徐 騰 陳 云 楊 鑫 覃 堯 何曉濤 韓蒙蒙 楊雨輝

（海南大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院 海南省熱帶動(dòng)物繁育與疾病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南海口570228）

熱應(yīng)激會(huì)嚴(yán)重影響雞的生長(zhǎng)[1-2]，破壞機(jī)體重要組織器官，尤其是對(duì)心肌組織的損傷更為顯著[3]，并導(dǎo)致雞因心力衰竭而應(yīng)激性猝死[4]。研究表明，熱應(yīng)激狀態(tài)下雞的心肌細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的顆粒變性，出現(xiàn)空泡，核固縮甚至核碎裂[5]。張曉輝[6]研究發(fā)現(xiàn)阿司匹林通過(guò)誘導(dǎo)Hsp90表達(dá)有效抵抗體內(nèi)外雞心肌細(xì)胞熱應(yīng)激病理?yè)p傷。因此，探尋合適的藥物來(lái)減緩熱應(yīng)激對(duì)心臟組織的損傷尤為關(guān)鍵。蟛蜞菊（Wedelia chinensis）為菊科多年生草本植物，味微苦、甘、性涼，具有清熱、解毒、消炎、止咳、抗癌等功效[7]。Darah等[8]研究者發(fā)現(xiàn)，蟛蜞菊甲醇提物可以有效地抑制蠟樣芽孢桿菌的生長(zhǎng)作用。Huang等[9]研究發(fā)現(xiàn)在蟛蜞菊中提取的萜類(lèi)化合物具有有效的抗血管生成活性。何仁春等[10]在鵝的日糧中加入蟛蜞菊可以有效提升鵝的生產(chǎn)性能和養(yǎng)分利用率，但蟛蜞菊提取物能否緩解雞因熱應(yīng)激所導(dǎo)致的心肌組織損傷目前還未見(jiàn)報(bào)道。因此本試驗(yàn)通過(guò)構(gòu)建文昌雞胚原代心肌細(xì)胞體外模型，探究蟛蜞菊醇提物對(duì)原代雞胚心肌細(xì)胞抗熱應(yīng)激的保護(hù)作用，為后續(xù)開(kāi)發(fā)蟛蜞菊作為中藥飼料添加劑提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)藥物：蟛蜞菊，采自海南省海口市周邊。

試驗(yàn)種蛋：購(gòu)自海南省某文昌雞孵化場(chǎng)。

DMEM/F12 培養(yǎng)基（Hyclone）；胎牛血清（Hyclone）；100 倍青鏈霉素溶液（Gibco）；9 膠原酶Ⅱ（Sigma）；5-溴脫氧尿嘧啶核苷（Brdu，Sigma）；噻唑藍(lán)（MTT，Biosharp）；乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒（南京建成）；谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）試劑盒（南京建成）；BCA蛋白濃度試劑盒（南京建成）；DMSO 溶液（Biotopped）；RIPA裂解液（碧云天）；苯甲基磺酰氟（PMSF，碧云天）；Hsp70小鼠單克隆抗體（Abcam）；GAPDH單克隆抗體（上海生工）；HRT標(biāo)記的山羊抗小鼠抗體（上海生工）。

1.2 試驗(yàn)主要儀器

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（BUCHI）；低溫高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf）；CO2恒溫培養(yǎng)箱（HealForce）；潔凈工作臺(tái)（蘇潔凈化）；生物倒置顯微鏡（Motic）；酶標(biāo)儀（Thermo）；微量振蕩器（江蘇新康醫(yī)療）；恒溫水浴鍋（江蘇金怡）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 蟛蜞菊醇提物的制備

采用水浴輔助醇提法[11]提取蟛蜞菊醇提物。將蟛蜞菊莖葉用蒸餾水洗凈后，放置于60 ℃的烘箱中烘干并粉碎過(guò)40目篩。取10 g粉末與100 ml 95%乙醇（固液比為1∶10），60 ℃水浴30 min，抽濾，收集濾液；回收濾渣，再加入100 ml 95%乙醇，重復(fù)操作3次，合并濾液。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至浸膏，加入DMSO溶解得到1 g/ml 母液。用DMEM/F12 培養(yǎng)基稀釋至所需濃度（DMSO 終濃度≤0.1%）。

