不同溫度條件下PEG模擬干旱脅迫對水杉種子萌發(fā)的影響

吳漫玲 朱江 艾訓(xùn)儒 姚蘭 黃小 王進 朱強 陳紹林

摘 要： 水杉原生種群天然更新極差，林下鮮見幼苗和幼樹，種子萌發(fā)率低是造成天然更新困難的重要因素。為探究其種子萌發(fā)率低是否與水杉母樹原生地春季低溫有關(guān)，該文利用恒溫培養(yǎng)箱設(shè)置3種恒溫處理（15、20、25 ℃）和1種變溫處理（12 ℃/12 h和24 ℃/12 h，每24 h交替），并設(shè)置5種不同濃度的聚乙二醇（PEG-6000，0、0.05、0.10、0.15、0.20 g·mL-1）模擬干旱脅迫，來研究干旱脅迫對水杉種子萌發(fā)的影響。結(jié)果表明：（1）實驗所設(shè)置的溫度對水杉種子萌發(fā)無顯著影響（P>0.05），變溫條件下的水杉種子平均發(fā)芽率和發(fā)芽勢均為最高，分別為46.75%和21.25%;（2）不同濃度的PEG-6000溶液對其種子萌發(fā)產(chǎn)生顯著影響（P<0.05），水杉在15 ℃或25 ℃下，低濃度的PEG-6000溶液（0～0.10 g·mL-1）對水杉種子的發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)有促進作用，高濃度（>0.10 g·mL-1）的PEG-6000溶液對水杉種子的萌發(fā)有抑制作用，且隨著濃度的增大抑制作用也隨之增強，直到濃度增大為0.20 g·mL-1 時，水杉種子不再萌發(fā)。原生地春季低溫并不是造成水杉原生種群天然更新困難的因素，適當(dāng)?shù)母珊得{迫有利于增強水杉種子發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)，促使出苗整齊。

關(guān)鍵詞： 水杉， 原生地春季低溫， 發(fā)芽率， 發(fā)芽勢， 發(fā)芽指數(shù)

中圖分類號： Q945.34

文獻標(biāo)識碼： A

文章編號： 1000-3142（2020）11-1691-08

Abstract： Regeneration of original species of Metasequoia glyptostroboides is very difficult in nature， and seedlings and saplings are rarely seen under the forest. Low spring temperature in original habitat of M. glyptostroboides is an important factor causing the difficulty of natural regeneration. To explore whether the reason for the low seed germination rate is related to the spring low temperature of the original species of M. glyptostroboides. We used constant temperature incubator to set three kinds of constant temperature treatment（15， 20， 25 ℃）and one kind of temperature change treatment（12 ℃/12 h and 24 ℃/12 h， alternating every 24 h）; set five different concentrations of polyethylene alcohol（PEG-6000， 0， 0.05， 0.10， 0.15， 0.20 g·mL-1）mimics drought stress. The results were as follows：（1）The temperature set by the experiment had no significant effect on the germination of M. glyptostroboides seed（P>0.05）. The average germination rate and germination potential of M. glyptostroboides seeds under variable temperature conditions were the highest， which were 46.75% and 21.25%， respectively;（2）Different concentrations of PEG-6000 solution had significant effects on seed germination（P< 0.05）， at the temperatures of 15 ℃ or 25 ℃， low concentration of PEG-6000 solution（0-0.10 g·mL-1）promoted the germination potential and germination index of M. glyptostroboides seeds， high concentration（>0.10 g·mL-1）PEG-6000 solution inhibited the germination of M. glyptostroboides seed， and the concentration increase inhibition also increased， and until the concentration increased to 0.20 g·mL-1， the M. glyptostroboides seeds no longer germinated. The results indicate that the low temperature in the spring is not a factor that causes the natural regeneration of the original population of M. glyptostroboides， and appropriate drought stress is beneficial to enhance the germination potential and germination index of M. glyptostroboides seeds， and to promote the emergence of seedlings.

