何迎粉，何榮榮，劉敦華，孫 悅

（1.寧夏大學 農學院，寧夏 銀川 750021；2.寧夏大學 葡萄酒學院，寧夏 銀川 750021）

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是對人類有益的一類微生物，常被用來制作面包、啤酒和葡萄酒等發(fā)酵食品，除此之外，其也廣泛應用在溶劑、乳化劑和燃料等工業(yè)領域[1]。釀酒酵母因具有發(fā)酵速度快和產酒精濃度高等優(yōu)點而成為學者研究的重點。但在發(fā)酵過程中，釀酒酵母細胞受到乙醇、酸度、滲透壓和營養(yǎng)成分不足等因素的影響[2]，生長代謝受到抑制，其中乙醇脅迫是影響較大的因素之一[3]。

釀酒酵母細胞中含有許多抵御乙醇脅迫的成分，如菌體海藻糖[4]、與細胞膜流動性有密切聯(lián)系的脂肪酸[5]、與菌體蛋白相關的氨基酸等[6]。其中海藻糖是釀酒酵母在乙醇脅迫下產生的重要應激產物，能夠特異性保護菌體蛋白質、生物膜和核酸等大分子結構[7]。海藻糖發(fā)揮的作用是雙重的：一是海藻糖取代水并與磷脂極性基團結合來保持膜結構的完整性；二是海藻糖還可以起到伴侶蛋白作用，抑制變性蛋白質聚集，為蛋白質復性提供能量[8]。海藻糖除了提高釀酒酵母的乙醇脅迫外，在其他不利環(huán)境（如高溫、冷凍、剪切力和有毒物質）中也起著至關重要的作用[9]。本文對乙醇脅迫下釀酒酵母細胞的耐受機制及海藻糖與釀酒酵母乙醇脅迫的關系進行綜述，旨在為提高釀酒酵母的乙醇耐受性提供參考。

1 釀酒酵母的乙醇耐受性機理

乙醇是釀酒酵母發(fā)酵生成的主要副產物，高濃度乙醇對酵母細胞會產生抑制作用，酵母菌則產生一系列的應激反應來保證正常的生長代謝，這種應對機制即為釀酒酵母乙醇耐受性[10]。乙醇對酵母細胞的影響主要體現(xiàn)為降低酵母細胞存活率和細胞生長速率，進而導致發(fā)酵過程的終止[11]。因此，研究耐酒精釀酒酵母的篩選和發(fā)酵特性的評價具有重要意義。

1.1 酵母細胞結構與乙醇耐受性的關系

1.1.1 酵母細胞壁與乙醇耐受性的關系

細胞壁的完整性在釀酒酵母乙醇耐受性發(fā)揮著重要作用。釀酒酵母細胞壁的主要成分是D-葡萄糖、D-甘露糖、蛋白質、幾丁質和極少量的脂類物質和礦物質。在高濃度酒精的環(huán)境下，細胞壁中的成分會發(fā)生改變以抵御酒精等不利環(huán)境，減輕對細胞結構的破壞[12]。葡萄糖和甘露糖構成的細胞壁具有一定的韌性，細胞壁蛋白固定在細胞壁上，可以起到防止酒精溶解酵母細胞的作用[13]。細胞壁麥角固醇和多種脂肪酸可以調節(jié)細胞膜的滲透性，提高釀酒酵母的存活率[14]。

除釀酒酵母細胞壁結構外，細胞壁合成基因與乙醇耐受性也存在一定的關聯(lián)。這些基因包括葡聚糖合成基因、β-1,3葡聚糖合成基因FKS1和β-1,6葡聚糖合成基因KRE6[15]，細胞壁蛋白基因SPl1和其他細胞壁基因BEM2、PAT1、ROM2、VPS34、ADA2[16]。

1.1.2 細胞內膜系統(tǒng)與乙醇耐受性的關系

乙醇對釀酒酵母內膜系統(tǒng)產生毒害作用的部位有細胞膜、親水蛋白、疏水蛋白和內質網[17]，其主要目標是膜結構。高濃度乙醇會導致膜流動性和通透性增加，從而破壞膜完整性，酵母細胞可以通過改變膜結構來防止膜流化和穩(wěn)定質膜[18]，達到抵御乙醇壓力的目的[19]。

不飽和脂肪酸和麥角固醇是細胞膜的重要成分，ALEXANDRE H等[20]研究發(fā)現(xiàn)，當乙醇濃度升高時，麥角固醇含量也會增加。ARCHANA K M等[21]研究發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基中加入不飽和脂肪酸，釀酒酵母抵御乙醇毒害的能力會提高。除此之外，乙醇還通過減少生物分子的水化外殼的方式使其受到活性氧的攻擊，在此過程中乙醇取代水并改變分子在細胞膜上的位置，最終破壞膜的結構和功能[22]。

