早期梅毒患者治療前后白細胞介素-27、33和γ干擾素的檢測及分析

蒲新露

梅毒（syphilis）是由梅毒螺旋體（Treponema pallidum）引起的一種慢性傳染性疾病，主要通過性接觸及血液傳播[1,2]。近年來，發(fā)病率有上升趨勢。梅毒早期以侵犯皮膚黏膜損害為主，晚期常伴有心血管、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、骨骼及眼等器官的器質性損害[3]。有學者認為梅毒血清學固定的發(fā)生與患者免疫功能異常相關[4,5]。

近年來，國內(nèi)外已有相關文獻報道Th1 型細胞因子在清除梅毒螺旋體的免疫應答中起重要作用，而Th2 型細胞因子則在血清不轉陰的患者中占優(yōu)勢[6]，其中分別以白細胞介素(IL)-27 及IL-33 為主。本研究將探討IL-27、IL-33 分別作為Th1、Th2 細胞的活化因子在梅毒患者清除體內(nèi)梅毒螺旋體的免疫應答中所發(fā)揮的作用。探究早期梅毒患者在治療前是否已存在IL-27、IFN-γ 及IL-33 水平的差異及此差異是否影響其預后，為評估病情發(fā)展及進一步研究和有效治療梅毒患者提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象 隨機選取2015 年1 月―2015 年12 月至上海交通大學醫(yī)學院附屬新華醫(yī)院崇明分院就診的早期梅毒患者70 例，經(jīng)正規(guī)芐星青霉素G 驅梅治療6 個月后，根據(jù)治療效果將其分為梅毒血清轉陰組、梅毒血清未轉陰組，最終每組入選25 例，同時收集25 例正常健康人血清及全血標本作為對照組。分別抽取正常健康人、早期梅毒患者治療前后的血清及全血樣本用于本實驗檢測分析。實驗分組：對照組25 例（男13 例，女12 例），年齡 20 ～55 歲，平均年齡（35.6±5.7）歲；梅毒血清轉陰組25 例（男11例，女14 例），年齡18 ～57 歲，平均年齡（34.3±6.2）歲；梅毒血清未轉陰組25 例（男12 例，女13 例），年齡21 ～60 歲，平均年齡（35.8 ±5.6）歲。本研究已通過我院醫(yī)學倫理委員會的批準，獲得患者的知情同意。

1.1.2 納入標準 所有入選的梅毒患者診斷均符合中國疾病預防控制中心性病控制中心頒布的《性傳播疾病臨床診療與防治指南》，①年齡18 ～60 歲；②一期與二期梅毒或早期潛伏期梅毒；③血清快速血漿反應素環(huán)狀卡片試驗（RPR）滴度為1:4～1:32的患者。

1.1.3 排除標準 ①年齡＜8 歲或＞60 歲；②既往感染過梅毒；③并發(fā)嚴重的心、肺、肝、腎等器質性疾?。虎芊亲栽富蚓芙^參與此項臨床研究者。

1.1.4 試劑與儀器 IL-27，IL-33，IFN-γ 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測試劑盒（上海廣瑞生物科技有限公司），反轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）試劑盒（美國Invitrogen 公司），熒光定量PCR 試劑盒（2*SYBR Green/Flourescein qPCR Master Mix）（美國Fermentas 公司）。

1.2 方法

1.2.1 標本采集及ELISA 檢測 對入選的各組受試者在治療前、治療后分別采取外周血5 ml，放置于無菌離心管中以 3 000 r/min 離心5 min，吸取部分血清行RPR、梅毒螺旋體明膠凝集試驗（TPPA）檢測。早期梅毒患者血清RPR 滴度為1:4 ～1:32，剩余血清樣本分裝（標注姓名、性別、采集日期）后放置于-80℃冰箱儲存?zhèn)溆?。采用雙抗體夾心ELISA 法，嚴格按照所購試劑盒說明書對IL-27，IL-33，IFN-γ水平進行檢測，在450 nm 波長下用酶標儀測各孔吸光度（A值），所有A值減去空白對照值后進行計算。以不同濃度的標準品A值作標準曲線，根據(jù)樣品A值在標準曲線圖上查出相應IL-27、IL-33、IFN-γ 含量。