Key words： Metasequoia glyptostroboides， spring low temperature in original habitat， germination rate， germination energy， germination index

水杉（Metasequoia glyptostroboides）是我國著名的柏科（Cupressaceae）孑遺植物，有植物界“活化石”之稱，在《中國植物紅皮書》中被列為一級保護植物，同時選列為《全國極小種群野生植物拯救保護工程規(guī)劃（2011-2015年）》優(yōu)先保護的120種極小種群之一，在國際自然保護聯(lián)盟（International Union for Conservation of Nature）瀕危保護名錄中被列為極危植物（IUCN， 2018）。水杉原生母樹年齡結(jié)構(gòu)分配不均，呈現(xiàn)“倒金字塔型”，林下鮮見幼苗和幼樹，天然更新困難（林勇等，2017），引種栽培區(qū)遺傳多樣性低，只有水杉原生種群保留著其最原始的基因庫（崔敏燕，2011），原生水杉母樹部分分布在人們的房前屋后，受人為活動干擾嚴重，種群處于衰退的狀態(tài)。對水杉原生種群的保護一直受到國內(nèi)的重視和世界的關(guān)注（Chaney，1948;Fulling，1976;李媛媛，2006）。

繁殖是種群更新復(fù)壯的途徑，有研究表明水杉種源限制是影響水杉天然更新困難的重要障礙因素（劉玉配，2015）。有學(xué)者研究過水杉種子發(fā)芽條件（廖邵忠和周萬良，1989;尤冬梅，2008;李淑嫻等，2012）。辛霞等（2004）研究水杉種子萌發(fā)的生理生態(tài)特性研究，發(fā)現(xiàn)水杉種子最適發(fā)芽溫度為24 ℃，因此認為水杉林下缺少幼苗可能與原生地春季溫度過低有關(guān)。張嵐（2011）研究地下水位、光照強度和種子的埋藏深度對水杉種子萌發(fā)和幼苗生長的影響，發(fā)現(xiàn)水杉種子適宜萌發(fā)水位為0 cm，由此推測水杉原生地的地下水位太低可能是造成水杉種群天然更新困難的原因。眾多學(xué)者對水杉天然更新困難的原因及水杉種子的萌發(fā)特性進行研究，但尚未就水杉原生地春季溫度對水杉種子萌發(fā)的影響進行研究。因此，本研究針對水杉原生母樹原生地春季（即水杉種子萌發(fā)和幼苗生長的季節(jié)）的溫度情況，設(shè)置包含變溫在內(nèi)的4種不同溫度條件和5種不同的PEG-6000溶液濃度模擬干旱脅迫梯度探究其對水杉種子萌發(fā)的影響，一方面可以驗證水杉原生地春季低溫是否是造成水杉種子萌發(fā)困難的原因，為水杉天然更新困難的障礙因素進行補充說明，另一方面結(jié)合干旱脅迫，探究在不同溫度和水分情況下水杉種子的萌發(fā)指標(biāo)，為人工繁育水杉技術(shù)做一些理論和實踐參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗種子采自湖北省利川市忠路鎮(zhèn)拱橋村原生水杉母樹 1091 號，樹齡155年，樹高 37 m，胸徑 94.6 cm，生長地理位置為 108°35′37.5″ E、30°07′9.9″ N，海拔 1 110 m。種子千粒重為3.52 g。試驗試劑為聚乙二醇（PEG-6000），化學(xué)藥品為分析純。試驗儀器主要有超凈工作臺，JY3002電子天平，YGZ-300F恒溫光照培養(yǎng)箱，冰箱等。

1.2 方法

1.2.1種子采集與處理 2017年 10月份進行采種，采集球果后及時帶回實驗室陰干，等到球果完全裂開種子掉落后，將種子收集起來清理干凈后用密封袋封存放入 4 ℃ 冰箱冷藏備用（景丹龍等，2011）。

1.2.2 溫度設(shè)置 結(jié)合水杉原生地春季溫度變化范圍為12～24 ℃，將變溫設(shè)置為12 ℃/12 h和24 ℃/12 h，24 h交替，結(jié)合前人研究成果，認為水杉種子最適萌發(fā)溫度為20～25 ℃（辛霞等，2014;郭秋菊等，2018）。本實驗在此基礎(chǔ)上，采用恒溫箱設(shè)置3種恒溫溫度：15、20、25 ℃。

1.2.3 溶液配制 配制0.05 g·mL-1濃度的聚乙二醇（PEG-6000）溶液時，使用電子天平稱量聚乙二醇5 g，放入燒杯中，加入純水用玻璃棒攪拌直至試劑完全溶解，再次加入純水定容至100 mL。其他濃度溶液配制方法一致，共配制0.05、0.10、0.15、0.20 g·mL-1 4種濃度溶液。

