趙彥峰 賈冬冬

摘要?為探究不同胚性愈傷率小麥成熟胚的胚發(fā)育過程中的生化和顯微結(jié)構(gòu)特征，以不同胚性愈傷率的小麥基因型為材料，測定花后16、30 d小麥胚中的糖類、激素和活性氧的含量。結(jié)果顯示，較高胚性愈傷率基因型小麥花后30 d麥胚的赤霉素含量顯著大于低胚性愈傷率型，而其他生化指標(biāo)在2個(gè)發(fā)育階段差異不顯著。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，30 d胚的赤霉素含量與胚性愈傷率呈極顯著正相關(guān)，說明高胚性愈傷率的小麥胚可能在發(fā)育晚期具有較高的赤霉素含量。在對(duì)胚內(nèi)部結(jié)構(gòu)觀察中，并未發(fā)現(xiàn)2個(gè)發(fā)育階段不同小麥胚之間存在明顯差異。

關(guān)鍵詞?普通小麥;胚;胚性愈傷;胚發(fā)育;組織培養(yǎng)

中圖分類號(hào)?S?512.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼?A文章編號(hào)?0517-6611（2020）01-0007-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.01.002

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Study on Biochemical and Microstructure Characteristics of Wheat Embryos Development with Different Embryonic Callus Capacity

ZHAO Yan?feng1， JIA Dong?dong2

（ 1.Seed Management Center of Shaanxi Province， Xian， Shaanxi 710018; 2.College of Agronomy， Northwest A&F University/Key Laboratory of Wheat Biology and Genetic Improvement on Northwestern China， Ministry of Agriculture and Rural Affairs，Yangling， Shaanxi 712100）

Abstract?In order to investigate the biochemical and microstructure characteristics of wheat mature embryos with different embryonic callus capacity， the contents of carbohydrates， hormones and reactive oxygen species in wheat embryos at 16 and 30 days after anthesis were determined by using wheat genotypes with different embryogenic callus capacity as materials. The results showed that the content of gibberellin in wheat germ of high embryonic callus capacity genotype was significantly higher than that of low embryonic callus capacity genotypes at 30 days after anthesis， while there were no significant differences in other biochemical indicators between the two developmental stages. Correlation analysis showed that there was a significantly positive correlation between the gibberellin content in the 30?day embryos and the embryonic callus rate.Therefore， wheat embryos with high embryonic callus capacity may have a high gibberellin content in the late stage of development. In the observation of the internal structure of the embryos， there was no significant difference between the two developmental stages of different wheat embryos.

Key words?Triticum aestivum;Embryo;Embryonic callus;Embryo development;Tissue culture

小麥?zhǔn)俏覈谌蠹Z食作物，與水稻、玉米、大豆等主要農(nóng)作物相比，小麥轉(zhuǎn)基因育種進(jìn)度明顯滯后。普通小麥具異源六倍體特性，擁有龐大基因組，再者生產(chǎn)上缺乏高再生能力的小麥基因型、組織培養(yǎng)技術(shù)有待改善，嚴(yán)重限制了基因槍法及農(nóng)桿菌介導(dǎo)法等常規(guī)遺傳轉(zhuǎn)化方法在小麥轉(zhuǎn)基因中的運(yùn)用[1-2]。現(xiàn)階段轉(zhuǎn)基因小麥植株大多來自一些春性小麥如Bobwhite、Veery、Fielder及半冬性小麥如科農(nóng)199等。日本煙草公司開發(fā)的基于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化 “PureWheat”專利技術(shù)在模式基因型小麥Fielder、Bobwhite中表現(xiàn)較高的遺傳轉(zhuǎn)化效率，而在其他小麥基因型中表現(xiàn)一般[3-4]。但Fielder和Bobwhite等基因型小麥農(nóng)藝性狀較差，以其為受體獲得的轉(zhuǎn)基因材料很難直接生產(chǎn)應(yīng)用[5]。長期對(duì)小麥組織培養(yǎng)體系的廣泛研究發(fā)現(xiàn)，小麥不同外植體的再生能力差異顯著，幼胚再生能力相對(duì)最強(qiáng)，其次是花藥及幼穗，成熟胚再生能力較低。雖然小麥幼胚再生能力較強(qiáng)，但取材受到時(shí)間和空間上的局限，并且幼胚適宜轉(zhuǎn)化的生理狀態(tài)對(duì)組織培養(yǎng)條件要求較高，因而其應(yīng)用受到了較大限制。相對(duì)幼胚而言，成熟胚取材簡易，不受生長季節(jié)限制，是理想的組織培養(yǎng)及遺傳轉(zhuǎn)化對(duì)象，也是其他作物最常用的轉(zhuǎn)化受體材料。值得注意的是，研究證明基因型是幼胚愈傷組織器官發(fā)育建成的重要制約因子[6]，而成熟胚的誘導(dǎo)和分化與其基因型也關(guān)系密切[7]。前人雖對(duì)小麥高頻再生基因型及成熟胚組織培養(yǎng)再生體系進(jìn)行了篩選和優(yōu)化，但整體成熟胚再生能力迄今仍較為低下[8-11]。因此，開展以成熟胚為外植體的小麥組織培養(yǎng)體系研究依然具有必要性。