1.3.2 原代雞胚心肌細(xì)胞的提取與培養(yǎng)

參考魏宗波等[12]和Gao 等[13]的方法，取12 胚齡文昌雞胚心臟，用D-Hank's 洗滌并剪碎至1 mm3大小。加入0.12%膠原酶Ⅱ溶液并37 ℃水浴消化8 min，吸取上清液經(jīng)過(guò)四層紗布后加入細(xì)胞培養(yǎng)液終止消化，棄去第一次消化液，重復(fù)上述至無(wú)明顯組織塊為止。將全部細(xì)胞懸液900 r/min離心6 min，棄上清，用培養(yǎng)液重懸沉淀并接種于培養(yǎng)皿放置在37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱差速貼壁1.5～2 h。取細(xì)胞懸液用0.1 mM Brdu的培養(yǎng)液稀釋至相應(yīng)濃度，放置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱待48 h后換正常培養(yǎng)液。

1.3.3 蟛蜞菊醇提物對(duì)原代雞胚心肌細(xì)胞活性檢測(cè)

采用MTT法測(cè)定不同濃度的蟛蜞菊醇提物對(duì)原代雞胚心肌細(xì)胞活性的影響。將細(xì)胞密度為1×104個(gè)/ml的細(xì)胞懸液接種到96孔板中，在分離純化后，分別加入0、0.05、0.5、5、50 μg/ml蟛蜞菊醇提物培養(yǎng)液，每個(gè)濃度設(shè)置4個(gè)重復(fù)孔。將細(xì)胞放置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，每孔加入20 μl MTT（5 mg/ml），待培養(yǎng)4 h后棄培養(yǎng)液，再加入150 μl DMSO，酶標(biāo)儀570 nm波長(zhǎng)下測(cè)定各孔的吸光值。

1.3.4 蟛蜞菊醇提物對(duì)原代雞胚心肌細(xì)胞抗熱應(yīng)激活性檢測(cè)

采用MTT法測(cè)定不同濃度蟛蜞菊醇提物對(duì)原代雞胚心肌細(xì)胞減緩熱應(yīng)激損傷的保護(hù)作用。將細(xì)胞密度為1×104個(gè)/ml的細(xì)胞懸液接種到96孔板中，在分離純化后，將細(xì)胞分為熱應(yīng)激組與常溫組：加入0、1.25、5、20 μg/ml蟛蜞菊醇提物培養(yǎng)液，每個(gè)濃度設(shè)置4個(gè)重復(fù)孔。熱應(yīng)激組將細(xì)胞板放置于45 ℃培養(yǎng)箱中處理4 h；常溫組放置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h 后，每孔加入20 μl MTT（5 mg/ml），待培養(yǎng)4 h后棄培養(yǎng)液，再加入150 μl DMSO，酶標(biāo)儀570 nm波長(zhǎng)下測(cè)定各孔的吸光值。

1.3.5 谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)和乳酸脫氫酶（LDH）含量測(cè)定

收集經(jīng)熱應(yīng)激和常溫處理后的細(xì)胞培養(yǎng)上清液，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作檢測(cè)。

1.3.6 Hsp70蛋白表達(dá)含量測(cè)定

將細(xì)胞分為熱應(yīng)激組（加入0、1.25、5、20 μg/ml蟛蜞菊醇提物）和空白常溫組。使用含有1%PMSF的RIPA 裂解液提取總蛋白，使用BCA 試劑盒測(cè)量總蛋白的濃度。然后采用Western Blot 技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Hsp70蛋白表達(dá)。將蛋白樣品與SDS-loding Buffer 充分混勻后，煮沸變性10 min，-20 ℃下儲(chǔ)存。在SDSPAGE電泳后，100 V電轉(zhuǎn)90 min將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上。取轉(zhuǎn)印好的PVDF 膜放置于含有5%脫脂奶粉的PBST 溶液中室溫封閉2 h，一抗4 ℃孵育過(guò)夜，二抗室溫孵育1 h，顯影并使用Gel-Pro Analyzer 對(duì)膜上的條帶進(jìn)行灰度定量分析。

1.3.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

運(yùn)用SPSS23.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，采用單因素方差分析（ANOVA），分析各組間差異的顯著性，其中用“**”表示為P＜0.01 極顯著差異，用“*”表示為P＜0.05顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 文昌雞胚原代心肌細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀(guān)察