1.2.4 實驗設(shè)計 實驗時采用四分法選取均一有代表性的種子，用90 mm透明塑料培養(yǎng)皿，使用前用1‰的高錳酸鉀消毒，純水沖洗干凈，放入 2 張90 mm濾紙，將種子均勻地放置其中，按照實驗設(shè)計加入純水和不同濃度的PEG-6000溶液（劉博等，2015），放置在設(shè)置為變溫（12 ℃/12 h和24 ℃/12 h，每24 h交替）、15 ℃、20 ℃、25 ℃的溫度箱中，設(shè)置12 h光照。共20個處理，每處理 50 粒種子， 3 個重復(fù)。

1.2.5 測定指標(biāo) 從種子放入溫度箱開始，每隔24 h對各培養(yǎng)皿中的種子進行觀察記錄，以肉眼看到的白色幼根為標(biāo)準來判斷種子是否萌發(fā)，持續(xù)觀察一個月，記錄每天的萌發(fā)種子數(shù)量。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理與分析 通過記錄的數(shù)據(jù)，對每種處理種子的發(fā)芽率（G）、發(fā)芽勢（Ga）和發(fā)芽指數(shù)（Ge）進行計算，計算公式如下。

采用 Excel 軟件記錄轉(zhuǎn)換數(shù)據(jù)，SPSS 22.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，對不同溫度和水分對水杉種子萌發(fā)指標(biāo)的影響結(jié)果進行方差分析和Duncan法多重比較，Origin 2018繪制統(tǒng)計圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同溫度與不同PEG-6000溶液濃度對水杉種子萌發(fā)的影響

由表1可知，水杉種子萌發(fā)指標(biāo)在變溫與其他溫度處理下沒有顯著差異（P>0.05），在不同PEG-6000溶液濃度下差異顯著（P<0.05），水杉種子發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)在不同溫度與不同PEG-6000溶液濃度的交互作用下差異極顯著（P<0.001），發(fā)芽勢差異顯著（P<0.05）。

2.2 不同溫度對水杉種子萌發(fā)的影響

由圖1可見，在相同的PEG-6000溶液濃度下，不同溫度下水杉種子發(fā)芽率沒有顯著差異（P>0.05）;發(fā)芽勢在0.05 g·mL-1和0.15 g·mL-1時差異不顯著（P>0.05），在0 g·mL-1和0.10 g·mL-1時差異顯著（P<0.05）;發(fā)芽指數(shù)在0.15 g·mL-1時無顯著差異（P>0.05），在0、0.05、0.10 g·mL-1時差異顯著（P<0.05）。變溫條件下水杉種子的平均萌發(fā)率最高，為46.75%，顯著高于溫度為15 ℃時的34.75%。平均發(fā)芽勢最高的是變溫和20 ℃條件下，為21.25%，顯著高于15 ℃條件下的11%，25 ℃條件下的平均發(fā)芽勢與其他溫度條件下的平均發(fā)芽勢沒有顯著差異（P>0.05）。15 ℃溫度條件下的平均發(fā)芽指數(shù)與變溫和20 ℃條件下的平均發(fā)芽指數(shù)差異顯著（P<0.05），為最低（3.54）。平均發(fā)芽指數(shù)最高的是20 ℃條件下，為12.75，是15 ℃條件下水杉種子平均發(fā)芽指數(shù)的3.6倍。

2.3 不同PEG-6000溶液濃度對水杉種子萌發(fā)的影響

本研究發(fā)現(xiàn)，PEG-6000溶液配制為0.20 g·mL-1時，水杉種子不萌發(fā)。由圖2可知，水杉種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)在不同PEG-6000溶液濃度處理下差異顯著（P<0.05），且均隨PEG-6000溶液濃度的增高呈現(xiàn)出下降的趨勢，下降趨勢由緩變快。說明PEG-6000模擬的干旱脅迫在總體上對水杉種子的萌發(fā)有抑制作用，過度的干旱脅迫導(dǎo)致水杉種子活力喪失。隨著PEG-6000溶液濃度上升，發(fā)芽指數(shù)的變化幅度最大，說明使用PEG-6000模擬干旱脅迫對發(fā)芽指數(shù)的影響程度最高，表明干旱脅迫越嚴重，水杉種子的活力指數(shù)越下降。