1.2.2 熒光定量RT-PCR 檢測血清中IL-27、IL-33 及IFN-γ 水平 對入選的各組受試者在治療前、治療后分別抽取5 ml 外周血，PBS 稀釋后加入淋巴細胞分離液，Trizol 提取總RNA，反轉錄合成第一鏈cDNA。引物序列：IL-27/P28 正向引物5'-GAGCAGCTCCCT GATGTTTC-3'，反向引物 5'-AGCTGCATCCTCTCCAT GTT-3'，IL-27/EBI3 正向引物 5'-TGTTCTCCATGGCT CCCTAC-3'，反向引物5'-GCTCCCTGACGCTTGTAAC-3'；IL-33 正向引物 5'-AAATGAATCAGGTGACGGTG TT-3'，反向引物 5'-CCACAGAGTGTTCCTTGTTGTTG-3'；IFN-γ 正 向 引 物5'-GAGTGTGGAGACCATCAAGGA AG-3'，反向引物 5'-TGAGTTCATGTATTGCTTTGCG T-3'；內(nèi)參照物β 肌動蛋白，正向引物5'-AGCGAGC ATCCCCCAAAGTT-3'，反向引物 5'-GGGCACGAAG GCTCATCATT-3'。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。實驗步驟參照SYBR green 熒光定量PCR 試劑盒說明書，PCR 反應體系為20 μl，反應條件：94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40 個循環(huán)。重復3 次。

1.2.3 觀察指標 觀察3 組患者治療前RPR 滴度水平，治療前與治療后IL-27、IL-33 與IFN-γ 水平，觀察實時熒光定量PCR 檢測3 組患者治療前與治療后IL-27、IL-33 與IFN-γ 水平，并分別比較3 組之間IL-27、IL-33 與IFN-γ 水平的差異性，并對其結果進行統(tǒng)計學分析。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 3 組患者年齡、性別、RPR 滴度的分析

3 組患者分別為25 例，其中男女性別比例血清轉陰組為11:14；血清未轉陰組為12:13；正常組為13:12，3 組之間性別比例差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。治療前血清轉陰組與血清未轉陰組其RPR 滴度在(1:4)、(1:8)、(1:16)、(1:32)的患者相應人數(shù)見表1，無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。

表1 正常對照組、梅毒血清轉陰組、梅毒血清未轉陰組臨床資料（n,±s）

表1 正常對照組、梅毒血清轉陰組、梅毒血清未轉陰組臨床資料（n,±s）

組別 例數(shù) 性別 治療前RPR滴度 年齡(y)男 女 1:4 1:8 1:16 1:32血清轉陰組 25 11 14 2 7 10 6 34.3±6.2血清未轉陰組 25 12 13 1 9 11 4 35.8±5.6正常對照組 25 13 12 0 0 0 0 35.6±5.7 P值 ＞0.05 ＞0.05 ＞0.05 ＞0.05 ＞0.05

2.2 3 組患者治療前后ELISA 檢測IL-27、IL-33 及IFN-γ 水平

治療前，3 組患者血清中IL-27 水平具有明顯差異，梅毒血清轉陰組、梅毒血清未轉陰組中IL-27 水平明顯高于正常對照組，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），梅毒血清轉陰組IL-27 水平高于梅毒血清未轉陰組（P＜0.05）。治療后，梅毒血清轉陰組、梅毒血清未轉陰組IL-27 水平仍顯著高于正常對照組，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而二者之間在治療后IL-27 水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），梅毒血清轉陰組在治療前后，IL-27 水平無明顯變化，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），梅毒血清未轉陰者治療后IL-27 水平高于治療前，二者之間差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表2。

治療前，梅毒血清轉陰組、梅毒血清未轉陰組IL-33 水平明顯高于正常對照組，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），梅毒血清轉陰組IL-33 水平與梅毒血清未轉陰組相比，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。治療后，梅毒血清轉陰組、梅毒血清未轉陰組IL-33 水平高于正常對照組，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），梅毒血清轉陰組在治療后，IL-33 水平較治療前顯著下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而梅毒血清未轉陰組、正常對照組在治療前后IL-33 水平無明顯變化，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表2。

治療前，3 組患者血清中IFN-γ 水平變化明顯，梅毒血清轉陰組、梅毒血清未轉陰組患者中IFN-γ 水平明顯高于正常對照組，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），梅毒血清未轉陰組IFN-γ 水平高于梅毒血清轉陰組，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。治療后，梅毒血清未轉陰組IFN-γ 水平高于正常對照組，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），梅毒血清轉陰組較正常對照組無明顯變化。梅毒血清未轉陰組在治療前后，IFN-γ 水平明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 治療前后3組患者IL-27、IL-33、IFN-γ水平ELISA檢測結果 （ˉx ±s，pg/ml）