在小麥離體胚組織培養(yǎng)過程中，不同基因型小麥的成熟胚的胚性愈傷率差異顯著，多數(shù)基因型小麥利用成熟胚進(jìn)行組培雖然都能誘導(dǎo)出愈傷組織，乃至出愈率高達(dá)100%，但幾乎不會(huì)形成胚性愈傷組織或胚性愈傷組織非常低。而單子葉植物成熟胚發(fā)育經(jīng)過幼胚（包括球形期、梨形期、盾片期、子葉期）和成熟胚等階段。目前關(guān)于小麥胚在不同發(fā)育階段的生化特性和形態(tài)結(jié)構(gòu)特征與成熟胚誘導(dǎo)的胚性愈傷率是否具有相關(guān)性的研究鮮見報(bào)道。筆者對(duì)17份成熟胚誘導(dǎo)胚性愈傷率不同的小麥基因型開花后16、30 d這2個(gè)發(fā)育階段的胚生化指標(biāo)進(jìn)行測定和對(duì)細(xì)胞學(xué)形態(tài)進(jìn)行觀察，探索不同胚性愈傷率小麥胚的生化特點(diǎn)及形態(tài)結(jié)構(gòu)差異，以期為篩選小麥高效再生的基因型及優(yōu)化其組織培養(yǎng)體系提供借鑒。

1?材料與方法

1.1?材料

根據(jù)湯益等[12-13]研究結(jié)果，選取17種小麥基因型作為參試材料，材料均由西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部西北地區(qū)小麥生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。材料名稱、編號(hào)及胚性愈傷率見表1。

1.2?方法

1.2.1?小麥胚的采集。

試驗(yàn)于2017年4—6月在陜西楊凌（試驗(yàn)地坐標(biāo)108°04′26″E，34°17′49″N）進(jìn)行。對(duì)小麥中部小穗的開花授粉時(shí)期進(jìn)行掛牌標(biāo)記，在花后16、30 d（楊凌地區(qū)小麥一般在花后35 d左右進(jìn)入完熟期，30 d處于蠟熟期，易于剝?nèi)∨撸┎杉溗耄媒馄梳樠杆俨⑼暾貏內(nèi)⌒←溑?，將一部分胚置?80 ℃冰箱保存，用于生化指標(biāo)測量;另一部分置于FAA固定液中，用于胚的內(nèi)部顯微結(jié)構(gòu)觀測。

1.2.2?小麥胚生化指標(biāo)的測定。

參照逯平杰等[14]方法，采用高效液相色譜（HPLC）-蒸發(fā)光散射檢測器法測定小麥胚葡萄糖和蔗糖含量。制備樣品時(shí)將凍存的小麥胚在液氮中磨成粉末狀，精確稱取樣品粉末0.20 g，盛入10 mL EP管中，加入5 mL 80%乙醇，置于80 ℃水浴鍋加熱30 min，然后12 000 r/min離心20 min，取上清液95 ℃水浴加熱，待乙醇完全蒸發(fā)后，真空冷凍干燥濃縮。然后用HPLC級(jí)雙蒸水重溶樣品，12 000 r/min離心20 min，上清液凍存于-20 ℃冰箱中，經(jīng)0.22 μm無機(jī)相濾膜過濾后上機(jī)。將80%乙醇設(shè)置為對(duì)照組，每個(gè)樣品重復(fù)3次。

