葉 婷，王興香，劉亞男，曹 宇，許抗抗，李 燦

(貴陽學(xué)院 生物與環(huán)境工程學(xué)院/貴州省山地珍稀動物與經(jīng)濟(jì)昆蟲重點實驗室，貴州 貴陽 550005)

汞(Hg)是一種環(huán)境中廣泛存在的有毒污染物，廣泛應(yīng)用于工業(yè)、家庭、農(nóng)業(yè)和醫(yī)療等多種行業(yè)，對人類健康和環(huán)境的潛在影響已引起廣泛擔(dān)憂[1]。兩棲動物有汞暴露和毒性的風(fēng)險。汞含量在以附著生物為食的南方豹蛙(Lithobatessphenocephalus)蝌蚪的飲食中相對較高，但不具有高生物利用度[2]。美國青蛙(Lithobatesgrylio)腿組織中的總汞含量非常高[3]，在沒有人為或地質(zhì)汞的地方石斛蝌蚪膳食中總汞含量為50～1 600 ng/g (干質(zhì)量)[4]。研究發(fā)現(xiàn)，汞污染場地兩棲動物體內(nèi)的汞含量超過參考汞含量1個數(shù)量級，某些情況下，兩棲動物體內(nèi)汞含量超過引起幼齡和成齡毒性反應(yīng)的閾值[5]。最近的研究發(fā)現(xiàn)，汞對兩棲動物種群的生存、生長和發(fā)育都有影響[6-7]。汞對青蛙(Xenopuslaevis)暴露后導(dǎo)致組織細(xì)胞谷胱甘肽水平降低并產(chǎn)生過多的活性氧，通過阻斷或氧化其巰基基團(tuán)降低硫轉(zhuǎn)移酶活性，從而導(dǎo)致組織尤其是心臟和睪丸中的硫烷硫含量降低，進(jìn)一步介導(dǎo)各種毒性效應(yīng)[8]。汞在大鯢生存的水體環(huán)境中含量雖然較低，但可通過食物鏈逐漸富集，從而對大鯢產(chǎn)生毒害效應(yīng)。在大鯢原生境水質(zhì)中檢測出汞含量低于10 ng/L，在大鯢肌肉中檢測出汞含量為0.023 mg/kg[9-10]。目前還沒有關(guān)于汞對大鯢生態(tài)毒理影響的報道。

抗菌肽(AMP)是先天免疫系統(tǒng)中機(jī)體抵御入侵微生物的一個關(guān)鍵組成部分[11]，在過去的幾十年中，抗菌肽由于其廣譜抗菌活性和降低細(xì)菌抗性而被認(rèn)為是潛在的新型藥劑[12]。CATH是結(jié)構(gòu)多樣的抗菌肽的主要家族，CATH在哺乳動物、爬行動物和魚類等許多不同脊椎動物物種中被鑒定，據(jù)報道，CATH在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用[13-15]。截至目前，大量的CATH已被鑒定和研究，這些CATH具有一般特征，一般情況下，CATH被合成為前體，其具有1個N末端的信號肽、1個保守的抗菌結(jié)構(gòu)域、1個不同序列和長度的C末端成熟抗菌結(jié)構(gòu)域[16-17]。CATH顯示出廣譜抗菌、抗病毒和抗真菌活性[18-20]。除了具有直接抗菌作用外，CATH在宿主免疫系統(tǒng)不同階段還具有其他調(diào)節(jié)作用，如抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)傷口愈合、降低脂多糖(LPS)引起的炎癥毒性效應(yīng)、刺激細(xì)胞因子、調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫應(yīng)答[21-24]。因此，CATH在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用，可作為潛在的藥物用于商業(yè)用途。多種脊椎動物的CATH已經(jīng)被鑒定研究，但許多兩棲動物物種的CATH還沒有被鑒定研究。據(jù)報道數(shù)據(jù)，僅鑒定了5種兩棲類CATH，包括牛蛙(Ranacatesbeiana)的CATH-RC1和CATH-RC2，綠點湍蛙(Amolopsloloensis)的CATH-AL，雙團(tuán)棘胸蛙(Paayunnanesis)的CATH-PY，以及脆皮大頭蛙(Limnonectesfragilis)的CATH1和CATH2[16,25-27]。然而，在兩棲類動物物種中大多數(shù)CATH都是從無尾類兩棲動物中鑒定出來的，在有尾目兩棲動物中發(fā)現(xiàn)較少。中國大鯢[Chinese giant salamander (Andriasdavidianus)]，屬于有尾目兩棲動物，是世界上現(xiàn)存最大的兩棲動物物種[28]。與其他兩棲動物一樣，大鯢皮膚也含有豐富的生物活性肽如抗菌肽和抗氧化肽[29-31]。此外，近年來，大鯢正在成為中國重要的商業(yè)水產(chǎn)養(yǎng)殖品種，但是養(yǎng)殖水體中存在的一些污染物如汞可能對大鯢產(chǎn)生免疫毒性反應(yīng)，破壞大鯢的免疫系統(tǒng)，進(jìn)而降低大鯢對病原體的抵抗能力，從而使大鯢患上嚴(yán)重的疾病，一些嚴(yán)重的疾病經(jīng)常影響到這個行業(yè)并帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失[32]。因此，了解汞對大鯢免疫系統(tǒng)關(guān)鍵因子如抗菌肽和抗氧化肽分子的基因表達(dá)影響極其重要。

