王曉峰 倪益秀 莫少偉 程向東* 徐志遠(yuǎn) 呂航

胃癌是全球癌癥死亡相關(guān)的第二大主要原因，僅次于肺癌［1］。槐耳清膏是槐耳真菌的熱水提取部位，其臨床藥物槐耳金克顆粒已廣泛應(yīng)用于包括肝癌、乳腺癌、胃癌等多種癌癥中［2］?；倍继嵛锸腔倍婢恼〈继崛〔课?，且已證實(shí)能有效抑制人胃癌細(xì)胞的體外增殖［3］。已有研究報(bào)道槐耳水提物能與順鉑（DDP）、5-氟尿嘧啶（5-Fu）等化療藥物聯(lián)合使用能增加化療敏感性，槐耳醇提物和化療藥物的聯(lián)合使用卻較少報(bào)道［4］。多藥耐藥關(guān)聯(lián)蛋白1（MRP1）主要是谷胱甘肽（GSH）、葡萄糖醛酸等有機(jī)陰離子的活性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，通過(guò)主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)泵出細(xì)胞內(nèi)的外源性物質(zhì)和藥物從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性［5］。已有研究報(bào)道，在胃癌中，MRP1的表達(dá)與順鉑和5-氟尿嘧啶的耐藥相關(guān)［6］。2019年1月至7月作者通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證槐耳水提物的抗腫瘤作用，對(duì)比不同部位的槐耳粗提物的抗增殖效應(yīng)，探討槐耳醇提物與化療藥物聯(lián)合的可能性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器（1）細(xì)胞株：人胃癌細(xì)胞株MGC-803，BGC-823，AGS，HGC-27購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。（2）試劑：槐耳清膏購(gòu)于啟東蓋天力藥業(yè)有限公司，槐耳清膏溶于磷酸緩沖鹽溶液（PBS）中，配成100mg/ml，10ml于微孔濾膜過(guò)濾除菌后置于4℃保存待用；槐耳醇提物由浙江省中醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室提供，槐耳醇提物溶于二甲基亞砜（DMSO）中，配成100mg/ml，10ml微孔濾膜過(guò)濾除菌后置于4℃保存待用；順鉑、5-氟尿嘧啶購(gòu)于中國(guó)MCE公司，順鉑溶于二甲基酰胺（DMF）中，配成12mg/ml，2ml置于4℃保存待用，5-氟尿嘧啶溶于二甲基亞砜（DMSO）中，配成15mg/ml，2ml置于4℃保存待用。PSB、DMF購(gòu)于美國(guó)Hyclone公司；DMSO購(gòu)于美國(guó)Amresco公司；胎牛血清FBS、胰蛋白酶EDTA、RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)于美國(guó)Gibco公司；CCK-8試劑盒購(gòu)于杭州諾揚(yáng)生物技術(shù)有限公司。MRP1抗體購(gòu)于英國(guó)Abcam公司。β-actin購(gòu)于美國(guó)CST公司。RIPA裂解液購(gòu)于美國(guó)CST公司。BCA蛋白試劑盒購(gòu)于美國(guó)賽默飛公司。（3）儀器：生物安全柜、CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱、全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀購(gòu)于美國(guó)Thermo公司。