1.2 釀酒酵母自身遺傳基因與乙醇耐受性的關系

釀酒酵母在高濃度乙醇中會做出一系列應激反應，與釀酒酵母乙醇耐受性密切相關的基因主要有：熱激蛋白合成基因、與乙醇耐受性相關的內源基因、某些氨基酸的合成基因以及海藻糖合成酶基因[23]。

1.2.1 熱激蛋白合成基因

熱激蛋白是釀酒酵母在脅迫條件下產生的特殊蛋白，熱激蛋白合成基因主要有Hsp12、Hsp30、Hsp70、Hsp78、Hsp82、Hsp104等。CHANDLER M等[24]采用脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）微陣列分析的方法研究釀酒酵母在體積分數5%酒精培養(yǎng)基中好氧培養(yǎng)物的基因，通過與原始菌株對比，經過酒精處理的酵母菌Hsp104、Hsp26、Hsp30、Hsp70和Hsp12的基因在轉錄水平上提高幅度較大，熱激蛋白合成量較多?；騂sp70具有穩(wěn)定細胞膜結構、參與其他蛋白質的合成與折疊和抑制蛋白質分解的作用[25]。MARKS V D等[26]研究發(fā)現(xiàn)，釀酒酵母在乙醇脅迫下熱激蛋白Hsp70家族基因SSE1、SSA1和SSA2表達上調。Hsp12是與細胞膜相關的蛋白質，在高濃度酒精中維持質膜完整性，Hsp104則充當變性蛋白質分解中的重塑劑[27]。

1.2.2 酵母內源性基因

酵母內源性基因過表達可以提高釀酒酵母乙醇耐受性，逆代謝工程方法可以識別釀酒酵母潛在的與乙醇耐受性相關的基因靶點。HONG M E等[28]選擇酵母內源性基因作為研究對象，采用逆代謝工程方法識別過表達基因靶點，其中基因靶點INO1、DOG1、HAL1和截短的MSN2基因與乙醇耐受性有著密切聯(lián)系，將這四種質粒重組酵母進行乙醇耐受性實驗，結果發(fā)現(xiàn)，這四種質粒過表達都能增強酵母乙醇耐受性，其中基因INO1過表達的效果最好。

1.2.3 氨基酸基因

酵母細胞中某些氨基酸在提高釀酒酵母乙醇耐受性發(fā)揮重要作用，如脯氨酸、精氨酸和色氨酸。脯氨酸主要通過促進GK蛋白的生成來提升釀酒酵母的乙醇耐受性[29]，精氨酸可以抑制酵母體內活性氧（reactive oxygen species，ROS）的生成，從而對乙醇誘導的細胞壁、細胞膜和細胞內細胞器起到保護作用[30]，HIRASAWA T等[31]研究發(fā)現(xiàn)，色氨酸合成基因（即TRP1，TRP2，TRP3，TRP4和TRP5）缺失則會導致酵母對乙醇脅迫更加敏感。

1.2.4 海藻糖合成酶基因

釀酒酵母乙醇耐受性與菌體海藻糖含量有著密切的聯(lián)系，高濃度乙醇誘導海藻糖合成酶基因和降解酶基因的表達，促使酵母生成大量的海藻糖來抵御乙醇脅迫[24]。與海藻糖合成代謝密切相關的基因主要有海藻糖合成基因和海藻糖酶基因。海藻糖合成基因主要有TPS1、TPS2和TLS1；海藻糖酶基因主要有中性海藻糖酶基因NTH1、NTH2和酸性海藻糖酶基因ATH1[8，32]。不同倍體釀酒酵母在高濃度酒精中的基因表達存在差異，ZHANG K等[33]通過轉錄組分析得出單倍體和三倍體釀酒酵母基因TPS1、TPS2和TLS1上調程度比基因NTH1、NTH2和ATH1上調程度高，從而使釀酒酵母積累更多海藻糖。釀酒酵母在不同時期的基因表達略有差異，YI C F等[34]研究發(fā)現(xiàn)，生長指數期的釀酒酵母基因NTH1和NTH2表達下調，海藻糖分解量減少，海藻糖累積量增加。生長穩(wěn)定期的釀酒酵母基因NTH1、NTH2、TPS1和ATH1表達上調，TPS2表達下調，從而使釀酒酵母菌體海藻糖達到穩(wěn)定趨勢。

乙醇誘導海藻糖合成基因表達生成大量海藻糖，但過量海藻糖抑制熱激蛋白發(fā)揮穩(wěn)定蛋白質的作用，海藻糖酶基因表達使海藻糖降解，有利于發(fā)揮其他應激物質的保護作用[20]。因此，海藻糖合成基因和海藻糖酶基因共同賦予釀酒酵母抵御乙醇脅迫的能力。