描述了來自大鯢的3個新型CATH同源物，它們在皮膚、胰腺和心臟有表達(dá)，而且CATH在大鯢心臟和胰腺中的表達(dá)還沒有報道。在中國大鯢相關(guān)研究中，還沒有從生態(tài)毒理學(xué)角度分析環(huán)境HgCl2誘導(dǎo)下CATH成員CATH-2、CATH-3和CATH-BF在皮膚、心臟和胰腺中的表達(dá)變化模式。為此，檢測了經(jīng)HgCl2處理后CATH相關(guān)基因在皮膚、心臟和胰腺中的表達(dá)變化模式，旨在為評價HgCl2對大鯢的生態(tài)毒理影響提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

將采自貴州省修文市大鯢養(yǎng)殖戶的中國大鯢,置于大鯢人工養(yǎng)殖實驗室溫度為(19±1)℃的循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中進(jìn)行養(yǎng)殖。換水時要將水溫調(diào)節(jié)到與循環(huán)系統(tǒng)相同的水溫。在日常養(yǎng)殖中，避免用具交叉使用，用具用完后要用水洗凈。采集飼養(yǎng)在干凈水槽中的幼齡大鯢[(250±25)g]，在標(biāo)準(zhǔn)試驗條件下馴化2 d。

1.2 方法

1.2.1 HgCl2對大鯢的暴露試驗 將馴化后的大鯢暴露于CK(0 ng/L HgCl2)、HgCl2(1、10、100 ng/L)中，每個處理設(shè)置3個重復(fù)，每個重復(fù)含有3尾大鯢，暴露液每天更換一次。分別處理24、48、72 h后，用液氮凍存從預(yù)先麻醉的大鯢中分離的皮膚、胰腺、心臟組織，用于組織RNA的提取和實時定量RT-PCR(qRT-PCR)檢測。

1.2.2 總RNA的提取及cDNA 第一鏈的合成 取大鯢皮膚、心臟和胰腺組織加入液氮進(jìn)行研磨，使用TRIzol (Invitrogen公園)提取試劑盒根據(jù)說明書提取大鯢各組織的總RNA，提取后的RNA經(jīng)電泳檢測完整性和核酸濃度儀檢測純度及濃度以保證提取RNA的質(zhì)量，然后用DNA酶Ⅰ(Promega公司)去除基因組DNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(大連Takara公司)按照說明書將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

