福建省常見尸食性蠅類的COⅠ及16S rDNA序列鑒定

卓犖，毛佳雄，陳建山，宋鵬，林澍，夏勝海，陳煌

（1.福建省公安廳刑事技術總隊，福建 福州 350003；2.光澤縣公安局，福建 光澤 354100）

死亡時間（postmortem interval，PMI）推斷一直是法醫(yī)學研究的重點和難點。近年來，建立在尸食性蠅類發(fā)育基礎上的死亡時間推斷是目前有效和精確的方法之一[1]，利用該方法的關鍵在于蠅類的種屬鑒定。傳統(tǒng)的形態(tài)學種屬鑒定需要專業(yè)且系統(tǒng)的昆蟲分類學知識[2-3]，絕大部分法醫(yī)工作者很難進行準確鑒別。隨著分子生物學技術的發(fā)展，DNA作為遺傳信息的載體，具有種屬特異性以及不受發(fā)育階段影響的優(yōu)勢，應用尸食性昆蟲種屬特異性的遺傳標記進行種屬鑒定，將有效解決依賴形態(tài)學的鑒定難題。因此，分子鑒定作為形態(tài)學鑒定方法的補充手段受到了法醫(yī)學者的廣泛重視[4]。本研究擬通過基于線粒體細胞色素c氧化酶亞基Ⅰ（cytochrome c oxidase subunitⅠ，COⅠ）和16S核糖體脫氧核糖核酸（ribosomal deoxyribonucleic acid，rDNA）基因片段序列對福建省常見尸食性蠅類的種屬進行分子鑒定，并探討兩種遺傳標記對于蠅類種屬鑒定的效力。

1 材料與方法

1.1 樣本

收集福建省福州、寧德、莆田、泉州、廈門、漳州、南平、龍巖、三明9個地區(qū)自然環(huán)境下常見尸食性蠅類樣本。選擇室外自然環(huán)境下發(fā)生的非正常死亡案件現場，用捕蟲網捕捉現場尸體表面停留的蠅類成蟲，置于75%乙醇溶液中處死，固定48h后用蒸餾水漂洗，放入通風櫥中通風干燥后保存。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取

取樣本胸肌組織置于1.5 mL微量離心管中研磨粉碎，加入20 mg/mL的蛋白酶K 10 μL，同時加入5% Chelex-100 150 μL，混勻后將其置于55℃水浴中消化過夜。消化完畢后，將離心管置于93℃下加熱10 min，使混合液中的蛋白質變性，取出后立即冰浴10min，以9391×g離心8min，取上清液置于4℃冷藏保存?zhèn)錂z。

1.2.2 PCR擴增

目前，針對尸食性蠅類線粒體COⅠ基因片段序列的引物設計擴增片段長度為272～1173bp[4]。過長的擴增序列對提取的DNA質量要求很高，測序結果需要拼接，容易產生錯誤，且成本較高，結合當前工作的實際情況，長片段序列不利于蠅類檢驗鑒定工作的推廣實施。本研究引物設計參考蔡繼峰[5]的研究報道，COⅠ擴增引物為：上游引物5′-CAGCTACTTTA TGAGCTTTAGG-3′，下游引物 5′-CATTTCAAGCTG TGTAAGCATC-3′，擴增片段長度278bp。16S rDNA擴增引物為：上游引物5′-CGCTGTTATCCCTAAGG TAA-3′，下游引物 5′-CTGGTATGAAAGGTTTGACG-3′，擴增片段長度289bp。

PCR 擴增體系為 30 μL，內含 10×PCR 緩沖液3 μL，dNTP混合物（2.5 mmol/L） 2 μL，上、下游引物（10μmol/L）各1μL，5U/μL的TaKaRa Ex Taq? DNA聚合酶0.2 μL，DNA模板2 μL，雙蒸水補足。PCR循環(huán)參數：96℃預變性5 min；96℃變性20 s，52℃退火30 s，72℃延伸1 min，共10個循環(huán)；96℃變性20 s，52℃退火30 s，72℃延伸1 min，共35個循環(huán)；72℃延伸5min，于4℃保存。