2.3 治療前后3 組患者實時熒光定量PCR 檢測IL-27、IL-33 及IFN-γ 水平

治療前后3 組患者IL-27、IL-33 及IFN-γ 表達水平詳見表3。

表3 治療前后3組患者IL-27、IL-33、IFN-γ 水平PCR檢測比較 （ˉx ±s，pg/ml）

3 討論

梅毒是常見的性傳播疾病之一，晚期常伴有系統(tǒng)損害，發(fā)病率成上升趨勢。如若臨床上能夠做到早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療可極大預防或阻止晚期梅毒并發(fā)癥的發(fā)生。有研究指出，在梅毒的發(fā)病機制中體液免疫和細胞免疫發(fā)揮相關作用，存在Th1/Th2 失衡現(xiàn)象[7]，宿主對梅毒螺旋體的免疫應答以Th1 細胞應答為主，Th1 細胞介導的遲發(fā)型超敏反應是機體清除梅毒螺旋體最主要的免疫應答反應[8,9]。

IL-27 主要由活化的單核細胞和單核細胞來源的樹突狀細胞產(chǎn)生，在T 淋巴細胞增殖分化的早期，可以活化T-bet 促進CD4+T 淋巴細胞向Th1 方向分化，同時亦可協(xié)同IL-12 促進初始T 淋巴細胞產(chǎn)生IFN-γ，進而促使Th0 細胞向Th1 細胞分化[10]。IL-33 屬于IL-1 家族，是Th2 細胞活化因子，可促進Th2 細胞分泌IL-5、IL-13、IL-4 等細胞因子，IL-33 的分泌增加又對IFN-γ 等Th1 細胞因子的分泌產(chǎn)生抑制，最終使Th2 細胞的功能得到加強[11,12]。Th1 細胞分泌的細胞因子主要參與自身免疫反應性疾病及慢性感染性疾病當中，IFN-γ 是由Th1 細胞分泌產(chǎn)生，具有調控免疫應答，增強殺傷細胞活性的作用。而且IFN-γ 能夠激活自然殺傷（NK）細胞、中性粒細胞、血管內(nèi)皮細胞的活性來發(fā)揮免疫防御功能，增強機體的抗感染能力[13]。

從本實驗研究ELISA 及PCR 實驗結果可以看出，治療前血清轉陰組、血清未轉陰組以及正常對照組IL-27 水平之間存在顯著差異，其中以血清轉陰組治療前IL-27 水平最高，經(jīng)過規(guī)則治療后，血清轉陰組IL-27 水平輕度增加，而血清未轉陰組IL-27 水平顯著增加，此結果表明梅毒患者治療前體內(nèi)IL-27 基礎表達水平越高，患者血清梅毒特異抗體轉陰概率越大，且ELISA 結果與PCR 結果相一致。研究表明，IL-27 具有抗炎特性[14]。本研究表明，IL-27 在清除梅毒螺旋體中起著重要作用，這與IL-27 的抗炎特性明顯相關。

同時本研究結果顯示，治療前血清轉陰組與血清未轉陰組IL-33 水平之間無顯著差異，但二者明顯高于正常對照組，經(jīng)過規(guī)則治療后，血清轉陰組其IL-33 水平顯著下降，而血清未轉陰組水平輕度下降，且ELISA 結果與PCR 結果相一致。對于血清轉陰組，經(jīng)過治療后，其體內(nèi)IL-33 水平顯著降低，而對于血清非轉陰組而言，治療后IL-33 仍處于相對高水平狀態(tài)，表明IL-33 不利于機體清除梅毒螺旋體，這可能與IL-33 促進了Th2 反應有關。

之前研究已證實IFN-γ 是由Th1 細胞分泌，而在梅毒患者體內(nèi)，梅毒螺旋體能夠抑制Th1 的產(chǎn)生。目前研究表明IFN-γ 具有多種生物活性，可以促進巨噬細胞殺傷病原微生物[15]。本實驗研究ELISA 及PCR 實驗結果表明，治療前，血清轉陰組、血清未轉陰組以及正常對照組IFN-γ 之間存在顯著差異，其中以血清未轉陰組水平最高。通過正規(guī)驅梅毒治療后，血清轉陰組及血清未轉陰組患者IFN-γ 水平均顯著下降，ELISA 結果與PCR 結果相一致。這表明對于梅毒螺旋體患者，Th1 細胞分泌IFN-γ 來參與消除梅毒螺旋體，故通過監(jiān)測梅毒患者治療前后IFN-γ 水平，可以預測梅毒治療敏感性及效果。有研究表明，IFN-γ 在早期梅毒患者血清中表達較高，伴隨梅毒分期進展，其表達下降，提示免疫應答已由Th1 優(yōu)勢轉為Th2 優(yōu)勢[16]，其機制有待進一步研究。