1.2.3 qRT-PCR分析 采用qRT-PCR技術(shù)檢測大鯢不同組織CATH基因的相對表達(dá)量。根據(jù)1.2.2中方法提取不同組織RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA后進(jìn)行實時定量PCR。用于熒光定量PCR的引物序列見表1。反應(yīng)體系為20 μL：GoTaq?qPCR Master Mix 10 μL、cDNA模板1 μL、不含Nuclease水7 μL和上、下游引物各1 μL。反應(yīng)在CFX96TM Real Time System 實時定量PCR儀 (Bio-Rad公司) 中進(jìn)行，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個循環(huán)；最后在60～95 ℃進(jìn)行熔解曲線分析。選擇表達(dá)相對穩(wěn)定的TATA框結(jié)合蛋白基因(TATA-box-binding protein gene,TBP)作為內(nèi)參基因，利用2-△△CT方法計算基因的相對表達(dá)量[33]。

表1 用于實時定量RT-PCR分析的引物Tab.1 Primers used in the real time quantitative RT-PCR analysis

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

試驗數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，并進(jìn)行方差齊性檢驗和正態(tài)性檢驗，如有必要需進(jìn)行對數(shù)轉(zhuǎn)換。采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(One-Way AVONA)和Turkey’s檢驗。置信水平P<0.05時差異顯著，置信水平P<0.01時差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 HgCl2對大鯢皮膚CATH-BF基因相對表達(dá)水平的影響

暴露 24、48、72 h后，HgCl2對大鯢皮膚CATH-BF基因相對表達(dá)水平的影響見圖1。結(jié)果顯示，HgCl2對大鯢暴露24 h后，大鯢皮膚CATH-BF基因表達(dá)水平相對于對照組均呈現(xiàn)下降變化趨勢，即1、10、100 ng/L HgCl2對大鯢暴露24 h顯著下調(diào)了大鯢皮膚CATH-BF基因表達(dá)水平，其中1、100 ng/L HgCl2對大鯢暴露24 h極顯著下調(diào)了大鯢皮膚CATH-BF基因表達(dá)水平(P<0.01)，10 ng/L HgCl2對大鯢暴露24 h顯著下調(diào)了大鯢皮膚CATH-BF基因表達(dá)水平(P<0.05)。10、100 ng/L HgCl2對大鯢暴露48 h顯著誘導(dǎo)了大鯢皮膚CATH-BF基因表達(dá)水平(P<0.05)，暴露48 h后，1 ng/L HgCl2對大鯢皮膚CATH-BF基因表達(dá)水平無顯著影響。HgCl2對大鯢暴露72 h對皮膚CATH-BF基因表達(dá)均無顯著性影響。

*表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)，下同

2.2 HgCl2對大鯢胰腺和心臟CATH-2基因相對表達(dá)水平的影響

暴露24、48、72 h后，HgCl2對大鯢胰腺和心臟CATH-2基因相對表達(dá)水平的影響見圖2。結(jié)果顯示，暴露24 h后，不同質(zhì)量濃度HgCl2對大鯢心臟CATH-2基因表達(dá)水平具有不同的影響，即1、10 ng/L HgCl2對大鯢暴露24 h極顯著下調(diào)了心臟CATH-2基因表達(dá)水平(P<0.01)，100 ng/L HgCl2對大鯢暴露24 h極顯著上調(diào)了心臟CATH-2基因表達(dá)水平(P<0.01)。10、100 ng/L HgCl2對大鯢暴露48 h后顯著下調(diào)了大鯢心臟CATH-2基因表達(dá)水平(P<0.05)，暴露48 h后，1 ng/L HgCl2對大鯢心臟CATH-2基因表達(dá)水平無顯著影響。暴露72 h后，HgCl2對大鯢心臟CATH-2基因表達(dá)均無顯著性影響。

圖2 HgCl2對大鯢胰腺和心臟CATH-2基因相對表達(dá)水平的影響Fig.2 Effects of HgCl2 exposure on the relative expression of CATH-2 in the pancreas and heart of Andrias davidianus

