張亞楠，徐景峨，蒲 齡，彭 珊，田青青，楊 莉，王 鑫，姜玲玲，余 波

(1.貴州省農業(yè)科學院 畜牧獸醫(yī)研究所，貴州 貴陽 550005； 2.貴州師范學院，貴州 貴陽 550000)

鴨疫里氏桿菌、大腸桿菌、多殺性巴氏桿菌、沙門氏菌是引起水禽細菌性疾病的常見致病菌[1-4]。由于致病菌往往具有較多的血清型，且各血清型間無明顯的交叉保護現(xiàn)象，導致疫苗在預防細菌性疾病上效果欠佳[1,5-6]?？咕幬镏委熓强刂萍毦〉某Ｓ梅椒ǎ瑫r也是控制細菌病流行性暴發(fā)的重要途徑。但是，由于細菌病發(fā)病時間不固定、頻率高，養(yǎng)殖場往往擅自使用高濃度抗菌藥物進行預防和治療細菌性疾病，導致細菌產(chǎn)生嚴重的耐藥性和抗菌藥物殘留，給養(yǎng)殖業(yè)和人類健康帶來危害[7-8]。

目前，中藥制劑作為抗生素替代品的研發(fā)成為研究熱點。中藥制劑具有廣譜抗菌抗病毒、提高機體免疫力、不易產(chǎn)生耐藥性、殘留小等方面的特點[9-10]。中藥五倍子及單體沒食子酸(即五倍子酸)對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌均有較好的抑制作用[10-11]。鞣花酸對大腸桿菌、沙門氏菌有較好的抑制作用[12]，秦皮乙素對產(chǎn)KPC型碳青霉烯耐藥肺炎克雷伯菌具有一定的抑制作用[13]。鑒于此，將石榴皮、苦參、秦皮配伍使用，經(jīng)提取和噴霧干燥制得的中藥復方制劑石苦秦散，對豬源大腸桿菌具有較好的抑菌效果，MIC和MBC分別介于7.81～15.63 g/L和15.63～31.25 g/L[9]。但是，中藥制劑對水禽源多重耐藥菌株的抑菌效果及殺菌效果研究相對較少。為此，探究石苦秦散及其6種主要活性成分(苦參堿、氧化苦參堿、秦皮甲素、秦皮乙素、鞣花酸、沒食子酸)單體對引起水禽疾病的常見菌種(鴨疫里氏桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌、多殺性巴氏桿菌、金黃色葡萄球菌)的抑菌作用，綜合評價中藥復方制劑石苦秦散對水禽源細菌病治療效果，為石苦秦散治療畜禽常見細菌性疾病提供理論依據(jù)，以期為“減抗化”生態(tài)養(yǎng)殖的發(fā)展提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 大腸桿菌ATCC?25922標準株、沙門氏菌ATCC?13076標準株、金黃色葡萄球菌ATCC?6538標準株均由貴州省畜牧獸醫(yī)研究所獸用中草藥研究室保存。5株鴨疫里氏桿菌、5株鴨源大腸桿菌、2株鴨源多殺性巴氏桿菌、2株鴨源沙門氏菌均由貴州省畜牧獸醫(yī)研究所畜禽疫病研究室分離保存。菌株具體信息見表1。

1.1.2 試劑與培養(yǎng)基 21種細菌藥敏紙片均購自杭州濱和微生物試劑有限公司。二甲基亞砜(DMSO)、無水乙醇、甲醇等購自廣州化學試劑廠。秦皮甲素、秦皮乙素、沒食子酸、鞣花酸、苦參堿、氧化苦參堿均購自西安開來生物工程有限公司。石苦秦散(包裝規(guī)格：100 g/袋；由石榴皮、苦參、秦皮經(jīng)水提后噴霧干燥制得， 批號：20180520)由貴州省農業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所、 成都乾坤動物藥業(yè)有限公司合作提供。

水解酪蛋白肉湯(MH broth)、水解酪蛋白瓊脂(MH agar)、木糖賴氨酸脫氧膽鹽瓊脂(XLD)、沙門氏菌顯色培養(yǎng)基(CHRO magarSalmonellaagar)、麥康凱瓊脂(Mac conkey agar)、甘露醇瓊脂、胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基(Tryptic soy agar，TSA)、胰蛋白胨大豆肉湯(Tryptic soy broth，TSB)等均購自廣州環(huán)凱微生物科技有限公司。酵母提取粉(Yeast extract)購自英國OXOID公司。新生牛血清購自北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 藥液制備 將每種中藥單體及石苦秦散復方制劑用相應的溶劑溶解，再加滅菌超純水定容，配制成一定質量濃度的母液，滅菌后置 4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。藥物配制所用溶劑和稀釋劑見?。

