜菜（Beta vulgaris）、番茄（Solanum lycopersicum）、煙草（Nicotiana tabacum）基因組數(shù)據(jù)庫中獲得葉酸合成代謝相關基因序列，在菠菜基因組數(shù)據(jù)庫（http：//www.spinachbase.org/）進行BLAST分析得到菠菜葉酸合成代謝相關同源基因序列。通過SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/），PROSITE（https：//prosite.expasy.org/）對獲得的蛋白質序列進行保守結構域預測和分析。用MEGA 7.0（neighbor-joining，bootstrap n=1 000）繪制進化樹。

1.2 材料培養(yǎng)與葉酸含量測定

在對本課題組存有的菠菜種質資源葉酸含量篩選的基礎上，選擇“日本大葉”（濰坊格瑞種子有限公司）、“滬菠2號”（上海師范大學）、“澳綠”（廣州南蔬農業(yè)科技有限公司）3個葉酸含量差異較大的菠菜材料，用作基因表達研究。將菠菜種子播種于以泥炭和珍珠巖混合比例（體積比）為1∶1的基質穴盤中，置于上海師范大學植物種質資源開發(fā)中心人工氣候室中育苗，光照時長為：10 h光照，14 h黑暗;光照強度為5 200 lx;濕度約為68%。待幼苗長至兩葉一心期，選取大小長勢一致的幼苗小心洗去根部土壤后放入營養(yǎng)液（1/2 Hoagland，微量元素使用Arnon配方）中水培，水培液每隔3 d更換一次，控制pH值為6.8左右，待菠菜生長30 d后，采樣，取葉片液氮速凍。一部分樣品于凍干機中凍干，研磨成粉，一部分樣品存入-80 ℃冰箱備提RNA。

采用熒光分光光度法測定菠菜中的葉酸總含量。取菠菜葉片凍干粉各0.02 g于5 mL棕色離心管中與1 mL物質的量濃度為0.1 mol?L-1，pH值為6.8的磷酸緩沖液（含質量分數(shù)為1%的L-抗壞血酸和體積分數(shù)為0.2%的2-巰基乙醇）混勻后先沸水浴后冰浴，再加入600 μL木瓜蛋白酶溶液，37 ℃搖床孵育1 h，取出，以100 ℃水浴終止酶活性后，離心取上清液，在上清液中加入80 μL大鼠血清后用磷酸緩沖液補充體積至2 mL，孵育2 h，最后取出先沸水浴再冰浴，離心后取上清液，上清液最終經(jīng)滅菌的濾孔直徑為0.45 μm的濾膜篩濾后備測，提取全程在弱光環(huán)境中進行。測定前在15 mL離心管中加入400 μL葉酸提取液和100 μL 20%（體積分數(shù)）冰乙酸溶液混勻，隨后用4%（質量分數(shù)）高錳酸鉀溶液和3%（體積分數(shù)）過氧化氫溶液分別滴定混合液，最后用超純水定容至10 mL。用熒光分光光度計（安捷倫，Cary Eclipse）于激發(fā)波長（Ex）為370 nm，發(fā)射波長（Em）為400～600 nm處掃描測熒光強度。預試驗結果表明：扣除空白實驗背景值后，該方法的葉酸回收率為85%～90%。

1.3 實時熒光定量法測定基因表達量

使用TRIzol法提取菠菜樣品中的總RNA。使用TaKaRa PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）試劑盒將提取的RNA反轉錄成互補DNA（cDNA），最后使用TaKaRa TB Green TM Premix Ex Taq TM（Tli RNaseH Plus）試劑盒在Applied Biosystems 7500 Real Time PCR儀器上進行實時熒光定量PCR（qRT-PCR）。以菠菜18S為內參，以2-ΔCt法計算基因相對表達量。設計qRT-PCR引物序列（表1），熔解溫度（Tm）控制在57～61 ℃。

2? 結? 果

2.1 菠菜葉酸合成代謝相關基因確定

根據(jù)同源搜索獲得25個菠菜葉酸合成代謝相關基因（表2），其中11個基因與C1代謝途徑有關，14個基因與葉酸合成轉運有關。絲氨酸羥甲基轉移酶基因（SHMT1）編碼兩個蛋白SHMT1a和SHMT1b，5-甲基四氫葉酸環(huán)化酶基因（5FCL）也編碼兩個同源蛋白5-甲酰四氫葉酸環(huán)化連接酶（5FCL）和5FCLL。GCSH，GCSL，GCSP，GCST是組成甘氨酸脫羧酶復合物（GDC）的4種蛋白。