1.2 方法（1）細(xì)胞培養(yǎng)：人胃癌細(xì)胞MGC-803，BGC-823，AGS，HGC-27用 含 有10%胎 牛 血 清RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，并置于37℃5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中，隔天觀察，及時(shí)處理以確保細(xì)胞狀態(tài)。（2）CCK-8實(shí)驗(yàn)：收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MGC-803、BGC-823、AGS、HGC-27細(xì)胞，配制成5×104個(gè)/ml密度的細(xì)胞懸液，用排槍吸取細(xì)胞懸液接種至96孔板中，每孔100μl，并置于37℃5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。設(shè)立藥物組和對(duì)照組，藥物組設(shè)立6個(gè)濃度梯度且每個(gè)濃度設(shè)立3個(gè)復(fù)孔，對(duì)照組為不加任何藥物的RPMI-1640培養(yǎng)基，除此外另設(shè)空白組，加入1640培養(yǎng)基，但不含藥物和細(xì)胞，為1640培養(yǎng)基背景值。每孔加入100μl藥物或1640培養(yǎng)基后置于37℃5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。每孔加入10μlCCK-8溶液，于37℃5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1h后置于酶標(biāo)儀下測(cè)在450nm處吸光度。計(jì)算細(xì)胞抑制率=（OD對(duì)照組-OD藥物組）/（OD對(duì)照組-OD空白組）×100%。①單獨(dú)給藥：不同濃度的藥物（槐耳清膏、槐耳醇提物和DDP、5-Fu）對(duì)不同胃癌細(xì)胞的影響槐耳清膏濃度梯度為0、1.25、2.5、5、10、20mg/ml；槐耳醇提物為0、31.25、62.5、125、250、500μg/ml；DDP為0、3.75、7.5、15、30、60μg/ml（AGS、HGC-27和BGC-823），0、0.375、0.75、1.5、3、6μg/ml（MGC-803）；5-Fu為0、37.5、75、150、300、600μg/ml。實(shí)驗(yàn)步驟同上。（注：槐耳清膏和槐耳醇提物為中藥粗提物，為避免藥物沉淀，測(cè)吸光度時(shí)應(yīng)吸取到空白96孔板中）。②聯(lián)合給藥：槐耳清膏、槐耳醇提物聯(lián)合DDP、5-Fu對(duì)不同胃癌細(xì)胞的影響。計(jì)算不同胃癌細(xì)胞中不同藥物的IC10、IC20、IC30，設(shè)立聯(lián)合組和對(duì)照組，槐耳清膏和槐耳醇提物IC20、IC30分別聯(lián)合DDP和5-Fu的IC10、IC20、IC30。實(shí)驗(yàn)步驟同上。（3）蛋白質(zhì)印跡分析：收集各GC細(xì)胞，在含有蛋白酶抑制劑的RIPA緩沖液中裂解。使用BCA蛋白試劑盒定量蛋白質(zhì)濃度。電泳、轉(zhuǎn)膜，用含有5%牛血清白蛋白的TBST室溫封閉1h。然后用相應(yīng)的MRP1、β-actin的一抗4℃過(guò)夜孵育，用TBST洗滌3次，并與適當(dāng)?shù)亩乖谑覝叵路跤?h。用TBST洗滌3次后，曝光、顯影。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS23.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 槐耳清膏、槐耳醇提物、DDP、5-Fu單獨(dú)給藥對(duì)不同胃癌細(xì)胞增殖的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，槐耳水提物、槐耳醇提物和DDP、5-Fu對(duì)人胃癌細(xì)胞AGS、MGC-803、HGC27、BGC823的增殖有不同程度抑制，且呈劑量依賴性，見(jiàn)圖1?；倍甯鄬?duì)不同胃癌細(xì) 胞（AGS、MGC-803、HGC-27、BGC-823）的 半數(shù)抑制率（IC50）為10.62、4.032、5.494、4.560mg/ml；槐耳醇提物對(duì)不同胃癌細(xì)胞的IC50為165.3、97.24、203.9、166.7μg/ml；DDP對(duì)不同胃癌細(xì)胞的IC50為24.49、1.927、8.272、6.512μg/ml；5-Fu對(duì)不同胃癌細(xì)胞的IC50為117.2、236.8、88.34、234.3μg/ml。比較在不同胃癌細(xì)胞的增殖抑制率達(dá)50%時(shí)的劑量，槐耳清膏為4.031~10.62mg/ml，槐耳醇提物為97.24~203.9μg/ml，槐耳醇提物所需劑量小于槐耳清膏，表明在不同槐耳活性部位，醇提物的抑瘤效益好于水提物。

圖1 槐耳水提物、槐耳醇提物、順鉑、5-氟尿嘧啶對(duì)不同胃癌細(xì)胞增殖的影響

2.2 槐耳清膏、槐耳醇提物聯(lián)合DDP、5-Fu對(duì)不同胃癌細(xì)胞增殖的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，槐耳清膏和槐耳醇提物的IC20、IC30聯(lián)合DDP和5-Fu的IC10、IC20、IC30后均有效的增強(qiáng)化療藥物的腫瘤增殖抑制作用（見(jiàn)表1）。在各胃癌細(xì)胞中，DDP與槐耳水提物和醇提物的聯(lián)合中（見(jiàn)圖2A-D），以及5-Fu與槐耳水提物和醇提物的聯(lián)合中（見(jiàn)圖2E-H），醇提物的聯(lián)合效用優(yōu)于槐耳清膏。此外，隨著槐耳粗提物濃度的增加，這種增強(qiáng)化療藥物對(duì)胃癌細(xì)胞殺傷的聯(lián)合作用更加明顯。對(duì)比槐耳醇提物與順鉑、5-氟尿嘧啶的聯(lián)合作用（見(jiàn)圖3A-D），在同IC值的濃度下，醇提物與DDP的聯(lián)合作用比醇提物與5-Fu的聯(lián)合作用更加明顯。此外，低濃度的槐耳醇提物對(duì)化療藥物對(duì)胃癌細(xì)胞殺傷力的增強(qiáng)效果并不明顯。