表1 14株鴨源分離株的信息Tab.1 Information of 14 isolates from duck farms

表2 石苦秦散及其主要活性成分單體的配制Tab.2 The preparation of Shikuqin powder and its main active component monomers

1.2.2 菌液制備 將大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌接種于含MH液體培養(yǎng)基的試管中，置于37 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)12 h。將多殺性巴氏桿菌接種于含MH液體培養(yǎng)基(含5%血清)的試管中，置于37 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)18 h。將鴨疫里氏桿菌接種于含TSB液體培養(yǎng)基(含0.5%酵母提取物、5%血清)的試管中，置于37 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)18 h。分別用其相應的液體培養(yǎng)基調整菌液的OD600為 0.8，再用培養(yǎng)基稀釋1 000倍，相當于菌液濃度為105～106cfu/mL，備用。

1.2.3 耐藥表型的測定 參照美國臨床實驗室標準化委員會(Clinical and laboratory standards institute，CLSI)的指導原則，采用藥敏紙片法檢測本研究中所用的3株標準株和14株分離株對21種抗菌藥物的敏感性。其中，以大腸桿菌ATCC?25922作為質控菌株。大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌所用培養(yǎng)基為MH瓊脂平板；多殺性巴氏桿菌所用培養(yǎng)基為加5%新生牛血清的MH瓊脂平板；鴨疫里氏桿菌所用培養(yǎng)基為加5%新生牛血清的TSA瓊脂平板。

由于缺少CLSI批準的適合鴨疫里氏桿菌的藥物敏感折點值，受試藥物的質控范圍及敏感折點值判斷標準主要參考CLSI動物源細菌藥敏試驗標準和人醫(yī)CLSI細菌藥敏試驗標準規(guī)定的適用于大腸桿菌的判定標準。藥敏試驗結果參考CLSI規(guī)定的敏感(Susceptible，S)、中介(Intermediate，I)、耐藥(Resistance，R)折點值范圍判斷結果。

1.2.4 最小抑菌濃度(MIC)的測定 采用微量肉湯二倍稀釋法，于無菌96孔板每一孔中均加入100 μL肉湯，再分別向第一孔中加入100 μL配備好的藥液，混勻后依次倍比稀釋，直到最后一孔混勻后棄去100 μL混合液。每孔加入配備好的100 μL細菌稀釋液。同時設置陽性對照組(加菌不加藥)和陰性對照組(不加菌不加藥)。此外，在正式試驗之前還需設置有機溶劑對照組，即對每株菌進行有機溶劑的對照試驗，將藥液換成有機溶劑(甲醇、乙醇和DMSO)，從而測定能保證所有供試菌株存活的最大溶劑含量，以便制備藥液所用的溶劑含量遠低于此值。37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后取出，觀察細菌生長情況。每組試驗至少重復3次。

采用TTC法對MIC結果進行判定。向上述培養(yǎng)24 h后的96孔板每孔分別加入20 μL 0.5%的2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)，37 ℃避光培養(yǎng)2 h，觀察菌液的顏色變化。試驗組眼觀溶液澄清、顏色未發(fā)生變化的最低藥物質量濃度則作為該藥的MIC。

1.2.5 最小殺菌濃度(MBC)的測定 將上述試驗組澄清的各孔中液體取100 μL涂布于相應的營養(yǎng)培養(yǎng)基上，于37 ℃培養(yǎng)48 h觀察結果。以肉眼觀察無菌落生長的最低藥物質量濃度為其MBC。

2 結果與分析

2.1 臨床分離株耐藥表型

以大腸桿菌ATCC?25922作為質控菌株，選用的藥敏紙片均在質控范圍內。沙門氏菌ATCC?13076除對林可胺類抗生素克林霉素耐藥外，對其余20種藥均敏感；金黃色葡萄球菌ATCC?6538對所選用的21種藥物均敏感，沙門氏菌ATCC?13076和金黃色葡萄球菌ATCC?6538作為敏感對照組。檢測到14株臨床分離株除PmSS5外，其余均為多重耐藥株。腸桿菌屬的大腸桿菌和沙門氏菌分離株耐藥性較強，耐藥種數(shù)最多，均高于8種，其中ECSS7耐藥種數(shù)高達13種；其次是鴨疫里氏桿菌，耐藥種數(shù)介于5～8種，主要是對氨基糖苷類耐藥嚴重。2株水禽源多殺性巴氏桿菌較為敏感，PmSS5僅對克林霉素和人工合成的抗菌藥磺胺異惡唑耐藥?？肆置顾剡m用于革蘭氏陽性菌引起的各種感染性疾病，對革蘭氏陰性菌作用效果差，通常用于治療厭氧細菌以及耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)的感染?；前奉愃幬餅楸容^老的人工合成抗菌藥物，14株分離株均對其耐藥(表3、4)。

