王云冰，江景勇,2

(1.臺州科技職業(yè)學院 園藝植物研究所，浙江 臺州 318020； 2.臺州市農(nóng)業(yè)科學研究院，浙江 臺州 317000)

掌葉覆盆子(RubuschingiiHu)又稱華東覆盆子，俗稱大號角公、牛奶母等，為薔微科懸鉤子屬，葉形多為五裂似掌狀。掌葉覆盆子是“藥果同源”植物，成熟果可食用，未成熟果實可入藥，是194種懸鉤子屬植物中唯一入選《中國藥典》的覆盆子，具有益腎、固精、縮尿、養(yǎng)肝明目等功能，有著極大的開發(fā)潛力和廣闊的市場前景。掌葉覆盆子種苗繁育多采用扦插、壓條和根蘗繁殖等[1]，但繁育效率低，品種易混雜。通過組培快繁育苗不僅能保證品種純正，還能快速高效提供優(yōu)質(zhì)種苗，以滿足市場需求。

掌葉覆盆子組織培養(yǎng)中外植體褐化現(xiàn)象較普遍。外植體褐化是一種酶促褐變，多酚氧化酶被激活，從而使植物體中的酚類物質(zhì)聚合產(chǎn)生的醌類物質(zhì)，從而影響離體材料的現(xiàn)象[2]。褐化是導(dǎo)致外植體培養(yǎng)材料死亡的主要原因，這直接影響到種苗的繁育及成本[3]。在不同培養(yǎng)基成分中，采用抗氧化劑及吸附劑，其外植體的褐化程度表現(xiàn)各異[2]。大花香水月季、牡丹、芍藥等在組培上已有較系統(tǒng)的抗褐化研究[4-6]，而掌葉覆盆子主要針對建立相應(yīng)的各階段培養(yǎng)基配方研究較多[1,7-8]，有關(guān)褐化問題的研究鮮見報道。

外植體褐化受取材部位及培養(yǎng)基類型的影響。吸附劑和抗氧化劑等抗褐化劑會減輕外植體的褐化程度，常用的有抗壞血酸(Vc)、檸檬酸、活性炭(AC)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)等[3]。低溫預(yù)處理對降低褐變有一定作用[7]。本試驗通過對掌葉覆盆子莖段組織培養(yǎng)中不同的外植體部位、培養(yǎng)基、抗褐化物質(zhì)及低溫黑暗等處理，對掌葉覆盆子的抗褐化方案進行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料

選取臺州地區(qū)優(yōu)良掌葉覆盆子進行組培，選取根蘗芽段、帶芽枝段、當年生莖段為外植體。不同試驗材料取材時間為3月10日至7月10日。

1.2 方法

1.2.1 材料處理

將采取的掌葉覆盆子材料在肥皂水中用軟毛刷清洗，然后在自來水中沖洗1 h。將根蘗芽或枝條剪成長約2 cm的帶芽莖段，枝芽直接消毒，用75%的酒精浸泡搖動處理50 s，無菌水沖洗3次，再用0.1%的升汞溶液浸泡震動8 min，無菌水沖洗3次，備用。

1.2.2 培養(yǎng)條件

光照強度2 000～4 000 lx，每天光照12 h，培養(yǎng)室溫度(25±2) ℃，培養(yǎng)基蔗糖用量30 g·L-1，瓊脂用量6 g·L-1，pH為5.8，培養(yǎng)基使用的激素種類和用量為6-BA 1.5 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1。

1.2.3 處理設(shè)計

不同外植體試驗。培養(yǎng)基為1/2MS，T1、T2、T3處理分別為帶芽枝段、根蘗芽段和當年生莖段，采集時間分別為3、4、7月。T4、T5、T6 4 ℃低溫處理時間分別為0、24、48 h，材料為莖段。

不同培養(yǎng)基處理。將莖段切去兩端接種于不同基礎(chǔ)培養(yǎng)基上，分別為T7(1/4MS)、T8(1/2MS)、T9(MS)、T10(WPM)。

不同抗褐化劑處理[4-5]。培養(yǎng)基為1/2MS，處理T11、T12、T13對應(yīng)加入Vc濃度分別為50、100、150 mg·L-1；處理T14、T15、T16對應(yīng)加入PVP濃度分別為1、2、3 g·L-1。

1.2.4 測定指標

培養(yǎng)基采用單因素試驗，每處理20個外植體，重復(fù)3次。外植體接種10 d后統(tǒng)計褐化率、出芽數(shù)，接種20 d后進行生長勢評價。褐化致死外植體個數(shù)計為褐化數(shù)；側(cè)芽萌發(fā)外植體個數(shù)計為萌發(fā)數(shù)；生長勢評價指標包括芽長、葉數(shù)、葉色、葉形等，從低到高共1～5級，3次評價取平均值[4]。

2 結(jié)果與分析

2.1 外植體不同取材部位培養(yǎng)對抗褐化的影響

掌葉覆盆子外植體不同部位取材培養(yǎng)的生長狀況差異較大。由圖1可見，根蘗芽段直徑較大，組織較嫩，褐化程度最高，褐化發(fā)生在3 d后，之后多數(shù)組織全部褐化；帶芽枝段頭尾部分褐化，生長停滯；而當年生枝段長出新芽，生長旺盛。