內(nèi)源細(xì)胞分裂素和赤霉素含量測定參考楊途熙等[15]的方法。用液氮將凍存的麥胚研磨成粉末狀，精確稱取樣品粉末0.20 g，盛入10 mL EP管中，加入8 mL預(yù)冷的80%甲醇，超聲10 min，置于4 ℃過夜浸提。然后4 ℃條件下15 000 r/min離心20 min，吸取的上清液在真空冷凍干燥器濃縮后，用0.1 mol/L乙酸調(diào)節(jié)pH至2.9，用乙酸乙酯萃取2次，合并酯相并濃縮，用流動(dòng)相溶解定容至200 μL，保存于-20 ℃冰箱，上機(jī)前用0.22 μm有機(jī)相濾膜過濾，每個(gè)樣品重復(fù)3次。

過氧化氫、超氧陰離子含量測定參照J(rèn)iao等[16]的方法。測定過氧化氫時(shí)用液氮研磨凍存的小麥胚成粉末狀，精確稱取樣品粉末0.20 g，加入1.8 mL 5%三氯乙酸，振蕩混勻，4 ℃條件下14 000 r/min離心20 min，上清液用17 mol/L氨水調(diào)節(jié)pH至8.4，將上清液均分兩部分，其中一部分作為空白對(duì)照，加入8 μg過氧化氫酶，室溫放置10 min。分別向兩部分加入1 mL反應(yīng)液（將20 mg 4-氨基安替比林，20 mg苯酚，5 mg過氧化物酶（150 U/mg）溶解在100 mL 100 mmol/L醋酸緩沖液（pH 5.6）），37 ℃水浴10 min，在505 nm條件下比色測定，每個(gè)樣品重復(fù)6次。測定超氧陰離子時(shí)準(zhǔn)確稱取樣品粉末0.20 g，加入1 mL 10 mmol/L的鹽酸羥胺、3 mL 65 mmol/L磷酸緩沖液（pH 7.8）和1 mL 0.1 mol/L的EDTA-Na（pH 8.0），4 ℃條件下14 000 r/min離心15 min，向1 mL上清液中加入1 mL 7 mmol/L 1-萘胺和1 mL 17 mmol/L 4-對(duì)氨基苯磺酸，25 ℃水浴10 min。以磷酸緩沖液作為對(duì)照，在530 nm條件下比色測定，每個(gè)樣品重復(fù)3次。

1.2.3?小麥胚內(nèi)部顯微結(jié)構(gòu)觀察。

將保存在固定液的小麥胚經(jīng)過沖洗、染色、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片（切片厚度定為8 μm）、貼片、烘片、脫蠟、固封過程，利用連續(xù)變倍實(shí)體顯微鏡SMZ1500觀察小麥胚的內(nèi)部結(jié)構(gòu)[17]。

1.3?數(shù)據(jù)分析與處理

使用Microsoft Office 2013（Microsoft Corp.，Redmond，WA，USA）和IBM SPSS Statistics 22.0（IBM，Corp.，Armonk，NY，USA）軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和差異顯著性分析、相關(guān)性分析。

2?結(jié)果與分析

2.1?不同基因型小麥胚發(fā)育過程中葡萄糖和蔗糖與成熟胚胚性愈傷率的關(guān)系分析

由圖1可知，不同胚性愈傷率基因型開花后16、30 d小麥胚的葡萄糖含量平均值分別為4.65、2.33 mg/g，變異系數(shù)為15.83%和30.75%，相應(yīng)同時(shí)期蔗糖含量平均值分別為25.66、40.23 mg/g，變異系數(shù)為13.45%和23.76%。小麥胚內(nèi)葡萄糖含量隨著胚的發(fā)育而降低，而蔗糖隨之增加。但不同胚性愈傷率小麥胚葡萄糖和蔗糖含量在2個(gè)時(shí)期均未表現(xiàn)出顯著差異。

2.2?不同基因型小麥胚發(fā)育過程中內(nèi)源細(xì)胞分裂素和赤霉素與成熟胚胚性愈傷率的關(guān)系分析

由圖2可知，不同胚性愈傷率基因型開花后16、30 d小麥胚的細(xì)胞分裂素含量平均值分別為2.61、8.71 μg/g，變異系數(shù)達(dá)39.97%和30.75%，相應(yīng)同時(shí)期赤霉素含量平均值分別為168.27、495.18 μg/g，變異系數(shù)為54.78%和44.98%。不同基因型小麥花后30 d胚內(nèi)源細(xì)胞分裂素和赤霉素含量波動(dòng)較大，其中赤霉素含量隨著胚性愈傷率的提高而增加，且較高胚性愈傷率型小麥胚赤霉素含量顯著大于低水平胚性愈傷率型。

