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      桑葚花青素乙醇浸提工藝優(yōu)化研究

      2020-02-06 10:50:42張?zhí)m蘭鄧杰郭燕徐升東黎仲冰衛(wèi)春會
      中國調(diào)味品 2020年1期
      關(guān)鍵詞:吸光桑葚花青素

      張?zhí)m蘭,鄧杰,郭燕,徐升東,黎仲冰,衛(wèi)春會*

      (1.四川輕化工大學釀酒生物技術(shù)及應用四川省重點實驗室,四川 宜賓 644000; 2.四川省閬州圣果酒業(yè)有限公司,四川 閬中 637400;3.中國人民解放軍原濟南軍區(qū)新技術(shù)農(nóng)副業(yè)生產(chǎn)基地,山東 鄒城 273517)

      桑葚(mulberry)是??粕僦参锍墒旃氲慕y(tǒng)稱,又名桑烏、桑果、桑棗[1]。果實味甜汁多,色澤鮮艷,顏色主要有黃棕色、棕紅色至暗紫色[2]。桑葚營養(yǎng)成分豐富,含有多種人體必需氨基酸、微量元素及維生素[3]。同時桑葚還是中藥,具有烏發(fā)明目、補虛祛濕等功效,屬于藥食同源的食物[4],被譽為“民間圣果”、“百果之先”等美名[5]。桑葚中起顯著作用的是花青素,花青素(anthocyanidin)屬黃酮化合物,有很強的抗氧化能力,能夠促進人體健康[6,7]。食用它不僅能夠美容養(yǎng)顏、護肝、抗腫瘤、抗氧化、預防動脈硬化等,還具有顯著提高人體免疫力的功效[8-10]?;ㄇ嗨剡€能改善大腦發(fā)育過程中乙醇誘導的神經(jīng)毒性[11],預防大腦動脈閉塞、再灌注損傷和促進刺激視紫紅質(zhì)再生等[12,13]。隨著生活水平的提高,人們對合成色素安全的擔憂日漸顯著,花青素作為一種天然色素,安全、無異味、資源豐富,而且具有一定的營養(yǎng)和藥理作用,在食品、飲料、化妝品、醫(yī)藥方面有著較大的應用潛力[14]。

      目前,對花青素的穩(wěn)定性和抗氧化活性有不少研究,卓毓光等[15]通過分析影響花青素穩(wěn)定性的因素,總結(jié)了提高花青素穩(wěn)定性的途徑;侯巧芝等[16]研究表明桑葚花青素抗氧化活性隨著濃度的增大呈線性增強。針對花青素提取研究常用的方法有超聲波-乙醇法、超聲波提取法、微波提取法等[17]。但通過乙醇溶劑浸取法提取桑葚花青素的研究并不多,因此,對乙醇溶劑浸取法提取花青素的研究是很有必要的。本研究采用乙醇溶劑浸取法提取桑葚花青素,通過單因素和正交設計對花青素的提取條件進行優(yōu)化,確定最佳乙醇溶劑浸取花青素工藝,從而為桑葚深加工技術(shù)提供理論與技術(shù)支持,為高效利用開發(fā)桑葚花青素打下基礎。

      1 材料與方法

      1.1 材料與試劑

      1.1.1 材料及預處理

      桑果干:由四川省閬州圣果酒業(yè)有限公司提供。

      將桑果干在干燥箱中烘干,再用粉碎機打成粉末狀,過20目篩,放于干燥器中密封儲藏備用。

      1.1.2 試劑

      95%乙醇、濃鹽酸、乙酸鈉、氯化鉀等均為分析純,購自成都科龍化工試劑廠。

      1.2 儀器設備

      UV-1200型紫外可見分光光度計 上海舜宇恒平科學儀器有限公司;Starter 2100型pH計 奧豪斯儀器(上海)有限公司;XMTD-4000型電熱恒溫水浴鍋 上??坪銓崢I(yè)發(fā)展有限公司;AR2140型電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;1500型酶標儀 賽默飛世爾科技有限公司;BM255C型粉碎機 廣東美的精品電器制造有限公司;LabServ.LS.0610型干燥箱 飛世爾試驗器材(上海)有限公司。