HgCl2對大鯢暴露24 h后，大鯢胰腺CATH-2基因表達(dá)水平相對于對照組均呈現(xiàn)下降變化趨勢，即10、100 ng/L HgCl2對大鯢暴露24 h顯著下調(diào)了大鯢胰腺CATH-2基因表達(dá)水平(P<0.05)，1 ng/L HgCl2對大鯢暴露24 h后，大鯢胰腺CATH-2基因表達(dá)水平相對對照無顯著變化。HgCl2對大鯢暴露48、72 h后，胰腺CATH-2基因表達(dá)均無顯著性變化。

2.3 HgCl2對大鯢胰腺和心臟CATH-3基因相對表達(dá)水平的影響

暴露24、48、72 h后，HgCl2對大鯢胰腺和心臟CATH-3基因相對表達(dá)水平的影響見圖3。結(jié)果顯示，暴露24 h后，不同質(zhì)量濃度HgCl2對大鯢心臟CATH-3基因表達(dá)水平具有不同的影響，即1、10 ng/L HgCl2對大鯢暴露24 h極顯著誘導(dǎo)了心臟CATH-3基因表達(dá)水平(P<0.01)，然而暴露24 h后，100 ng/L HgCl2對大鯢心臟CATH-3基因表達(dá)水平無顯著影響。HgCl2對大鯢暴露48、72 h后，心臟CATH-3基因表達(dá)均無顯著性變化。

暴露24、48、72 h后，HgCl2對大鯢胰腺CATH-3基因表達(dá)均無顯著性影響。

圖3 HgCl2對大鯢胰腺和心臟CATH-3基因相對表達(dá)水平的影響Fig.3 Effects of HgCl2 exposure on the relative expression of CATH-3 in the pancreas and heart of Andrias davidianus

3 結(jié)論與討論

CATH是一組在白細(xì)胞和上皮細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的陽離子肽，在哺乳動物物種早期先天免疫防御中起著重要作用，然而，CATH在兩棲動物中報道很少。多項研究結(jié)果表明，CATH具有強(qiáng)大的抗菌活性、抗炎癥功能及對哺乳動物細(xì)胞低毒性[16,26-27,34-36]。CATH在兩棲動物中國大鯢中報道更少，僅YANG等[37]報道從中國大鯢中首次識別和鑒定了在皮膚中高表達(dá)的CATH，這是在有尾兩棲動物研究中首次識別和鑒定抗菌肽，該研究還分析了重組抗菌肽潛在的抗菌活性。本研究發(fā)現(xiàn)，在受到外界環(huán)境HgCl2暴露時，大鯢皮膚、心臟和胰腺CATH的表達(dá)處于動態(tài)變化模式。據(jù)報道，大鯢養(yǎng)殖水體環(huán)境中存在一定水平的汞，汞暴露對兩棲動物尤其是大鯢心臟和胰腺CATH家族基因的影響還沒有報道。汞在一些哺乳動物體的各組織部位( 包括肝臟、腎臟、肺臟、脾臟、胰腺、肌肉和腦 ) 均檢出[38]，所以汞可能引起各組織部位的毒性效應(yīng)。到目前為止，大多數(shù)研究局限于汞誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性、腎毒性和肝毒性方面，有關(guān)汞誘導(dǎo)的皮膚、胰腺和心臟毒性研究較少。而汞誘導(dǎo)的皮膚、胰腺和心臟毒性研究也局限于大鼠、小鼠和人的細(xì)胞等一些模式物種。汞暴露被認(rèn)為是心血管疾病的重要因素，會增加心血管疾病的風(fēng)險，并導(dǎo)致嚴(yán)重的心臟毒性[39]。本研究從大鯢轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中鑒定了CATH家族CATH-BF、CATH-2和CATH-3等3個基因，分析在HgCl2暴露大鯢后這幾個基因在皮膚、心臟和胰腺組織中不同的表達(dá)模式，并且發(fā)現(xiàn)隨著HgCl2暴露時間的不同基因表達(dá)模式也會發(fā)生變化。