2.4 不同溫度與不同PEG-6000溶液濃度的交互作用對水杉種子萌發(fā)的影響

由圖3可知，不同溫度與不同PEG-6000溶液濃度的交互作用對水杉種子萌發(fā)有極顯著的影響（P<0.001）。發(fā)芽率最高的是變溫和25 ℃溫度條件下純水對照組的水杉種子，為54%，發(fā)芽率最低的是15 ℃溫度條件下PEG-6000溶液濃度為0.15 g·mL-1的水杉種子，為11%。在變溫和25 ℃溫度條件下，水杉種子的發(fā)芽率隨著PEG-6000溶液濃度梯度的增大而下降。在15 ℃溫度條件下，0.05 g·mL-1的PEG-6000溶液濃度的發(fā)芽率顯著高于其他組，為47%。在25 ℃溫度條件下，發(fā)芽率最高的是純水對照組，為54%，PEG-6000溶液濃度為0.10 g·mL-1（50%）高于0.05 g·mL-1濃度處理（44%）。發(fā)芽勢最高的是20 ℃溫度條件下純水對照組的水杉種子，為35%。在20 ℃溫度條件下，水杉種子發(fā)芽勢隨著PEG-6000溶液濃度的增高而下降。在15 ℃和25 ℃溫度條件下，水杉種子發(fā)芽勢最高都是在0.05 g·mL-1 的PEG-6000溶液濃度處理下，分別為21%和26%，而在變溫條件下，發(fā)芽勢最高的是0.10 g·mL-1的PEG-6000溶液濃度處理下。發(fā)芽指數(shù)最高的是20 ℃溫度條件下純水對照組的水杉種子，為20.7，在20 ℃和25 ℃溫度條件下，發(fā)芽指數(shù)隨著PEG-6000溶液濃度的增高而下降，而在變溫和15 ℃溫度條件下，發(fā)芽指數(shù)最高的為0.05 g·mL-1的PEG-6000溶液濃度處理。以上研究結(jié)果說明，在水杉種子能夠發(fā)芽的溫度范圍內(nèi)，當(dāng)溫度偏低或是偏高的時候，適當(dāng)?shù)倪M行干旱脅迫有利于激發(fā)水杉種子活力，促進萌發(fā)。

3 討論

成功的天然更新必須具備充足且有生命力的種子，以及適合種子萌發(fā)、支持幼苗成活和幼樹正常生長的環(huán)境條件，其中任何一個環(huán)節(jié)出現(xiàn)問題都會使天然更新發(fā)生障礙（李媛媛，2006）。水杉母樹產(chǎn)種量低，且呈現(xiàn)出“豐-平-歉-歉”的變化趨勢（王希群，1994），產(chǎn)種量不穩(wěn)定，且水杉種子在大田里發(fā)芽率僅為18%（尤冬梅和馬廣禮，2008），說明水杉種群天然更新存在種源不足、種質(zhì)差的缺陷。因此，適合種子萌發(fā)、支持幼苗成活和幼樹正常生長的環(huán)境條件對于水杉種群天然更新復(fù)壯就顯得尤為重要。近年來，水杉原生地環(huán)境對水杉原生種群天然更新的影響受到關(guān)注和重視，水杉原生母樹天然更新困難的障礙因素一直是近年來研究的熱點，有關(guān)的學(xué)術(shù)研討會議中，一般認為，導(dǎo)致水杉原生種群天然更新障礙的主要因素是林下活地被物、枯落物和人為干擾（如林下種植黃連）等。尤冬梅和馬廣禮（2008）探究了枯落物對水杉種子萌發(fā)和幼苗生長的影響，發(fā)現(xiàn)水杉種子質(zhì)量輕，難以通過厚積的枯落物接觸到土壤，影響了水杉種子的萌發(fā)，驗證了枯落物是影響水杉種子正常萌發(fā)的重要障礙因素。林勇等（2017）探究水杉原生母樹的種群結(jié)構(gòu)與動態(tài)，發(fā)現(xiàn)水杉原生母樹很多生長在人們的房前屋后、 道路旁邊等，受到人為剔枝、大量采種的影響，人為干擾嚴重，因此，認為人為活動也是影響水杉原生種群天然更新困難的重要因素。郭秋菊等（2018）結(jié)合水杉原生地硒元素含量高這一因素，探究不同的亞硒酸鈉溶液濃度對水杉種子萌發(fā)指標(biāo)的影響，發(fā)現(xiàn)低濃度的亞硒酸鈉溶液（0～0.25 g·mL-1）對水杉萌發(fā)有促進作用，高濃度的亞硒酸鈉溶液（0～0.25 g·mL-1）對水杉萌發(fā)有抑制作用。因此，水杉原產(chǎn)地硒元素含量對水杉種子的萌發(fā)有重要影響。本研究結(jié)果顯示水杉種子平均萌發(fā)率最高的是在變溫處理下，說明水杉原生地春季低溫并不是造成水杉種子難以萌發(fā)的因素。在15 ℃的溫度條件下，發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指標(biāo)均呈最低，說明低溫抑制了水杉種子的萌發(fā)。