圖1 外植體不同部位培養(yǎng)生長情況

由圖2可見，生長勢評價表明，當年生莖段最佳，帶芽莖段其次，且兩者相差不大，而根蘗芽段最差；從出芽后生長后期可知，對帶芽莖段和當年生莖段芽生長影響不大，但對根蘗芽段后期生長仍有影響。從褐化情況看，根蘗芽段褐化率達到87.7%，帶芽枝段居中，當年生莖段最低，為14.8%；當年生莖段出芽率達到85.2%，帶芽枝段為45.3%，根蘗芽段最低，這也許與幼嫩組織酚類含量高有關(guān)。木本植物褐化發(fā)生與外植體體內(nèi)酚類物質(zhì)的含量呈正相關(guān)[9-10]，而帶芽莖段為冬季休眠莖段，少量褐化對其生長也有一定影響，而采自7月生長季當年生莖段相對于前兩者生長力旺盛，褐化少，這與李煥秀等[9]得出的5月以后外植體的褐變率逐漸降低的結(jié)論一致。

圖2 外植體不同部位培養(yǎng)抗褐化情況

2.2 不同基本培養(yǎng)基對外植體抗褐化的影響

從表1可以看出，在其他培養(yǎng)基條件相同的情況下，掌葉覆盆子外植體莖段在4種不同基礎(chǔ)培養(yǎng)基上長勢有所不同。其中，1/4MS培養(yǎng)基褐化率最低，為14.3%，出芽率為85.7%；1/2MS培養(yǎng)基褐化率與之相近；MS培養(yǎng)基褐化率最高，為47.1%，出芽率為52.9%，而WPM培養(yǎng)基與其接近。從生長勢評價來看，1/4MS培養(yǎng)基后期生長葉色略黃，生長芽心抽生速度慢，而其他三類培養(yǎng)基在出芽后生長較為穩(wěn)定，生長旺盛，葉色濃綠。綜合來看，1/2MS培養(yǎng)基較為理想，這與李純佳等[4]研究的大花香水月季在WPM培養(yǎng)基中褐化率最低有所不同，但在MS培養(yǎng)基最高這點上是一致的，這可能與植物種類培養(yǎng)特性差異有關(guān)系。

表1 不同培養(yǎng)基條件下外植體抗褐化情況

2.3 抗褐化劑對抑制外植體抗褐化的影響

通過兩種抗褐化劑的不同水平處理觀察掌葉覆盆子外植體在培養(yǎng)基上的生長情況可知(圖3)，在不同濃度的抗壞血酸(Vc)處理中，T12處理Vc含量為100 mg·L-1時，褐化率僅為7.5%，出芽率達到92.5%；結(jié)果顯示，褐化情況隨著濃度升高呈先下降后上升趨勢。不同濃度PVP處理中，T14中PVP含量為1 g·L-1時褐化率最低，為15.0%，出芽率為85%；PVP濃度升至3 g·L-1時，其生長遲滯，葉片黃綠，芽細弱，生長勢有所下降，這與李純佳等[4]的研究結(jié)果一致?？傮w上講，Vc作為抗氧化劑對于掌葉覆盆子抗褐化效果較為明顯，作用濃度為100 mg·L-1，而通過吸附起作用的PVP為其次，作用濃度為1 g·L-1最佳。

2.4 黑暗低溫處理時數(shù)對外植體抗褐化的影響

圖4顯示，在不同黑暗低溫處理下，24 h黑暗低溫處理效果明顯，其褐化率僅為5.0%，出芽率高達95%，而未進行黑暗低溫處理的材料褐化率有34.0%，處理48 h的掌葉覆盆子材料其褐化率較之有所提升，后期生長勢觀察評價表明，黑暗低溫處理48 h的生長勢受到一定影響，出芽速度慢，葉片展開較慢，生長勢弱，而前兩者處理在出芽后的生長中長勢均較為良好。可見，適度的黑暗低溫處理對掌葉覆盆子抗褐化培養(yǎng)比較重要，以24 h為宜，處理時間過長對生長不利。

圖4 不同黑暗低溫處理時間下外植體生長情況

3 小結(jié)

試驗發(fā)現(xiàn)，選擇適宜的外植體部位，不同的基本培養(yǎng)基、抗褐化劑及黑暗低溫處理都對掌葉覆盆子抗褐化有一定的減緩作用，但通過某一因素的調(diào)節(jié)均不能對外植體褐化起到絕對的抑制作用，這與外植體褐化發(fā)生影響因素較多有關(guān)。植物組培褐化的發(fā)生與植物基因型、外植體及培養(yǎng)條件等內(nèi)外因因素有關(guān)[3]。在不同部位的外植體培養(yǎng)中，當年生莖段褐化率低，僅為14.8%，生長勢評價等級為5級，長勢較佳；同等激素水平下，雖然前期1/4MS培養(yǎng)基褐化率略低，但權(quán)衡考慮生長勢評價情況，最佳基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方應(yīng)為1/2MS，其褐化率為15.0%。不同抗褐化劑處理結(jié)果顯示，掌葉覆盆子莖段對Vc 100 mg·L-1的培養(yǎng)基抗褐化效果最好，而PVP 1 g·L-1時抗褐化效果較好，褐化率為15%，濃度增加對生長不利，這與李萍等[5]的結(jié)果一致，實際操作中考慮出芽后轉(zhuǎn)接至新的培養(yǎng)基中為宜。黑暗低溫處理最佳時間為24 h，出芽率達到95%，超過24 h對其生長勢影響較大，原因可能與長期低溫造成植物組織損傷有一定關(guān)系[4]。

綜上所述，通過各單因素試驗，基本得出掌葉覆盆子減輕褐化的基本方法，有一定的實際意義。但以上試驗表明，沒有一種單因素足以使其外植體褐化率降至0，這需要綜合考慮幾個因素的疊加、協(xié)同效應(yīng)，有待于進一步的多因素試驗。