3.1 HgCl2對大鯢皮膚CATH-BF基因表達(dá)的影響

眾所周知，皮膚經(jīng)常暴露于各種微生物病原體，是抵御微生物感染的第一道防線。 通過大量研究，兩棲動物的顆粒狀皮膚腺體合成并釋放出多種抗菌肽，針對微生物提供有效和快速的防御作用。CATH是一種抗菌肽，其在皮膚中特異性表達(dá)表明其在針對大鯢細(xì)菌感染的先天免疫應(yīng)答中具有重要功能。HgCl2對大鯢暴露24 h顯著下調(diào)了大鯢皮膚CATH-BF基因表達(dá)水平。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，CATH-BF具有抗炎癥功能，可減輕外界刺激引起的皮膚炎癥毒性效應(yīng)[40-41]。推測HgCl2對大鯢短時間暴露導(dǎo)致大鯢皮膚CATH-BF基因表達(dá)水平的下降，從而引起皮膚分泌的CATH-BF蛋白水平下降，降低了對微生物的抵御能力及抗炎癥活性，介導(dǎo)各種炎癥性疾病。然而10、100 ng/L HgCl2對大鯢暴露48 h后通過免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)顯著誘導(dǎo)了大鯢皮膚CATH-BF基因表達(dá)水平(P<0.05)，說明環(huán)境中HgCl2暴露48 h會誘導(dǎo)大鯢皮膚CATH-BF基因表達(dá)，刺激皮膚分泌CATH-BF蛋白，抵抗HgCl2介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。暴露72 h，HgCl2對大鯢皮膚CATH-BF基因表達(dá)均無顯著性影響，說明免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)與外界環(huán)境HgCl2暴露達(dá)到平衡調(diào)節(jié)狀態(tài)。

3.2 HgCl2對大鯢心臟CATH-2和CATH-3基因表達(dá)的影響

汞處理可誘導(dǎo)小鼠和大鼠的心臟炎癥效應(yīng)[42-43]。而CATH相關(guān)抗菌肽可減輕心臟炎癥毒性[44]。因此，HgCl2對大鯢心臟CATH相關(guān)基因表達(dá)水平的影響有助于分析HgCl2對大鯢心臟的炎癥毒性效應(yīng)。本研究結(jié)果顯示，暴露24 h后，不同質(zhì)量濃度HgCl2對大鯢心臟CATH-2基因表達(dá)水平具有不同的影響，即1、10 ng/L HgCl2對大鯢暴露24 h極顯著下調(diào)了心臟CATH-2基因表達(dá)水平，說明1、10 ng/L HgCl2對大鯢暴露24 h可能導(dǎo)致心臟CATH-2蛋白水平下降，降低心臟對微生物以及外界環(huán)境污染物的抵御能力及抗性，增加心臟炎癥的風(fēng)險。然而100 ng/L HgCl2對大鯢暴露24 h極顯著上調(diào)了心臟CATH-2基因表達(dá)水平，說明100 ng/L HgCl2對大鯢暴露24 h可能會刺激大鯢免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)CATH-2基因表達(dá)，上調(diào)心臟CATH-2蛋白表達(dá)水平，增強(qiáng)對100 ng/L HgCl2刺激炎癥的調(diào)節(jié)作用。10、100 ng/L HgCl2對大鯢暴露48 h后顯著下調(diào)了大鯢心臟CATH-2基因表達(dá)水平。暴露72 h后，HgCl2對大鯢心臟CATH-2基因表達(dá)均無顯著性影響。1、10 ng/L HgCl2對大鯢暴露24 h極顯著誘導(dǎo)了心臟CATH-3基因表達(dá)水平(P<0.01)，然而暴露24 h后，100 ng/L HgCl2對大鯢心臟CATH-3基因表達(dá)水平無顯著影響。暴露48、72 h后，HgCl2對大鯢心臟CATH-3基因表達(dá)均無顯著性影響。因此，HgCl2對心臟CATH相關(guān)基因表達(dá)水平的影響可能通過對CATH蛋白表達(dá)水平的影響介導(dǎo)心臟炎癥毒性，CATH-2和CATH-3基因表達(dá)水平的動態(tài)變化模式與大鯢自身免疫調(diào)節(jié)共同介導(dǎo)了大鯢心臟炎癥毒性。