表1 槐耳水提物、槐耳醇提物、順鉑、5-氟尿嘧啶對(duì)不同胃癌細(xì)胞的IC10、IC20、IC30值

圖2 槐耳水提物、槐耳醇提物聯(lián)合化療藥物（順鉑、5-氟尿嘧啶）后對(duì)不同胃癌細(xì)胞增殖的影響（*P<0.05、**P<0.01和***P<0.001）

圖3 順鉑、5-氟尿嘧啶聯(lián)合槐耳醇提物后對(duì)不同胃癌細(xì)胞增殖的影響（*P<0.05和**P<0.01）

2.3 槐耳醇提物能夠顯著抑制耐藥相關(guān)蛋白MRP1的表達(dá)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，用槐耳醇提物處理24h后的MRP1蛋白表達(dá)量顯著下調(diào)，表明槐耳醇提物增加各胃癌細(xì)胞對(duì)化療藥物順鉑和5-氟尿嘧啶的敏感性可能與下調(diào)MRP1表達(dá)有關(guān)。

圖4 槐耳醇提物通過(guò)抑制耐藥相關(guān)蛋白MRP1影響化療藥物的敏感性

3 討論

槐耳清膏是槐耳菌質(zhì)發(fā)酵后的熱水提取物，其活性成分主要是多糖蛋白，是一種易溶于水，含有多糖41.53%、氨基酸12.93%、水分8.72%棕褐色粉末?；倍甯啵ɑ倍鹂祟w粒）已證實(shí)對(duì)癌癥治療有明顯的療效［7］。在胃癌領(lǐng)域中，已有大量研究報(bào)道槐耳清膏能夠有效抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡，逆轉(zhuǎn)化療藥物的耐藥［8-9］。作者前期已經(jīng)通過(guò)系統(tǒng)溶劑法將槐耳提取為水、正丁醇、石油醚、乙酸乙酯、乙醇五個(gè)活性部位，并證實(shí)正丁醇部位對(duì)MKN-45細(xì)胞的抑制作用最佳［10］。

本資料結(jié)果表明，槐耳水提物和槐耳醇提物均能有效抑制不同胃癌細(xì)胞的增殖，且在同一抑制率中，醇提物的藥物劑量低于水提物，表明槐耳醇提物具有與槐耳水提物一樣的抗腫瘤作用，且抑制效率優(yōu)于水提物?；熕幬锶珥樸K、5-氟尿嘧啶等作為一線化療藥物廣泛應(yīng)用在胃癌領(lǐng)域。但化療藥物均存在諸多不良反應(yīng)，包括神經(jīng)毒性、耳毒性、免疫抑制等。已經(jīng)有大量研究驗(yàn)證槐耳水提物可以通過(guò)多種機(jī)制增強(qiáng)化療藥物的抗腫瘤作用。本資料表明，槐耳醇提物與化療藥物DDP、5-Fu聯(lián)用后能有效增強(qiáng)化療藥物對(duì)不同胃癌細(xì)胞的殺傷，且在發(fā)現(xiàn)槐耳醇提物與順鉑聯(lián)用更有效的增強(qiáng)化療藥物對(duì)胃癌細(xì)胞的殺傷作用。

本資料顯示，槐耳醇提物顯著下調(diào)MRP1的表達(dá)。MRP1是一種膜結(jié)合糖蛋白，賦予腫瘤細(xì)胞對(duì)包括順鉑、5-Fu在內(nèi)的多種化療藥物的抗性，是目前研究比較廣泛導(dǎo)致多藥耐藥（MDR）的機(jī)制之一?；倍继嵛镌黾禹樸K和5-Fu敏感性，可能是下調(diào)MRP1的表達(dá)，從而導(dǎo)致順鉑、5-Fu在胞內(nèi)濃度增加，增強(qiáng)化療藥物對(duì)胃癌細(xì)胞的殺傷。

綜上所述，槐耳醇提物在體外實(shí)驗(yàn)中的抗腫瘤作用優(yōu)于槐耳水提物，且槐耳醇提物和順鉑聯(lián)合使用明顯增強(qiáng)順鉑的腫瘤抑制作用，作者后續(xù)將從分子角度繼續(xù)進(jìn)行槐耳醇提物的抗腫瘤作用及如何提升順鉑的敏感性的機(jī)制研究。