王乙

（長春中醫(yī)藥大學繼續(xù)教育學院，吉林 長春 130021）

下腰部疼痛是目前骨科門診中最常見且頻發(fā)的健康問題之一。全球超過80%的成年人曾有過下腰部疼痛的病史［1］，且長期的下腰部疼痛最終會導致殘疾并帶來巨大的經濟負擔。研究［2］顯示：椎間盤退變是導致下腰部疼痛主要病因。椎間盤退變時椎間盤組織內的基質蛋白和水含量急劇下降，導致纖維環(huán)組織強度減弱，髓核在壓力作用下從薄弱的纖維環(huán)處突出，通過機械壓迫、化學刺激和炎癥反應等方式刺激神經根，引發(fā)坐骨神經痛等癥狀［3］。目前，針對椎間盤退變病因的研究已深入至分子生物學水平，椎間盤退變與椎間盤細胞流失、細胞外基質合成與降解失衡和局部炎癥反應有密切關聯(lián)。而多種生長因子在維持椎間盤代謝穩(wěn)態(tài)中起到關鍵作用，其中轉化生長因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）被證實在椎間盤退變分子生物學進程中起到關鍵調控作用［4］。但目前尚無系統(tǒng)性綜述回顧TGF-β 通路在椎間盤退變分子生物學進程中的作用機制。結合國內外相關文獻，本文作者首次總結了椎間盤退變中TGF-β 表達差異和下游通路情況，并回顧了TGF-β 抑制類藥物對于椎間盤退變的研究進展，旨在分析TGF-β 通路在椎間盤退變中的作用機制及通過調控TGF-β 通路對椎間盤退變的治療情況。

1 TGF-β 通路

哺乳動物體內，TGF-β 家族包括TGF-β1、TGF-β2 和TGF-β33 個成員，雖然其分子結構高度相似，但因表達順序和激活狀態(tài)的差異，導致其發(fā)揮著不同的生物學功能［5］。所有的TGF-β 成員初始均表達為非活性的前體狀態(tài)，由一條潛在相關多肽和一條成熟多肽鏈連接而成。TGF-β 通過潛在相關多肽和TGF-β 結合蛋白連接的二硫鍵穩(wěn)定維持在細胞外基質中。而在椎間盤中，持續(xù)的負荷刺激通過整合素-10 將力學信號轉化傳遞為化學信號，促進TGF-β 的活化和釋放。基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）和活化氧等因子也參與了TGF-β 的激活［6］。

在TGF-β 激活過程中，成熟多肽鏈轉變?yōu)橄鄬Ψ肿淤|量為25 000 的二聚體作為與細胞表面TGF-β 受體復合物連接的配體，參與TGF-β 的激活。TGF-β 受體復合物是由一對跨膜的TGF-βI型受體（TβRIs）和一對TGF-βⅡ型受體（TβRⅡs）組成的具有絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的四聚體［7］。在四聚體形成初期，TGF-β 配體與TβRⅡs 結合，并在特定的絲氨酸和蘇氨酸殘基上使膜旁區(qū)TβRIs的甘氨酸-絲氨酸結構域發(fā)生反式磷酸化。TβRIs也被稱為激活素受體樣激酶（activin receptor-like kinases，ALKs），在經典信號通路中，激活的ALK5 在絲氨酸羧基端將SMAD2 和SMAD3 磷酸化，同時激活的R-SMADs 與SMAD4 形成三聚體復合物，而此三聚體復合物轉移至細胞核內，通過刺激或抑制靶基因表達發(fā)揮功能［8］。而TβRIs 包含ALK1 和ALK5 2 種不同的結構類型，激活的ALK1 調節(jié)SMAD1/5/8 磷酸化，而磷酸化的SMAD1/5/8 與SMAD2/3 在組織中常發(fā)揮相反的生理功能。此外，TGF-β 還可以激活非SMAD 依賴的非經典信號通路，如絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPK）通路等，以發(fā)揮特異生理學功能［9］。