2 海藻糖與釀酒酵母乙醇耐受性的相關性

海藻糖是由葡萄糖分子通過半縮醛羥基縮合構成，是一種非還原性二糖[9]，海藻糖穩(wěn)定性強，只有海藻糖酶才會將其分解成葡萄糖[35]。海藻糖具有高度水合能力和強穩(wěn)定性等優(yōu)勢，在脅迫環(huán)境中起到維持生物大分子結構和功能的作用[11]，是評價酵母乙醇耐受性的重要指標[36]。

海藻糖是酵母在脅迫條件下的保護劑，酵母存活率隨著菌體海藻糖累積量增加而增加[37-38]。當酵母處在致死濃度的乙醇中，海藻糖起到穩(wěn)定酵母細胞膜、保護細胞質蛋白和修復變性蛋白的作用[8，39]，還可以幫助菌體蛋白進行適當折疊和修復，防止蛋白質聚集和羰基化[22，40-41]，通過取代酵母細胞膜上的水和乙醇，與脂質極性基團之間形成氫鍵，穩(wěn)定膜結構[43]。除此之外，海藻糖在流體條件下可以維持脂質雙分子層結構，海藻糖還是抵御細胞內部和外部乙醇毒性的重要物質之一，能夠防止乙醇誘導的酵母細胞和羧基熒光素捕獲的脂質體模型系統(tǒng)中的電解質流失[22]。

2.1 酒精脅迫條件下釀酒酵母基因的變化

一些學者采用進化差異理論的誘變技術分離酵母突變菌株并進行乙醇沖擊實驗，結果發(fā)現(xiàn)，海藻糖合成基因TPS1、TPS2、TPS3和TSL1表達水平呈現(xiàn)上調的趨勢，這表明乙醇誘導海藻糖合成基因的表達以產生更多海藻糖抵御乙醇脅迫[44-45]。MAHMUD S A等[8]將中性海藻糖酶基因NTH1、NTH2和酸性海藻糖酶基因ATH1同時敲除，將海藻糖酶缺陷菌株進行乙醇耐受性實驗，結果表明，缺陷菌株海藻糖合成基因TPS1和TPS2表達增強，缺陷菌株海藻糖含量比原始菌株FY834高，通過實驗得出過表達基因TPS2產生的海藻糖含量高于過表達基因TPS1產生的海藻糖含量。

釀酒酵母在高濃度乙醇中，除了海藻糖合成基因表達增強外，中性海藻糖酶基因和酸性海藻糖酶基因表達也會增強。TAO X L等[45]以釀酒酵母敏感菌株Z5和耐酒精菌株SZ3-1為實驗對象，用體積分數10%的酒精進行沖擊實驗，發(fā)現(xiàn)海藻糖合成基因TPS1、TPS2、TPS3和TSL1表達水平呈現(xiàn)上調的趨勢；除此之外，酸性海藻糖酶基因ATH1和中性海藻糖酶基因NTH1的表達水平也呈現(xiàn)上調趨勢。

2.2 外源海藻糖與乙醇耐受性的關系

高濃度乙醇會損害釀酒酵母體內代謝過程，使酵母無法產生大量海藻糖來抵御乙醇脅迫[40]。酵母菌獲取能量和營養(yǎng)物質的主要途徑是培養(yǎng)基，一些學者研究發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基中加入海藻糖，可以有效提高釀酒酵母的乙醇耐受性[3，46]。劉琦等[47]將葡萄酒泥酵母中的海藻糖提取物以300 mg/L的添加量加入到模擬葡萄汁中，研究其對酵母乙醇耐受性的影響。結果表明，酵母在穩(wěn)定期的生物量和存活率都大幅提高，說明海藻糖可以提高酵母的乙醇耐受性。由此得出，外源添加海藻糖提高釀酒酵母乙醇耐受性，可以有效改善釀酒酵母發(fā)酵特性，有利于酒精工業(yè)的發(fā)展。

3 展望

盡管DNA芯片、基因工程、基因組學和轉錄組學技術的發(fā)展，使得酵母的乙醇脅迫機制的研究已經深入到分子遺傳學層次，但海藻糖對釀酒酵母的保護機理還未有統(tǒng)一定論。目前，國內外學者的研究重點主要集中在內源海藻糖提高釀酒酵母乙醇耐受性的機理，但對于外源海藻糖與釀酒酵母之間的結合位點和相互作用力以及其他作用機理研究較少。因此，研究外源海藻糖提高釀酒酵母乙醇耐受性對于發(fā)酵工業(yè)具有重要意義。