      1.3 試驗方法

      1.3.1 緩沖液的配制

      pH 1.0氯化鉀-鹽酸緩沖的液配制:①精確稱取7.45 g的KCl固體放置于燒杯中,在容量瓶中用蒸餾水定容至500 mL,配成0.2 mol/L KCl溶液;②精確量取8.5 mL濃鹽酸在容量瓶中用蒸餾水定容至500 mL,配成0.2 mol/L HCl溶液;③將KCl溶液與HCl溶液以25∶67的比例混合,再用KCl溶液調(diào)pH至1.0±0.1[18]。

      pH 4.5醋酸鈉-鹽酸緩沖液的配制:精確稱取16.4 g的NaAc在容量瓶中用蒸餾水定容到1000 mL,再用鹽酸調(diào)pH至4.5±0.1。

      1.3.2 最大吸收波長Amax及吸光值A的檢測

      稱取粉碎后的干桑葚5.0 g,加入10 mL 50%乙醇浸提15 min,抽濾后得到花青素粗提取液,再取5 mL花青素提取液,分別用pH 1.0氯化鉀緩沖液或pH 4.5醋酸鈉緩沖液稀釋10倍后,將稀釋液靜置15 min,用酶標儀在440~600 nm波長范圍內(nèi)分別測定兩種提取稀釋液,從440 nm開始的吸光值A,波峰處的波長值為最大吸收波長即Amax。

      1.3.3 吸光值A及樣品花青素含量C的測定

      花青素的含量測定采用pH示差法,公式如下:

      A=(Amax-A700)pH 1.0-(Amax-A700)pH 4.5。

      (1)

      C(mg/g)=(A/εL)×Mw×DF×V/Wt。

      (2)

      式中:A為總吸光值;Amax為最大吸收波長值;A700為波長為700 nm的吸光值;ε為Cy-3-Glu的消光系數(shù)(其值為26900 L/(mol·cm);Mw為Cy-3-Glu的相對分子質(zhì)量(449.2 g/mol);DF為稀釋倍數(shù);V為總?cè)∫后w積(mL);Wt為樣品質(zhì)量(g);L為光程(1 cm)。

      1.3.4 工藝流程

      原料桑葚果干→粉碎→過篩(20目篩)→乙醇溶劑浸提→抽濾→取樣測定吸光值→計算含量→旋轉(zhuǎn)濃縮→冷凍干燥→花青素粗品。

      1.4 單因素試驗設計

      分別考察乙醇體積分數(shù)、料液比、溶劑pH、提取時間、提取溫度5個因素對桑葚花青素提取量的影響。

      1.4.1 乙醇體積分數(shù)的確定

      稱取1.0 g粉碎后的桑葚粉置入250 mL的三角瓶中,在pH為4.0、提取溫度為40 ℃、提取時間為60 min、料液比為1∶10 (g/mL)的情況下,考察乙醇體積分數(shù)分別為45%、55%、65%、75%、85%對桑葚花青素提取量的影響。

      1.4.2 料液比的確定

      稱取1.0 g粉碎后的桑葚粉置入250 mL的三角瓶中,在pH為4.0、提取溫度為40 ℃、提取時間為60 min、乙醇體積分數(shù)為的65%情況下,考察料液比分別為1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25 (g/mL)對桑葚花青素提取量的影響。

      1.4.3 溶劑pH的確定

      稱取1.0 g粉碎后的桑葚粉置入250 mL的三角瓶中,在提取溫度為40 ℃、提取時間為60 min、料液比為1∶10 (g/mL)、乙醇體積分數(shù)為65%情況下,考察溶劑pH分別為2.0,2.5,3.0,3.5,4.0,4.5,5.0對桑葚花青素提取量的影響。

      1.4.4 提取時間的確定

      稱取1.0 g粉碎后的桑葚粉置入250 mL的三角瓶中,在pH為4.0、提取溫度為40 ℃、料液比為1∶10 (g/mL)、乙醇體積分數(shù)為65%的情況下,考察提取時間分別為60,90,120,150,180 min對桑葚花青素提取量的影響。

      1.4.5 提取溫度的確定

      稱取1.0 g粉碎后的桑葚粉置入250 mL的三角瓶中,在pH為4.0、提取時間為60 min、料液比為1∶10 (g/mL)、乙醇體積分數(shù)為65%的情況下,考察提取溫度分別為30,40,50,60,70 ℃對桑葚花青素提取量的影響。

      1.5 正交試驗設計

      在單因素試驗基礎上,選擇料液比、提取溫度、乙醇體積分數(shù)為變量,以花青素提取量為評價指標,設計4因素3水平L9(34)正交試驗,從而確定桑葚花青素的最佳工藝條件。