2.2 保守結構域分析

對菠菜（S.oleracea，So）、擬南芥（A.thaliala，At）、番茄（S.lycopersicum，Sl）、煙草（N.tabacum，Nt）和甜菜（B.vulgaris，Bv）的葉酸合成代謝相關蛋白進行保守域結構分析，由表3～4可知：從結構域數(shù)量看，菠菜相關基因的結構域和其他物種總體相似，偶爾有個別結構域在某一個物種中存在或丟失，如GTAse 2在甜菜中不存在，PIKKc_ATR，F(xiàn)AT，UME，F(xiàn)ATC只在煙草中出現(xiàn);從結構域種類來看，除了個別蛋白如MTHR與煙草差異較大外，菠菜與其他植物葉酸相關蛋白結構域種類基本一致;從結構域長度來看，大部分結構域在不同物種間氨基酸數(shù)量相同，如二氫葉酸還原酶蛋白（DHFR）的2個結構域在5個物種中長度都相同;少部分結構域長度不同，如菠菜ADCS蛋白的GATsae 1結構域由164個氨基酸組成，與甜菜、煙草、番茄均不相同;又如5FCL蛋白，在菠菜中只有一個由207個氨基酸組成的5-FTHF_cyc-lig，而擬南芥和甜菜中則有2個5-FTHF_cyc-lig。

2.3 進化樹分析

使用MEGA 7.0的Neighbor-joining算法對菠菜（S.oleracea）、擬南芥（A.thalian）、甜菜（B.vulgaris）、番茄（S.lycopersicum）和煙草（N.tabacum）的葉酸相關蛋白構建進化樹（圖1）。菠菜葉酸合成轉運相關蛋白中，除DHFR，DHFS和GCHI 3個蛋白外，其他蛋白都與甜菜具有極高的相似性，可信度大于90%，說明菠菜的葉酸合成相關蛋白在進化上與甜菜更接近，這與菠菜和甜菜同屬莧科是相符的。GCHI在菠菜中的進化表現(xiàn)出相對原始的狀態(tài)，而DHFS則與煙草有更高的相似性。

GGH催化氨基苯甲?；酃劝彼幔╬ABA-Glun）脫谷氨?；蓀ABA-Glu，成為合成pABA的前體物質，同時GGH使THF-Glun轉化成THF，重新進入細胞質參加葉酸合成循環(huán)[8]。SoGGH在葉酸含量相對較低的“澳綠”和“日本大葉”中大量表達，與葉酸含量變化趨勢相反，說明此時大量葉酸的谷氨酸尾被脫下而重新變?yōu)橛坞x態(tài)，這與在擬南芥和番茄中3倍過表達GGH使葉酸含量下降[18]的實驗結果一致，GGH的高表達讓植物中以儲存形式存在的葉酸轉變?yōu)門HF，使得可檢測到的葉酸變少。

葉酸在線粒體中被合成后可以在線粒體和葉綠體中被甲基化，并以葉酸衍生物的形式參加C1循環(huán)。5-甲?；臍淙~酸（5-CHO-THF）是一種穩(wěn)定的氧化形式葉酸，不能被植物直接利用，5-甲酰四氫葉酸環(huán)化連接酶（5FCL）將5-CHO-THF轉化為5，10-次甲基四氫葉酸（5，10=CH-THF），從而參與植物C1循環(huán)。結果發(fā)現(xiàn)：So5FCL，So5FCLL的相對基因表達量與葉酸含量呈相反的變化趨勢，與在擬南芥中的研究結果類似，at5fcl突變體中5-CHO-THF含量顯著增加，而用Zm5FCL回補at5fcl突變體后，突變體葉片中5-CHO-THF含量降低，恢復到野生型水平[26-27]。So5FCLL可能也具有類似的生物學功能，后續(xù)需要進一步分析葉酸各個組分的含量，尤其是5-CHO-THF含量，明確So5FCLL與菠菜5-CHO-THF含量及葉酸總量的關系。

除上述基因外，大部分基因表達量與葉酸總含量的關系還不清楚，可能與基因轉錄水平、蛋白水平的修飾有關，也可能與上下游產(chǎn)物及轉錄因子等參與的調控有關，后續(xù)還需要明確菠菜葉酸各組分含量并利用更多的分子生物學手段開展菠菜葉酸積累途徑的研究。

4? 結? 論

菠菜葉酸合成代謝路徑中的蛋白既保持了某些功能與鄰近物種的一致性，又進化出適應于自己合成代謝的功能，體現(xiàn)了進化的多樣性和復雜性。除SoGCHI，SoADCS和SoGGH外，大部分葉酸合成代謝途徑相關基因的表達量與菠菜葉酸總含量沒有明顯的規(guī)律性，可能與代謝途徑的反饋調控等有關，還需要通過其他實驗進一步驗證。

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（責任編輯：顧浩然，馮珍珍）