1.2.3 電泳檢測及測序分析

PCR擴增產物采用1%瓊脂糖凝膠電泳（80 V，50 min）后，將凝膠板置于波長為254 nm的紫外燈下觀察，利用凝膠成像系統(tǒng)拍照分析。擴增產物由北京六合華大基因科技有限公司測序。所得不同種屬實驗樣本的正反向序列經拼接后，通過DNAMAN 6.0軟件處理，截取278bp和289bp的相同長度核酸序列片段。所獲得的樣本COⅠ和16S rDNA的堿基序列片段，經BLAST（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）查詢，與數據庫中所有已知核酸序列進行序列同源性搜索和自動比對分析，比對完成后編輯樣本序列并上傳至GeneBank數據庫注冊。應用MEGA 10.0軟件計算種內及種間遺傳距離，選取模式為Kimura-2-parameter distance，并以非加權組平均法（unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA）構建系統(tǒng)發(fā)育樹，發(fā)育樹節(jié)點自展值（bootstrap confidence level，BCL）選擇Bootstrap方法進行檢驗，循環(huán)500次。

2 結 果

2.1 形態(tài)學鑒定結果

捕獲的22個樣本經形態(tài)學鑒定[6]共計3科5屬6種：大頭金蠅（Chrysomya megacephala）、緋顏裸金蠅（Achoetandrus rufifacies）、紫綠蠅（Lucilia porphyrina）、銅綠蠅（Lucilia cuprina）、棕尾別麻蠅（Sarcophaga peregrina）、家蠅（Musca domestica），具體種屬分類見表1。

2.2 堿基位點分析

所采集樣本16S rDNA基因片段序列的同源一致性達97.48%，其中：堿基A占39.50%～41.60%，平均值為40.98%；堿基C占12.20%～14.00%，平均值為13.30%；堿基G占6.30%～7.30%，平均值為6.84%；堿基T占38.10%～40.90%，平均值為38.86%。COⅠ基因片段序列的同源一致性達95.59%，其中：堿基A占28.50%～30.50%，平均值為29.11%；堿基C占15.30%～17.10%，平均值為15.77%；堿基G占14.70%～16.50%，平均值為15.83%；堿基T占37.70%～40.10%，平均值為39.30%。

2.3 序列種屬同源性比對分析

所采集樣本COⅠ和16S rDNA基因片段序列的同源性正確率分別達到90.90%和95.45%，其中COⅠ完全正確比對4個種屬（20個樣本），16S rDNA完全正確比對5個種屬（21個樣本）。種屬正確比對樣本的匹配一致性值（Max ident值）分別為：COⅠ在99.10%～99.71%，平均值為99.47%；16S rDNA在97.55%～100.00%，平均值為99.72%。紫綠蠅、銅綠蠅、緋顏裸金蠅、家蠅在兩個基因片段序列的同源性比對正確率均達100.00%，種屬比對情況見表2。

2.4 種內及種間遺傳距離

所采集樣本16S rDNA基因片段序列的種間遺傳距離為1.8%～9.3%，種間遺傳距離均數為1.8%～8.9%，種間最小遺傳距離出現在銅綠蠅與紫綠蠅之間，種間最大遺傳距離出現在棕尾別麻蠅和家蠅兩個不同科之間。不同蠅種的種內遺傳距離為0.0%～3.6%，種內遺傳距離均數為0.0%～2.4%，其中種內遺傳距離均數最大的為棕尾別麻蠅（2.4%），大頭金蠅的種內遺傳距離均數為0.6%，其余蠅種由于捕獲數量不足，種內遺傳距離范圍未能客觀反映。詳見表3。

表1 所采集地區(qū)常見尸食性蠅類的生物學分類Tab.1 Biological classification of common necrophagous flies in the collected area

表2 COⅠ及16S rDNA基因片段序列在GeneBank數據庫的比對情況Tab.2 Comparison of COⅠand 16S rDNA gene sequence fragments in GeneBank database

表3 各蠅種16S rDNA基因片段序列種間和種內的遺傳距離Tab.3 The interspecific and intraspecific evolutionary divergence of 16S rDNA