表3 14株分離株對21種抗菌藥物的耐藥情況Tab.3 Resistance of 14 isolates to 21 antibiotics

續(xù)表3 14株分離株對21種抗菌藥物的耐藥情況Tab.3(Continued) Resistance of 14 isolates to 21 antibiotics

注:S為敏感，I為中介，R為耐藥。

Note:S is susceptible,I is intermediate and R is resistance.

表4 14株分離株的耐藥表型及耐藥種數(shù)Tab.4 Resistant phenotype and Resistant species of 14 isolates

2.2 石苦秦散及6種主要活性成分單體的抑菌作用

由表5可知，石苦秦散及6種單體對17株細菌均有抑菌作用。石苦秦散對17株細菌的MIC介于1.95～62.50 g/L；其中，對鴨疫里氏桿菌和多殺性巴氏桿菌的MIC介于1.95～15.63 g/L；對大腸桿菌、沙門氏菌以及金黃色葡萄球菌的抑菌效果相對弱一些，MIC介于15.63～62.50 g/L。

由圖1可看出， 6種單體抑菌能力最強的為秦皮乙素，其次為苦參堿、沒食子酸。苦參堿除對金黃色葡萄球菌6538的MIC(15.63 g/L)較高外，其余均低于7.81 g/L。氧化苦參堿除對鴨疫里氏桿菌的MIC相對較低，介于3.91～15.63 g/L，對其余4種細菌的MIC均大于31.25 g/L?？梢姡趸鄥A的抑菌作用明顯弱于苦參堿。秦皮甲素對革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌的MIC高于另外4種革蘭氏陰性菌，且對鴨疫里氏桿菌的抑菌作用最強，MIC介于3.91～7.81 g/L。秦皮乙素對革蘭氏陰性菌的抑菌效果也強于革蘭氏陽性菌，且對4種革蘭氏陰性菌的MIC均小于1.95 g/L。沒食子酸對鴨疫里氏桿菌和多殺性巴氏桿菌表現(xiàn)出較強的抑菌效果，對鴨疫里氏桿菌的MIC介于0.03～0.98 g/L，對多殺性巴氏桿菌的MIC為1.95 g/L。鞣花酸對不同種屬菌株的抑菌作用存在較大差異，對鴨疫里氏桿菌的抑菌效果最好，MIC介于0.49～1.95 g/L；鞣花酸對同種菌屬的不同細菌也存在差異，如大腸桿菌25922、ECSS7的MIC分別為0.98 g/L和0.49 g/L，而其他4株大腸桿菌的MIC均高于31.25 g/L。

大腸桿菌ATCC?25922標準株為敏感株，但和其他多重耐藥大腸桿菌相比MIC區(qū)別不大，說明石苦秦散及6種單體的抑菌作用與菌株的敏感程度無關。沙門氏菌ATCC?13076、金黃色葡萄球菌ATCC?6538、多殺性巴氏桿菌分離株PmSS5均為敏感株，和其他耐藥菌株相比未表現(xiàn)出較低的MIC。

2.3 石苦秦散及其6種主要活性成分單體的殺菌作用

由表5可知，石苦秦散及其6種單體對17株細菌均有殺菌效果。石苦秦散對17株菌的MBC介于1.95～125.00 g/L。6種單體體外殺菌試驗結果表明，當質量濃度達到31.25 g/L時，沒食子酸能殺死所有供試菌株，整體殺菌效果優(yōu)于其他5種單體(圖2)。氧化苦參堿、鞣花酸、秦皮甲素、秦皮乙素4種單體對大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌殺菌效果相對弱一些，MBC為125.00 g/L。秦皮乙素、沒食子酸對多殺性巴氏桿菌的MBC和MIC相等，分別為0.12 g/L和1.95 g/L，說明這2種中藥單體對多殺性巴氏桿菌的抑菌效果和殺菌效果相同。石苦秦散復方制劑和6種中藥單體對5株鴨疫里氏桿菌的MBC和MIC均相差不大，且均低于其他菌株，說明這些中藥對鴨疫里氏桿菌的抑菌效果和殺菌效果相對較好。