      2 結(jié)果與分析

      2.1 最大吸光值Amax的確定

      在440~600 nm波長范圍內(nèi)分別測定兩種提取稀釋液,桑葚果中花青素最大吸收波長測定曲線見圖1。

      圖1 桑葚花青素最大吸收波長測定曲線Fig.1 Measuring curves of the maximum absorption wavelength of anthocyanins in mulberry

      由圖1可知,兩條折線均在波長530 nm處出現(xiàn)波峰,吸光值達到最大,因此,采用波長為530 nm測定提取液的吸光值,并通過示差法計算花青素樣品吸光值A。

      2.2 單因素條件對桑葚花青素含量的影響

      2.2.1 乙醇體積分數(shù)對桑葚花青素提取量的影響

      本試驗考察了不同乙醇體積分數(shù)對桑葚花青素提取量的影響,結(jié)果見圖2。

      圖2 不同乙醇體積分數(shù)對花青素提取量的影響Fig.2 Effect of different ethanol volume fractions on anthocyanins extraction amount

      由圖2可知,隨著酸性乙醇體積分數(shù)的增加,桑葚花青素提取量不斷增大,在酸性乙醇體積分數(shù)為65%時達到最大,繼續(xù)提高酸性乙醇體積分數(shù),提取量反而逐漸降低。在酸性乙醇體積分數(shù)較低時,糖類、果膠和其他水溶性物質(zhì)的溶解性好,影響了花青素的溶出,導致花青素的提取量較低[19];當酸性乙醇體積分數(shù)過高時,脂溶性物質(zhì)易溶出[20],影響花青素溶出,導致花青素提取量偏低。因此,選取體積分數(shù)65%的乙醇溶液。

      2.2.2 料液比對桑葚花青素提取量的影響

      本試驗考察了不同料液比對桑葚花青素提取量的影響,結(jié)果見圖3。

      圖3 不同料液比對花青素提取量的影響Fig.3 Effect of different solid-liquid ratios on anthocyanins extraction amount

      由圖3可知,隨著提取液料液比的增大,桑葚花青素提取量呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢,表明在一定范圍內(nèi)提高料液比有利于提高花青素含量;在料液比為1∶10 (g/mL)時花青素濃度為2.4 mg/g,當料液比低于1∶10 (g/mL)時,桑葚花青素提取不完全;當料液比超過1∶10 (g/mL)時,花青素可能在酸性條件下被破壞,從而導致花青素提取量減少。故選擇料液比為1∶10 (g/mL)。

      2.2.3 溶劑pH對桑葚花青素提取量的影響

      本試驗考察了不同溶劑pH對桑葚花青素提取量的影響,結(jié)果見圖4?;ㄇ嗨卦谒嵝詶l件下比較穩(wěn)定,因此將提取劑pH調(diào)為2~5。

      圖4 不同乙醇溶液pH對花青素提取量的影響Fig.4 Effect of different pH values of ethanol solution on anthocyanins extraction amount

      由圖4可知,隨著pH的變化,桑葚花青素濃度變化,pH先逐漸增大后降低,在pH值達到4.0時,提取量達到最大值。pH過低,導致花青素的糖苷鍵斷裂,從而使花青素吸光值較低;pH增大,提取出的花青素提取量反而減小,可能是因為pH過高影響花青素的穩(wěn)定性,進而使花青素吸光值減小。因此,本試驗選擇提取液的pH為4.0。

      2.2.4 提取時間對桑葚花青素提取量的影響

      本試驗考察了不同提取時間對桑葚花青素提取量的影響,結(jié)果見圖5。

      圖5 不同提取時間對花青素提取量的影響Fig.5 Effect of different extraction time on anthocyanins extraction amount

      由圖5可知,在提取時間為60~180 min范圍內(nèi),隨著提取時間的延長,花青素提取量先上升后下降,當水浴浸提時間達到120 min時,提取的花青素提取量達到最大值。分析可能是花青素長時間在較高的水浴溫度下發(fā)生氧化或降解,使花青素被破壞,故提取量降低。根據(jù)試驗結(jié)果,選取120 min為水浴浸提的最佳時間。

      2.2.5 提取溫度對桑葚花青素提取量的影響

      本試驗考察了不同提取溫度對桑葚花青素提取量的影響,結(jié)果見圖6。

      圖6 不同提取溫度對花青素提取量的影響Fig.6 Effect of different extraction temperatures on anthocyanins extraction amount