2 TGF-β 在椎間盤發(fā)育中的作用

椎間盤由生骨結和脊索中的細胞發(fā)育而來。在胚胎第10 周時，脊索外部體節(jié)細胞開始分化，形成梭形的纖維母細胞，隨后發(fā)育成為纖維環(huán)組織。而在胚胎第18 周時，中胚層脊索組織逐漸發(fā)生黏液化，最終形成髓核組織［10］。在胚胎期，TGF-β參與椎間盤發(fā)育中的脊索基質調控，并誘導體結分化形成纖維環(huán)細胞［11］。研究［12］表明：靶向敲除TβRⅡs 的Col2a1-Cre 轉基因小鼠會導致椎間盤發(fā)育不全，甚至完全缺失。另外，SMAD3 基因敲除鼠中亦可觀察到脊柱后凸畸形，并表現(xiàn)出椎間盤高度、膠原和蛋白多糖含量下降等椎間盤退變表現(xiàn)。PECK 等［13］發(fā)現(xiàn)：小鼠胚胎發(fā)育時從受精卵至胚胎期12.5 d 期間TGF-β 表達的變化，證實TGF-β在胚胎發(fā)育階段對椎間盤發(fā)育起到的核心調節(jié)作用。TGF-β 在出生后小鼠椎間盤發(fā)育過程中也起到關鍵性作用。通過Col2a1-CreERT2構建的T βRⅡCol2ER小鼠特異性地抑制了纖維環(huán)細胞與脊柱周圍軟骨細胞中TGF-β 通路的作用。在此轉基因鼠出生早期可觀察到其終板發(fā)育不良，終板高度和厚度明顯小于正常小鼠，且MMP-13 等基質降解蛋白相關基因表達水平明顯升高，提示TGF-β 在椎間盤的形成和發(fā)育過程中均發(fā)揮重要作用［14］。

3 TGF-β 在椎間盤中的表達

研究［15］表明：TGF-β 和TGF-β 受體的表達水平隨著年齡及椎間盤退變的進展而發(fā)生改變，但不同的研究結果［16-23］間存在較大差異，甚至得出截然相反的結論。在衰老小鼠模型中，免疫組織化學染色結果表明：TGF-β 和TGF-β 受體隨著年齡增長而表達水平降低；與2 月齡鼠比較，18 月齡鼠椎間盤中的pSMAD2/3 的表達水平亦明顯降低［16］。研究［17］表明：3 歲齡家兔髓核和纖維環(huán)組織內TGF-β1 mRNA 表達水平則明顯低于6 月齡家兔。2～48 周齡大鼠的髓核和纖維環(huán)內TGF-β 表達水平隨年齡增加呈相反的變化趨勢［18］。

在人椎間盤組織內，TGF-β 表達水平情況報道不一致。NERLICH 等［19］提取了30 具無椎間盤退變的新鮮尸體中的椎間盤組織和12 具有椎間盤退變的尸體中的椎間盤組織，結果顯示：TGF-β1 表達與椎間盤退變間存在密切聯(lián)系；后續(xù)研究［20］證實：TGF-β1 的表達在退變椎間盤中明顯上調，并與椎間盤退變病理分型呈正相關關系［20］。另外，SCHROEDE 等［21］發(fā)現(xiàn)：TGF-β1在退變椎間盤的髓核中表達水平降低，而在纖維環(huán)中表達水平明顯升高。ABBOTT 等［22］觀察顯示：與輕度椎間盤退變比較，在嚴重退變椎間盤的髓核細胞內TβRI 下調更加明顯。與正常組織比較，突出髓核中TGF-β1 mRNA 表達水平差異無統(tǒng)計學意義［23］。綜上，椎間盤中TGF-β 的表達水平隨著物種、年齡、組織和細胞類型及檢測方法不同存在著較大差異。椎間盤中表達的TGF-βs 以無生物活性的狀態(tài)為主，而實際發(fā)揮信號轉導作用的TGF-β通路與組織中TGF-β 表達量呈不完全相關。

4 TGF-β 在椎間盤退變中的相關作用機制

椎間盤退變的病理學特征包括細胞外基質含量下降、細胞流失和炎癥反應等。而TGF-β 通路則可通過調控以上3 個方面對椎間盤退變進行修復。

4.1 抑制細胞外基質降解并促進細胞外基質合成椎間盤內細胞外基質代謝穩(wěn)態(tài)的改變是椎間盤退變重要的標志之一，其表現(xiàn)為細胞外基質的合成和降解代謝失衡［24］。退變時，椎間盤中的組織細胞和炎癥細胞持續(xù)釋放一系列炎癥因子，如腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和白細胞介素1（interleukin-1，IL-1）等，造成MMPs 和去整合素等分解代謝酶類表達水平升高［25］。TGF-β 可以通過MAPK 和核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）通路在一定程度上逆轉炎癥因子誘導的基質降解酶類表達上調，起到保護基質的作用［26］。微小RNA（microRNA）通過靶向TGF-β 通路參與椎間盤退變過程中的基質降解，而通過TGF-β 調控microRNA 水平亦成為椎間盤退變治療的新手段［27］。