表5 石苦秦散及其6種主要活性成分單體的抑菌/殺菌效果

圖1 石苦秦散及6種有效成分單體對17株細菌的MIC分布

圖2 石苦秦散及6種有效成分單體對17株細菌的MBC分布

3 結論與討論

目前，治療水禽細菌性疾病主要是使用抗生素，然而不合理的使用加劇了多重耐藥菌株的出現(xiàn)[14-15]。本研究所用的14株分離株，90%為多重耐藥菌株，腸桿菌屬的大腸桿菌和沙門氏菌分離株最為耐藥，耐藥種數(shù)最多，均高于8種，其中大腸桿菌ECSS7耐藥種數(shù)高達13種，鴨疫里氏桿菌的耐藥種數(shù)介于5～8種，可見水禽源細菌耐藥性普遍嚴重，為水禽源細菌病的治療帶來很大難題。當前我國正在實施退出行動、減抗行動。減抗初期會導致治療抗菌藥用量增加、養(yǎng)殖生產(chǎn)性能下降以及食品動物感染性疾病發(fā)病率增加[16]，如何安全度過減抗期，發(fā)揮我國傳統(tǒng)中藥的優(yōu)勢，尋找新的抗生素替代物且不產(chǎn)生耐藥成為防治細菌性疾病的新途徑。

本研究發(fā)現(xiàn)，中藥復方制劑石苦秦散對鴨疫里氏桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌、多殺性巴氏桿菌、金黃色葡萄球菌均有抑菌作用和殺菌作用，MIC介于1.95～62.50 g/L，MBC介于1.95～125.00 g/L。YU等[9]報道的石苦秦散對仔豬腹瀉型大腸桿菌的MIC與MBC分別為7.81～15.63 g/L、15.63～31.25 g/L，與本研究中，石苦秦散對多重耐藥的大腸桿菌的MIC和MBC較為接近，說明石苦秦散對大腸桿菌普遍具有良好的抗菌效果。此外，石苦秦散對鴨疫里氏桿菌抑菌效果和殺菌效果明顯優(yōu)于其他菌株，MIC與MBC較低，且均介于1.95～15.63 g/L，在臨床上具有很高的應用價值[17]。由于鴨疫里氏桿菌極易產(chǎn)生耐藥性，尋求新的、安全可靠的治療方法是必要的。

6種中藥單體中，抑菌能力最強的為秦皮乙素，除對金黃色葡萄球菌6538的MIC較高(15.63 g/L)，對其余16株菌的MIC介于0.03～1.95 g/L。但是，秦皮乙素的殺菌效果因菌種不同而存在差異，其對鴨疫里氏桿菌和多殺性巴氏桿菌的殺菌效果較好，MBC介于0.03～0.49 g/L；而對大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌的MBC均高于62.50 g/L。值得注意的是，秦皮甲素和秦皮乙素對大腸桿菌都具有較好抑菌作用，MIC分別為15.63 g/L和0.49～0.98 g/L，這和DUNCAN等[18]報道的秦皮甲素和秦皮乙素能夠減少動物腸道中大腸桿菌數(shù)量相符。但是秦皮甲素和秦皮乙素對大腸桿菌的MBC分別為125.00 g/L和62.50～125.00 g/L，說明殺菌效果欠佳，這可能與大腸桿菌某些血清型有一定的關系。在6種中藥單體殺菌效果試驗中，對5種供試菌殺菌效果最好的為沒食子酸，當濃度達到31.25 g/L時，沒食子酸能殺死所有供試菌株，整體殺菌效果優(yōu)于其他5種單體。其中，沒食子酸對金黃色葡萄球菌的MIC和MBC分別為7.81 g/L和31.25 g/L，這與LIU等[19]的報道相符。

本研究中，中藥單體秦皮乙素、沒食子酸以及鞣花酸對鴨疫里氏桿菌均表現(xiàn)出良好的抑菌效果和殺菌效果，MIC為0.03～0.12 g/L、0.03～0.98 g/L和0.49～1.95 g/L，MBC與MIC相差不大，這些中藥單體為開發(fā)治療傳染性漿膜炎藥品提供了一個新的思路。鴨疫里氏桿菌本身具有產(chǎn)膜能力，而沒食子酸通過抑制細菌生物膜主要成分多糖的合成來抑制其形成，從而起到殺菌的效果[20]。同時，中藥單體秦皮乙素、沒食子酸對多殺性巴氏桿菌的MBC和MIC相同且較低，分別為0.12 g/L和1.95 g/L，在臨床上具有一定的使用價值，也為禽霍亂的治療提供了新的思路。

此外，本研究還表明，石苦秦散復方制劑和6種中藥單體的抑菌作用或殺菌作用，均與菌株對抗生素的敏感程度無關，這對中藥制劑控制細菌耐藥性提供了可能。