      由圖6可知,隨著提取溫度由高到低,花青素含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。在60 ℃達到最大值,這說明在一定范圍內(nèi)升高溫度有利于花青素的提取。隨著溫度增加,花青素提取量逐漸增大,主要是因為溫度能提高花青素在溶劑中的溶解度和擴散速度,也有利于細胞的破壞,提高細胞膜的通透性;溫度繼續(xù)上升,花青素的提取量緩慢下降,主要是因為溫度過高,桑葚花青素的穩(wěn)定性遭到部分破壞,使提取量有所下降,根據(jù)試驗結(jié)果選擇提取溫度為60 ℃。

      2.3 桑葚花青素提取正交試驗及結(jié)果

      為了確定桑葚花青素的最佳工藝條件,在單因素試驗基礎上設計正交試驗。對比單因素試驗結(jié)果,結(jié)合實際試驗現(xiàn)象,發(fā)現(xiàn)料液比、提取溫度和乙醇體積分數(shù)3個因素的花青素提取量變化幅度比較大,且受外界影響比較大,而溶劑pH和提取時間對花青素提取的影響相對比較穩(wěn)定,且提取量的變化也比較清晰直觀。因此,選擇料液比、提取溫度、乙醇體積分數(shù)為變量。

      在提取時間120 min,溶劑pH 4.0條件下,以花青素的提取量為評價指標,設定4因素3水平L9(34)正交試驗,結(jié)果見表1,方差分析見表2。

      表1 乙醇溶劑浸取法花青素提取正交表Table 1 Orthogonal table of anthocyanins extracted by ethanol solvent extraction method

      表2 乙醇溶劑浸取法方差分析表Table 2 Variance analysis table of ethanol solvent extraction method

      注:“*”表示對結(jié)果影響差異性顯著(p<0.05)。

      由表1可知,從極差值得到各因素對花青素提取量的影響大小為:料液比(B)>提取溫度(A)>體積分數(shù)(C),花青素提取量最佳提取條件組合為A2B2C1,即浸取溫度60 ℃,料液比1∶10(g/mL),溶劑體積分數(shù)為55%。

      由表2可知,料液比對試驗結(jié)果有顯著影響(p<0.05),提取溫度、體積分數(shù)對桑葚花青素提取量無顯著影響(p>0.05)。

      2.4 工藝驗證試驗及結(jié)果

      對上述正交試驗極差分析結(jié)果A2B2C1進行驗證試驗,在提取時間為120 min,溶劑pH為4.0的條件下,進行5組平行試驗,結(jié)果見表3。結(jié)果表明,正交試驗極差分析工藝提取花青素含量為2.53 mg/g,故選擇最佳提取條件組合為A2B2C1,即提取溫度為60 ℃、料液比為1∶10 (g/mL)、體積分數(shù)為55%。

      表3 乙醇溶劑浸提法驗證試驗結(jié)果Table 3 Verification test results of ethanol solvent extraction method mg/g

      3 結(jié)論

      本研究采用乙醇溶劑浸取法提取桑葚花青素,在乙醇體積分數(shù)、料液比、溶劑pH、提取時間、提取溫度等單因素研究的基礎上進行正交試驗,對其提取工藝條件進行優(yōu)化。從各因素的極差值發(fā)現(xiàn)其對花青素提取量的影響大小為:料液比>提取溫度>體積分數(shù),其中料液比對桑葚花青素提取量有顯著性影響;通過工藝驗證試驗得到乙醇溶劑法提取花青素的最佳工藝條件為:乙醇體積分數(shù)為55%、料液比為1∶10 (g/mL)、提取溫度為60 ℃、提取時間為120 min、溶劑pH為4.0,提取得到的桑葚花青素提取量為2.53 mg/g。

      乙醇溶劑浸取法與其他提取方法相比,操作簡單,設備投入少,乙醇成本低,安全且產(chǎn)率也比較可觀,環(huán)保且能耗低,無論是實驗室還是工業(yè)生產(chǎn),均可推行,是很有應用前景的桑葚花青素提取方法。本研究優(yōu)化確定了乙醇浸提桑葚花青素的提取工藝,后續(xù)將開展花青素純化工藝,以期為今后桑葚花青素的規(guī)?;崛∫约靶庐a(chǎn)品開發(fā)提供理論依據(jù)。

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