經(jīng)消化后的原代雞胚心肌細(xì)胞大多數(shù)呈圓形并懸浮于細(xì)胞培養(yǎng)液中，如圖1中A所示。純化培養(yǎng)48 h后，細(xì)胞基本上都已經(jīng)貼壁伸展，伸出偽足并呈現(xiàn)梭形，同時(shí)細(xì)胞出現(xiàn)節(jié)律性自發(fā)搏動(dòng)，如圖1中B 所示。熱應(yīng)激處理4 h后，細(xì)胞開(kāi)始出現(xiàn)萎縮現(xiàn)象，胞漿中出現(xiàn)大量細(xì)小的空泡，如圖1中C所示。

圖1 原代雞胚心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀(guān)察圖（×400）

2.2 蟛蜞菊醇提物對(duì)原代雞胚心肌細(xì)胞活性的影響

圖2 不同濃度的蟛蜞菊醇提物對(duì)原代雞胚心肌細(xì)胞活性影響

如圖2 所示，隨著醇提物濃度增高，細(xì)胞活性總體呈上升趨勢(shì)，且都高于濃度為0 μg/ml。當(dāng)濃度為50 μg/ml和5 μg/ml時(shí)，細(xì)胞活性分別達(dá)到了（124.21±5.94）%、（115.34±3.10）%，活性極顯著升高（P＜0.01）。

2.3 蟛蜞菊醇提物對(duì)原代雞胚心肌細(xì)胞抗熱應(yīng)激活性的影響

如圖3 所示，隨著蟛蜞菊醇提物濃度的增高，熱應(yīng)激組OD 值也隨之增大。熱應(yīng)激組中濃度為5 和20 μg/ml 時(shí)，OD 值較濃度為0 μg/ml 的OD 值極顯著升高了17.98%和25.93%（P＜0.01）。熱應(yīng)激組總體OD值均低于常溫組總體OD值，但隨著醇提物濃度的增高，熱應(yīng)激組與常溫組兩者OD值差距逐漸減少，在濃度為5～20 μg/ml 時(shí)，兩者之間無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。

圖3 不同濃度的蟛蜞菊醇提物對(duì)原代雞胚心肌細(xì)胞抗熱應(yīng)激活性影響

2.4 蟛蜞菊醇提物對(duì)原代雞胚心肌細(xì)胞上清液中AST和LDH酶含量檢測(cè)

如圖4所示，熱應(yīng)激組AST和LDH酶含量在醇提物濃度為0 μg/ml時(shí)均達(dá)到最高值，隨著醇提物濃度的升高而降低，在濃度為5～20 μg/ml時(shí)極顯著下降至最低（P＜0.01）。熱應(yīng)激組AST和LDH酶含量均高于常溫組。在濃度為0 μg/ml 時(shí)，熱應(yīng)激組AST 和LDH 酶分別極顯著高于常溫組的29.00%與17.54%（P＜0.01），但隨著醇提物濃度的升高，兩者之間差距逐漸縮小，在濃度為5～20 μg/ml時(shí)，含量差距無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

圖4 不同濃度的蟛蜞菊醇提物對(duì)細(xì)胞上清液中AST（A）和LDH（B）濃度的含量影響

2.5 蟛蜞菊醇提物對(duì)原代雞胚心肌細(xì)胞的Hsp70蛋白表達(dá)的影響

如圖5 所示，熱應(yīng)激空白組心肌細(xì)胞的Hsp70 表達(dá)量是常溫空白組的1.92 倍，表達(dá)量極顯著增加（P＜0.01）。熱應(yīng)激組中，隨著醇提物濃度的升高，Hsp70表達(dá)量也隨之升高。相比較于濃度為0 μg/ml 時(shí)，濃度為20 μg/ml 的Hsp70 表達(dá)量分別極顯著升高了33.14%（P＜0.01）。