在抑制基質降解的同時，TGF-β 通路還參與促進椎間盤中基質的合成過程。膠原、蛋白聚糖和糖胺聚糖是椎間盤中3 種重要的基質組分［28］。蛋白聚糖能與透明質酸結合形成復雜三位結構網絡，與蛋白聚糖結合的糖胺聚糖帶有負電荷，吸引陽離子在髓核中形成高滲透壓［29］。研究［30］表明：TGF-β SMAD2/3、RHOA/ROCK 和MAPK 等通路刺激糖胺聚糖的合成。在髓核細胞中，TGF-β則通過促進CCN-2 表達、抑制CCN-3 表達以誘導蛋白聚糖的分泌［31-32］。此外，在椎間盤退變的器官和動物模型實驗中，TGF-β 可促進糖胺聚糖、蛋白聚糖和Ⅱ型膠原的表達［33-34］。值得注意的是，用于研究的模型動物均為低齡動物，而TGF-β 對于椎間盤基質合成的作用也隨著年齡變化而變化。因此，還需后續(xù)研究TGF-β 在高齡椎間盤退變動物模型中的椎間盤基質合成作用。

4.2 促進細胞增殖并抑制細胞凋亡在退變的椎間盤中，椎間盤細胞處于多種復雜微環(huán)境中，如低氧、力學負荷、低pH 值、缺乏養(yǎng)供和高滲透壓等，降低了細胞活性，并可誘導細胞發(fā)生凋亡［35］。研究［36-37］表明：TGF-β1 能上調纖維環(huán)細胞增殖率，并具有刺激多種利于細胞增殖的生長因子，IGF-1和FGF-2 的協(xié)同作用。在小鼠髓核細胞中，外源性給予TGF-β1 能夠通過調控c-Myc 和MAPK 通路影響細胞周期以增高細胞增殖率［38］。研究［39］顯示：SMAD 能夠通過抑制Wnt/β -連環(huán)蛋白（β-catenin）通路來維持高鉀狀態(tài)下大鼠髓核細胞的增殖。

TGF-β 除能夠促進細胞增殖外，還具有緩解細胞凋亡和延遲椎間盤退變的作用［40］。細胞凋亡和自噬是引起椎間盤退變的關鍵致病因素之一［41］。TGF-β 則可以通過抑制自噬而減少乏養(yǎng)狀態(tài)下纖維環(huán)細胞的凋亡，磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）和MAPK 則被證實是抑制纖維環(huán)細胞凋亡的核心通路［42］。研究［43-44］顯示：受體相互作用蛋白激酶1（RIPK-1）通路介導的細胞凋亡是造成髓核細胞死亡的主要原因，但后續(xù)未進行相關研究以證實對RIPK-1 信號通路抑制后退變椎間盤中髓核細胞的存活和凋亡情況。細胞衰老是椎間盤退變的主要誘因之一，而TGF-β 則是調節(jié)細胞衰老凋亡的重要信號通路，然而，其對椎間盤細胞衰老調控作用的機制尚不清楚，仍有待深入探究。

4.3 抑制炎癥反應炎癥反應與椎間盤退變的進展緊密相關。退變的椎間盤基質會產生多種化學因子，如單核細胞趨化蛋白1（monocyte chemotactic protein1，MCP-1）和趨化因子配體4（CCL-4）等，誘導巨噬細胞聚集于退變椎間盤組織處，廣泛的巨噬細胞浸潤則會引起炎癥因子的分泌，TNF-α和IL-1β 為其中主要的炎癥因子，并會進一步上調基質分解代謝酶，加速椎間盤退變的進展速度［45］。TGF-β 的治療則會在抑制TNF-α 和IL-1β 分泌的同時，降低由于炎癥反應上調的MMPs 的表達，起到抑制炎癥和防止基質降解的功能［46］；另一方面，TGF-β 可以通過抑制炎癥因子上游環(huán)節(jié)的表達而起到抑制炎癥的作用。胸腺基質淋巴細胞生成素（thymic stromal lymphocytic production，TSLP）與IL-7 同源，通過刺激MCP-1 引起巨噬細胞在退變椎間盤組織的局部募集［47］。內源性TGF-β 通過抑制NF-κB 活化而抑制TSLP 的穩(wěn)定表達。TGF-β可以通過激活MAPK 通路下調CCL-4 的表達。因此，活化的TGF-β 通路可以通過抑制炎癥的起始和發(fā)展，進而緩解椎間盤退變時的局部炎癥狀態(tài)［48］。