48卷1期趙彥峰等?不同胚性愈傷率小麥胚發(fā)育過程生化和顯微結(jié)構(gòu)特征研究

2.3?不同基因型小麥胚發(fā)育過程中內(nèi)源活性氧（ROS）與成熟胚胚性愈傷率的關(guān)系分析

由圖3可知，不同胚性愈傷率基因型開花后16、30 d小麥胚的過氧化氫含量平均值分別為65.58、125.52 μg/g，變異系數(shù)為30.47%和39.73%;相應(yīng)同時(shí)期超氧陰離子含量平均值分別為25.60、18.31 μg/g，變異系數(shù)達(dá)12.30%和83.00%，說明不同基因型小麥花后16 d胚內(nèi)源活性氧含量表現(xiàn)穩(wěn)定，而在花后30 d表現(xiàn)出較大波動(dòng)。

2.4?不同基因型小麥胚發(fā)育過程中胚的生化指標(biāo)與成熟胚胚性愈傷率的相關(guān)性分析

將各生化指標(biāo)測定結(jié)果與胚性愈傷率作Pearson相關(guān)性分析，根據(jù)表2及圖4發(fā)現(xiàn)小麥花后30 d小麥胚的赤霉素含量與胚性愈傷率呈極顯著正相關(guān)（P<0.01），其他生化指標(biāo)與胚性愈傷率的相關(guān)性均未達(dá)到顯著水平。

2.5?不同胚性愈傷率的小麥胚內(nèi)部顯微結(jié)構(gòu)分析

小麥胚的發(fā)育在授粉后6～7 d進(jìn)入分化階段，最初由原胚分化出胚芽，然后出現(xiàn)胚芽鞘，同時(shí)胚根開始分化。分化大約在開花授粉后15 d結(jié)束。成熟胚包括有盾片（即子葉）、胚芽鞘、莖生長點(diǎn)、胚根、胚根鞘等部分。從每類胚性愈傷率小麥基因型中選取3個(gè)基因型，分別對(duì)開花后16、30 d的小麥胚內(nèi)部顯微結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察，從圖5、6可以看出，3種類型小麥胚在2個(gè)發(fā)育階段分別表現(xiàn)出細(xì)胞致密均勻且排列有序，盾片、胚芽鞘、胚根等均無明顯差異。

3?討論

為了提高小麥組織培養(yǎng)的再生率，人們通常關(guān)注的是如何改善培養(yǎng)基成分以及外源激素的種類和濃度比例[18]，而對(duì)小麥胚的發(fā)育特性及其與成熟胚胚性愈傷率的相關(guān)性研究鮮見報(bào)道。該研究對(duì)具有不同成熟胚胚性愈傷率的小麥胚在2個(gè)發(fā)育階段的部分生化指標(biāo)進(jìn)行測定，以探求不同胚性愈傷率材料之間胚發(fā)育過程的差異。

單子葉植物小麥的合子胚分化發(fā)育過程中胚內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)、淀粉等持續(xù)增加，同時(shí)種子體內(nèi)干物質(zhì)也發(fā)生積累、貯藏和脫水等一系列生理變化，一直到小麥胚的成熟[19]。淀粉作為植物細(xì)胞內(nèi)重要生物大分子能源物質(zhì)，經(jīng)淀粉酶水解成葡萄糖、蔗糖后，參與細(xì)胞內(nèi)各種生理、生化反應(yīng)，以直接或間接的方式影響胚狀體發(fā)生。陳金慧等[20]在對(duì)雜交鵝掌楸體細(xì)胞體外誘導(dǎo)時(shí)發(fā)現(xiàn)，以蔗糖為滲透劑，提高滲透壓有利于體細(xì)胞胚胎發(fā)生，推測蔗糖等糖類的積累有利于胚性細(xì)胞組織的形成發(fā)育。該研究測量了不同胚性愈傷率的麥胚在2個(gè)發(fā)育階段的葡萄糖和蔗糖含量，但不同胚性愈傷率的麥胚中并未發(fā)現(xiàn)顯著差異，說明小麥胚作為外植體在組織培養(yǎng)過程中，不同胚性愈傷率小麥胚發(fā)育過程中的葡萄糖、蔗糖含量對(duì)再生影響并不顯著，再生所需的大部分碳源更可能是由培養(yǎng)基提供的[21]。