所采集樣本COⅠ基因片段序列的種間遺傳距離為6.7%～14.0%，種間遺傳距離均數為7.2%～13.6%，種間最小遺傳距離出現在緋顏裸金蠅與大頭金蠅之間，種間最大遺傳距離出現在棕尾別麻蠅和家蠅以及棕尾別麻蠅和大頭金蠅兩個不同科之間。不同蠅種的種內遺傳距離為0.0%～10.5%，種內遺傳距離均數為0.0%～6.3%，其中種內遺傳距離均數最大的為棕尾別麻蠅（6.3%），種內最大遺傳距離出現在大頭金蠅樣本中，為10.5%，其余蠅種由于捕獲數量不足，種內遺傳距離范圍未能客觀反映。詳見表4。

2.5 系統(tǒng)發(fā)育樹的構建

應用MEGA 10.0軟件對22個樣本的基因片段序列進行分析，構建UPGMA系統(tǒng)發(fā)育樹，按照不同科、屬、種聚類，分子鑒定結果與形態(tài)學結果一致。由16S rDNA序列構建的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1）可見：各地區(qū)的大頭金蠅聚集形成一個簇（BCL=95）；銅綠蠅各樣本形成一簇（BCL=100），并與紫綠蠅共同形成一簇，其共同的BCL值為92；緋顏裸金蠅、紫綠蠅、銅綠蠅以及大頭金蠅4種蠅類以種屬聚集成簇，其共同BCL值為81，構成了一個麗蠅科的簇；2只家蠅、3只棕尾別麻蠅分別聚集形成簇，其BCL值分別為100、94，與麗蠅科并列形成分支。由COⅠ序列構建的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2）可見：各地區(qū)的大頭金蠅聚集成簇（BCL=95），并與緋顏裸金蠅形成一簇；不同地區(qū)的銅綠蠅聚集成簇（BCL=100），并與紫綠蠅共同形成一簇；不同地區(qū)的棕尾別麻蠅、家蠅也分別各自聚集成簇，BCL值均為100。上述不同地區(qū)不同種屬的蠅類以種屬聚集成簇，不同地區(qū)之間的樣本聚集情況無明顯差異。

表4 各蠅種COⅠ基因片段序列種間和種內的遺傳距離Tab.4 The interspecific and intraspecific evolutionary divergence of COⅠ

圖1 各蠅種16S rDNA基因片段序列的系統(tǒng)發(fā)育樹（UPGMA）Fig.1 Phylogenetic tree of 16S rDNA of flies by UPGMA

3 討 論

分子鑒定方法作為形態(tài)學鑒定方法的補充手段，被越來越多的法醫(yī)昆蟲學者所接受[7-10]。其中，應用COⅠ及COⅡ序列對尸食性麻蠅進行分子鑒定被大多數學者所采用[11-13]，但其缺點在于對樣本質量要求高。近年來，尋找更易推廣且種屬鑒別力高的分子標記已成為昆蟲分子鑒定研究的熱點。線粒體16S rDNA是一種核糖體基因，在進化上較為保守，能夠很好地反映各物種種屬的進化，多應用于種屬鑒定、進化分析等方面[14]。

圖2 各蠅種COⅠ基因片段序列的系統(tǒng)發(fā)育樹（UPGMA）Fig.2 Phylogenetic tree of COⅠof flies by UPGMA