PEG-6000因分子量大，不易進入植株細胞內(nèi)等特性，被廣泛用于抗旱研究領(lǐng)域（劉博等，2015）。研究發(fā)現(xiàn)PEG-6000模擬的干旱脅迫對水杉種子的萌發(fā)率有抑制作用，當(dāng)濃度>0.20 g·mL-1時，水杉種子不再萌發(fā)，這與張翠仙等（2019）對芒果種子萌發(fā)的研究結(jié)果一致。在15 ℃時，0.05 g·mL-1的PEG-6000溶液對水杉種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢有促進作用。在變溫處理下，0.10 g·mL-1的PEG-6000溶液下水杉種子的發(fā)芽勢和0.05 g·mL-1濃度下的發(fā)芽指數(shù)顯著高于其他處理。在25 ℃時，0.05 g·mL-1的PEG-6000溶液能夠促進水杉種子的發(fā)芽勢。低濃度的PEG-6000溶液對水杉種子萌發(fā)有一定的促進作用，這與王沛琦等（2019）PEG-6000溶液模擬干旱脅迫對紅花種子萌發(fā)的影響研究結(jié)果一致。發(fā)芽勢可以評價種子的發(fā)芽速度和發(fā)芽整齊度，發(fā)芽指數(shù)是種子的活力指標(biāo)，因此，可以認為PEG-6000模擬的干旱脅迫在溫度偏高或是偏低時，可以增強發(fā)芽速度和發(fā)芽整齊度。

種子的萌發(fā)常常被看作是種子植物生命周期的開始，種子的萌發(fā)率和萌發(fā)速率受環(huán)境條件的影響，其中溫度和光照是很重要的影響因素（辛霞等，2004）。水杉原生種群產(chǎn)種量低且不穩(wěn)定、自然狀態(tài)下種子發(fā)芽率低、幼苗生長環(huán)境不良等問題嚴重限制了水杉天然更新。因此，采用人工技術(shù)提高水杉種子萌發(fā)率對于水杉種群更新具有重要作用。本研究在實踐調(diào)查的基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)水杉原生種群缺少實生幼苗和幼樹，因此，要促進水杉種群的更新復(fù)壯，就需要用到人工技術(shù)來輔助水杉繁殖，利用有限的種子，提高其萌發(fā)率，能夠為水杉種群壯大幼苗庫，輔助其自然更新。本研究所得出的結(jié)論結(jié)合前人學(xué)者的研究結(jié)果，能夠為水杉原生種群的天然更新困難的障礙因素進行一些論證，對水杉人工繁殖技術(shù)提供一定的實踐指導(dǎo)意義。但本研究結(jié)果是在一定的實驗條件下得出的，有一定的局限性，水杉原生種群的天然更新困難的障礙因素需要更進一步的探究和發(fā)展。

4 結(jié)論

本研究通過基礎(chǔ)調(diào)查和設(shè)置實驗，結(jié)果顯示在24 h內(nèi)12 ℃/12 h和24 ℃/12 h交替進行的變溫條件下，水杉種子的平均萌發(fā)率和平均發(fā)芽勢均為最高，分別為46.75%和21.25%，因此，認為水杉母樹原生地春季低溫并未對水杉種子萌發(fā)造成抑制作用。同時在原生地野外環(huán)境下進行水杉種子萌發(fā)和幼苗生長特性探究，發(fā)現(xiàn) 3 個月內(nèi)水杉幼苗平均存活率達到70%以上，其中存在霉害作用和密度效應(yīng)，因此，也可以認為原生地春季低溫未對水杉幼苗的生長造成嚴重的負面影響。研究還發(fā)現(xiàn)，PEG-6000溶液模擬干旱脅迫過程中，當(dāng)溫度偏低或是偏高時，低濃度的PEG-6000溶液（0.05～0.10 g·mL-1）對水杉種子發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)有促進作用。因此，在進行水杉栽培繁殖過程中，可以采用適當(dāng)濃度的PEG-6000溶液來促進種子發(fā)芽和出苗整齊，濃度一般在0.05～0.10 g·mL-1之間為宜。

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（責(zé)任編輯 周翠鳴）