小麥體細(xì)胞發(fā)育過程受到多種信號(hào)級(jí)聯(lián)機(jī)制的激活調(diào)控，生長素在植物胚胎發(fā)育過程中有著重要的調(diào)控作用，在胚胎的發(fā)育早期，生長素已經(jīng)開始對(duì)莖尖分生組織的形成發(fā)揮作用[22]，王義等[23]研究也表明生長素在人參體細(xì)胞胚胎發(fā)育早期達(dá)到最大值，在成熟胚階段下降。此外，細(xì)胞分裂素在胚胎發(fā)育過程中也起著重要作用，劉玉博[24]認(rèn)為合子胚干細(xì)胞和根尖干細(xì)胞的形成及分生組織的分化需要生長素的調(diào)控，而根尖干細(xì)胞的形成則需要細(xì)胞分裂素的參與。該研究中不同胚性愈傷率的小麥胚在2個(gè)發(fā)育階段的生長素和細(xì)胞分裂素并未有顯著差異，可能與取材時(shí)間有關(guān)。Hu等[25]研究發(fā)現(xiàn)，在擬南芥胚胎發(fā)育過程中，活性赤霉素的合成呈現(xiàn)出先升高后降低的時(shí)空特異性變化，并在晚期胚胎膨大階段達(dá)到頂峰。該研究也發(fā)現(xiàn)較高胚性愈傷率型小麥的麥胚赤霉素含量顯著高于較低胚性愈傷率型，這和Hu在擬南芥中的研究相吻合，推測小麥胚性愈傷形成與自身赤霉素含量可能存在重要聯(lián)系。

除了激素作為細(xì)胞間信號(hào)分子調(diào)控小麥胚的發(fā)育外，細(xì)胞內(nèi)部的胞質(zhì)氧化還原狀態(tài)也參與胚的發(fā)育調(diào)控。在擬南芥中，莖尖分生組織維持較高水平的O2·-和較低水平的H2O2有利于分生組織中干細(xì)胞的分化[26-28]。該研究中小麥胚的活性氧含量在胚性愈傷率不同的小麥基因型和小麥胚的不同發(fā)育階段均未表現(xiàn)出顯著差異，這說明小麥胚發(fā)育過程中活性氧的活動(dòng)對(duì)成熟胚的再生能力并沒有顯著影響，但值得注意的是，在枸杞體細(xì)胞胚發(fā)生過程中，在培養(yǎng)基中加入低濃度的H2O2對(duì)體細(xì)胞胚的發(fā)生有促進(jìn)作用[29]，說明低濃度的H2O2可能有利于體外胚胎的發(fā)生。

在考察不同發(fā)育階段小麥胚的生化特征與小麥成熟胚再生能力的關(guān)系時(shí)，考慮到小麥幼胚取材困難等因素，選取成熟胚胚性愈傷率作為衡量小麥再生能力的指標(biāo)，但是成熟胚胚性愈傷率不能代表所有發(fā)育階段小麥胚的再生能力，因此在以后的試驗(yàn)中應(yīng)分析不同發(fā)育階段小麥胚的再生能力與其對(duì)應(yīng)的生化特性。此外，考慮到外界條件諸如天氣、土壤肥力、病蟲害等因素對(duì)小麥胚發(fā)育的影響，小麥胚的生化差異也可能是由其他因素引起的，今后應(yīng)選用更多的小麥基因型進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)。

4?結(jié)論

該研究對(duì)2個(gè)發(fā)育階段不同胚性愈傷率小麥成熟胚的胚發(fā)育過程中生化指標(biāo)進(jìn)行測定，表明較高胚性愈傷率的小麥胚在發(fā)育晚期赤霉素含量較多。此結(jié)果在一定程度上可為探索篩選高效再生小麥基因型及優(yōu)化其組織培養(yǎng)體系提供參考依據(jù)，同時(shí)為探究和挖掘小麥再生性狀基因提供借鑒。

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