3.3 HgCl2對大鯢胰腺CATH-2和CATH-3基因表達(dá)的影響

胰腺分泌的抗菌肽在腸道先天免疫中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[45]。SUN等[46]報道了胰島β細(xì)胞如何表達(dá)CATH并在穩(wěn)態(tài)或促炎條件下調(diào)節(jié)β細(xì)胞功能，發(fā)現(xiàn)CATH由大鼠胰島素瘤β細(xì)胞克隆INS-1 832/13組成型表達(dá)，丁酸鹽或苯基丁酸誘導(dǎo)了CATH表達(dá)，并且在IL-1β或LPS促炎癥條件下促進(jìn)CATH分泌。CATH通過表皮生長因子受體(EGFR)和通過調(diào)節(jié)抗凋亡Bcl-2家族蛋白的表達(dá)促進(jìn)體外β細(xì)胞存活，表明CATH正調(diào)節(jié)β細(xì)胞功能，可能用于干預(yù)β細(xì)胞功能障礙相關(guān)疾病，外界環(huán)境刺激如環(huán)境污染物對胰腺CATH相關(guān)基因表達(dá)水平的影響可通過調(diào)節(jié)CATH的分泌水平從而使有機(jī)體產(chǎn)生腸道炎癥、胰島β細(xì)胞功能紊亂等炎癥性疾病。POUND等[47]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)1型糖尿病易感大鼠糖尿病發(fā)展不發(fā)作時，腸道CATH相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)，在大鼠、小鼠和人的胰腺β細(xì)胞中都發(fā)現(xiàn)了新的CATH相關(guān)基因表達(dá)，CATH相關(guān)基因表達(dá)在胰島中下調(diào)從而介導(dǎo)了胰島炎癥發(fā)生。HgCl2對胰腺CATH相關(guān)基因表達(dá)水平的影響可介導(dǎo)腸道和胰腺炎癥毒性。本研究發(fā)現(xiàn)，10、100 ng/L HgCl2對大鯢暴露24 h顯著下調(diào)了大鯢胰腺CATH-2基因表達(dá)水平，暴露48、72 h后，HgCl2對大鯢胰腺CATH-2基因表達(dá)均無顯著性影響，說明大鯢對HgCl2暴露環(huán)境具有適應(yīng)性，推測大鯢長期暴露于HgCl2環(huán)境可能導(dǎo)致胰腺分泌抗菌肽不發(fā)生改變，降低大鯢對微生物的抗菌作用，對大鯢產(chǎn)生各種炎癥毒性，進(jìn)而導(dǎo)致生態(tài)毒理影響。暴露24、48、72 h后，HgCl2對大鯢胰腺CATH-3基因表達(dá)均無顯著性影響，說明大鯢胰腺CATH-3基因在應(yīng)對環(huán)境HgCl2暴露過程屬于組成型表達(dá)模式，CATH-3在介導(dǎo)HgCl2引起的胰腺炎癥毒性效應(yīng)中抗炎癥作用較弱。HgCl2對大鯢胰腺CATH相關(guān)基因表達(dá)水平的影響可能通過對CATH蛋白表達(dá)水平的影響介導(dǎo)胰腺炎癥毒性，CATH-2基因表達(dá)水平的動態(tài)變化模式與大鯢自身免疫調(diào)節(jié)共同介導(dǎo)了大鯢胰腺炎癥毒性。

綜上所述，HgCl2對大鯢皮膚、胰腺和心臟CATH-BF、CATH-2和CATH-3基因表達(dá)水平的影響處于動態(tài)變化模式，CATH相關(guān)基因在大鯢皮膚、胰腺和心臟中的表達(dá)顯示出組織特異性，可能介導(dǎo)各種炎癥毒性，所以應(yīng)嚴(yán)格限制大鯢水生境中汞水平，保護(hù)大鯢生態(tài)環(huán)境。具體有關(guān)CATH-BF、CATH-2和CATH-3在皮膚、心臟和胰腺中的功能，還需進(jìn)一步進(jìn)行深入分析。