本研究結果表明，福建省常見尸食性蠅類線粒體16S rDNA及COⅠ基因片段序列的同源一致性較高。各蠅種的種內遺傳距離均數明顯低于種間遺傳距離均數，符合物種的遺傳多態(tài)性特征，并且與前期其他地區(qū)的調查性研究結果[1，9，15-17]一致。根據 WELLS等[18]的研究，當遺傳標記的種內遺傳距離<1%、種間遺傳距離>3%且與種間遺傳距離范圍無重疊，可應用于物種的分子鑒定。本研究中，不同蠅種16S rDNA和COⅠ基因片段序列的種內遺傳距離均數均明顯小于種間遺傳距離均數，其中，最為常見的大頭金蠅的16S rDNA種內遺傳距離均數為0.6%，且樣本最大種內遺傳距離小于最小種間遺傳距離，而16S rDNA基因片段序列種內最大遺傳距離見于棕尾別麻蠅樣本中，但仍然小于與其他蠅種的種間遺傳距離。因此，16S rDNA對于福建省常見尸食性蠅類的鑒別具有良好的效力，可作為福建省常見尸食性蠅類種屬鑒別的理想遺傳標記。相較而言，COⅠ基因片段序列在棕尾別麻蠅樣本的種內遺傳距離均數為6.3%，與其他蠅種種間遺傳距離范圍沒有交叉，表明COⅠ基因片段能夠對不同種屬的蠅種進行鑒別，但鑒別效力有待進一步驗證。此外，本研究發(fā)現COⅠ的種內最大遺傳距離為10.5%，與種間遺傳距離范圍有交叉重合。經分析，該結果為莆田地區(qū)捕獲的樣本，可能是由于不同地區(qū)大頭金蠅的種群差異和地理隔離引起該樣本的基因片段序列不同。

利用UPGMA對福建省常見尸食性蠅類樣本構建16S rDNA和COⅠ基因片段序列的系統(tǒng)發(fā)育樹，結果顯示，不同地區(qū)相同種屬的蠅種樣本先聚集成簇，并與近緣種屬形成姊妹簇或樹形的分支部分。兩個基因位點構建的系統(tǒng)發(fā)育樹結果顯示，聚類后BCL值多大于75%，說明聚類結果較可靠，且與形態(tài)學鑒定結果一致。所捕獲的22個樣本整體上被明確地分為麗蠅科、麻蠅科及蠅科三大分支，部分種屬的樣本形成了100%支持的獨立簇分支，說明利用16S rDNA和COⅠ基因片段序列可以很好地對不同蠅種的樣本進行區(qū)分。從系統(tǒng)發(fā)育樹也可以看出，COⅠ基因片段序列中對于本研究出現的1只基因片段序列不同于其他樣本的大頭金蠅并不能夠準確地鑒別，在發(fā)育樹中該樣本被錯誤地歸到蠅科這一分支中，說明COⅠ基因片段序列對于存在序列差異性的樣本的種屬鑒別存在一定局限性。而利用16S rDNA基因片段序列卻可以將該樣本歸入麗蠅科中，雖然并不能將其與緋顏裸金蠅完全區(qū)分，這主要是樣本序列差異程度所決定的，在前期研究[16，19]中也有類似結論的報道，表明16S rDNA對大頭金蠅與其他種屬的鑒別有更高的價值。

本研究中COⅠ和16S rDNA基因片段序列在GeneBank數據庫中的匹配一致性值（Max ident值）分別達到99.47%和99.72%。其中，16S rDNA對于紫綠蠅、銅綠蠅、緋顏裸金蠅、棕尾別麻蠅以及家蠅的同源性比對正確率均達到100%。不同蠅種的同源性比對中仍可見比對錯誤的樣本出現，這種錯誤比對的現象在前期研究中亦有報道，有學者認為在近緣蠅種間存在雜交，可導致樣本的基因序列出現錯誤比對或者與形態(tài)學鑒別不相符的現象[20-22]。因此，對于堿基差異較小的近緣種屬的鑒別仍較困難，同時可能因為數據庫中相關序列信息較少導致錯誤比對。隨著各蠅種全基因序列的完善，種屬的正確比對率將會進一步提高。

本研究通過對福建9個地區(qū)常見尸食性蠅類的調查研究并用16S rDNA及COⅠ基因片段序列進行種屬鑒別，發(fā)現福建省的常見尸食性蠅類以麗蠅科為主，分布最廣且最為常見的是金蠅屬的大頭金蠅。利用分子鑒定，線粒體COⅠ及16S rDNA兩種基因片段序列均能夠較為準確地對不同蠅種的種屬進行鑒別；相較于COⅠ，16S rDNA對福建省常見的麗蠅科尸食性蠅類的種屬鑒別價值更高，可以推廣應用于命案勘驗工作中精確鑒定尸食性昆蟲種類，為死亡時間推斷提供有力支撐。