5 過度激活TGF-β 通路導致椎間盤退變加劇

TGF-β 被認為是一種多效能細胞因子，其表達水平的高低可誘發(fā)不同的疾病狀態(tài)［49］。TGF-β的激活在胚胎發(fā)育和早期腫瘤抑制過程中起到重要作用，但過量表達的TGF-β 則會引起組織纖維化并促進晚期腫瘤的發(fā)展［50］。而TGF-β 劑量相關性的生理學作用在關節(jié)疾病的發(fā)展中也起到重要調控作用。在健康關節(jié)軟骨中，TGF-β 處于基本正常表達狀態(tài)，其通過激活SMAD2/3 通路維持軟骨細胞表型穩(wěn)態(tài)。但在骨性關節(jié)炎軟骨中，由于TGF-β 及其受體表達異常，TGF-β 的異常激活則會通過SMAD1/5/8 通路促進骨性關節(jié)炎［6］。TGF-β 過度表達會加速椎間盤退變的發(fā)展［51］。在小鼠椎間盤退變模型中，異常機械負荷會導致TGF-β 信號過度激活而加速退變速度，而TβRI 抑制劑則通過抑制受體調節(jié)型SMAD（receplor regulate SMAD，R-SMAD）信號有效抑制椎間盤退變的進展［52］。在家兔纖維環(huán)缺損模型中，通過注射TGF-β 抑制劑氟尿嘧啶可以有效延緩纖維環(huán)的退變速度［53］。在牛髓核細胞退變過程中，TGF-β 同時激活SMAD2/3 和SMAD1/5/8 正反2 條通路，而激活的SMAD1/5/8 對SMAD2/3 具有負調控作用，可導致椎間盤進一步的退變［54］。而在人軟骨細胞中則驗證了ALK1 依賴的SMAD1/5/8 信號轉導可以抑制TGF-β/ALK5 依賴的SMAD3 的轉錄活性，可解釋為不同劑量TGF-β 造成了R-SMAD 的差異性激活所致［55］。

盡管上述研究結果提示TGF-β 通路的異常激活可能是椎間盤退變的原因之一，但其證據(jù)仍不充足。首先，研究對象主要針對鼠和兔等實驗動物，而針對人類椎間盤組織中TGF-β 對椎間盤退變的影響仍缺少相關研究證據(jù)；其次，TGF-β 通路的表達水平和R-SMAD 的激活隨年齡和椎間盤退變的進展而發(fā)生變化，但目前TGF-β 對椎間盤退變影響的相關研究模型主要為機械暴力所致，而非年齡老化所致。因此，在后續(xù)研究中有必要探究不同年齡階段和不同椎間盤退變階段個體中TGF-β 表達情況對疾病進展的作用；最后，TGF-β 信號轉導在椎間盤退變中的不良反應作用機制仍不清楚，有待于進一步研究。

6 TGF-β 通路用于椎間盤退變治療的前景

目前，椎間盤退變的TGF-β 通路療法大致可分為以下幾種策略：①激活的TGF-β 通路直接增加細胞外基質沉積、抑制細胞流失和炎癥反應，直接修復退變的椎間盤；②利用TGF-β 通路與組織工程學手段相結合，用以間接修復退變的椎間盤。一方面，TGF-β 可與其他細胞因子發(fā)揮協(xié)同作用，促進間充質干細胞分化為髓核樣細胞，增加椎間盤成熟細胞數(shù)量，緩解椎間盤退變的速度［56］；為進一步驗證分化的髓核樣細胞生理特性和功能，需針對間充質干細胞分化而成的髓核樣細胞進行表型檢測［57］。另一方面，TGF-β 介導了間充質干細胞和髓核細胞間的信息傳遞，其利于椎間盤細胞的表型穩(wěn)定，并促進退變椎間盤的再修復［58］。此外，隨著可注射型水凝膠和自組裝肽支架等多種組織工程生物材料等迅速發(fā)展，將TGF-β 與上述材料進行復合可以實現(xiàn)細胞因子的緩釋，避免了TGF-β 爆發(fā)性釋放造成的局部毒性效應，并可長期發(fā)揮對間充質干細胞的誘導分化作用，有效驅動間充質干細胞介導的椎間盤再生［59］。然而，TGF-β 信號的過度激活已被證明會加速椎間盤的退化，因此，TGF-β 信號的適度激活是椎間盤治療的關鍵。抑制TGF-β 的異常表達也是一種治療椎間盤退變有效的手段。局部應用TGF-β 抑制劑治療椎間盤退變具有較大研究潛力，但仍需要對給藥劑量、給藥時間和給藥方法等具體問題進行探索篩選，開發(fā)出一套適合TGF-β 的抑制給藥系統(tǒng)以緩解TGF-β 過度表達對椎間盤的破壞。

7 總結

TGF-β 信號在椎間盤的發(fā)育、生長和組織內穩(wěn)態(tài)調控中均起到重要作用。TGF-β 信號的激活對椎間盤退變具有良好的治療前景，但過度激活TGF-β 信號則會導致椎間盤的破壞，加速退變的進程。因此，后續(xù)研究還需進一步探究椎間盤退變的不同疾病進程階段TGF-β 信號的表達情況和相應分子機制，只有深入理解TGF-β 信號對椎間盤退變的作用機制，才能安全有效地實現(xiàn)TGF-β 治療椎間盤退變的臨床轉化。