3 討論

3.1 熱應(yīng)激對(duì)文昌雞胚原代心肌細(xì)胞活性的影響

高溫、高密度飼養(yǎng)環(huán)境下的畜禽常發(fā)生熱應(yīng)激反應(yīng)[14]。急性熱應(yīng)激對(duì)機(jī)體心肌組織影響最為明顯，不僅會(huì)破壞心肌細(xì)胞之間的緊密連接，還會(huì)損害細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能[15]。本研究圖1 中的B 和C 對(duì)比說(shuō)明，在熱應(yīng)激處理后心肌細(xì)胞的形態(tài)上出現(xiàn)了明顯皺縮和空泡現(xiàn)象，與Wu 等[16]、Xu等[17]研究結(jié)果一致。圖3結(jié)果表明，熱應(yīng)激組OD 值均低于常溫組說(shuō)明熱應(yīng)激降低心肌細(xì)胞活性。

圖5 不同濃度的蟛蜞菊醇提物對(duì)原代雞胚心肌細(xì)胞的Hsp70 蛋白表達(dá)的影響

3.2 蟛蜞菊醇提物對(duì)原代雞胚心肌細(xì)胞抗熱應(yīng)激保護(hù)作用

蟛蜞菊作為重要的南藥資源，因其資源含量豐富，廉價(jià)易得，且富含萜類(lèi)、黃酮類(lèi)、生物堿和揮發(fā)油類(lèi)等多種活性物質(zhì)，具有抗菌、抗腫瘤、抗氧化和抗病毒的作用效果[18-21]。Huang 等[19]研究表明蟛蜞菊水提物可以有效緩解小鼠右旋糖酐硫酸鈉誘導(dǎo)的結(jié)腸炎。Tsai等[20]研究表明，蟛蜞菊提取物通過(guò)阻礙AR信號(hào)通路抑制前列腺癌的生長(zhǎng)。劉漫宇等[21]研究表明，蟛蜞菊醇提物通過(guò)p38蛋白使CNE-1細(xì)胞發(fā)生G2/M期阻滯，從而抑制CNE-1細(xì)胞的增殖。本研究中圖2結(jié)果表明，隨著蟛蜞菊醇提物濃度升高，心肌細(xì)胞活性也隨之升高，這說(shuō)明適量的蟛蜞菊醇提物可以有效提高心肌細(xì)胞活性。圖3 結(jié)果顯示熱應(yīng)激下的細(xì)胞活性表現(xiàn)出對(duì)醇提物濃度依賴(lài)性，在濃度為20 μg/ml達(dá)到最高值，說(shuō)明蟛蜞菊醇提物對(duì)熱應(yīng)激處理下的心肌細(xì)胞起保護(hù)作用，緩解熱應(yīng)激對(duì)心肌細(xì)胞的損傷。

3.3 蟛蜞菊醇提物對(duì)熱應(yīng)激處理下原代雞胚心肌細(xì)胞釋放AST和LDH酶的影響

AST和LDH廣泛存在于動(dòng)物機(jī)體的心臟、肝臟和肌肉等器官組織中，是反應(yīng)心肌細(xì)胞損傷程度的重要指標(biāo)[5]。當(dāng)正常細(xì)胞在受到某種應(yīng)激情況下，細(xì)胞膜的通透性會(huì)增加，導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)中的AST 和LDH 酶釋放[6]。秦士貞[22]研究發(fā)現(xiàn)，在高溫條件下心肌細(xì)胞上清液中的LDH 和AST 酶活性會(huì)隨著高溫處理時(shí)間的增長(zhǎng)而增強(qiáng)。本研究表明原代心肌細(xì)胞在熱應(yīng)激作用下，上清液中的AST和LDH酶含量對(duì)比于常溫組顯著增高，說(shuō)明熱應(yīng)激對(duì)心肌細(xì)胞造成了明顯的損傷。但是隨著加入蟛蜞菊醇提物濃度升高，上清液中的AST 和LDH 酶含量在逐漸減少，并均在醇提物濃度為20 μg/ml 時(shí)降低到最低值，接近常溫組含量。結(jié)果表明，經(jīng)適當(dāng)濃度蟛蜞菊醇提物處理的原代心肌細(xì)胞可以在一定程度上緩解熱應(yīng)激所帶來(lái)的損傷。

3.4 蟛蜞菊醇提物對(duì)熱應(yīng)激處理下原代雞胚心肌細(xì)胞表達(dá)Hsp70的影響

Hsp70是熱休克蛋白重要且高度保守的成員，其分子質(zhì)量大約為70 KD[23]，具有調(diào)控細(xì)胞凋亡、提升機(jī)體免疫、增強(qiáng)細(xì)胞抗氧化性和分子伴侶等生物功能[24]。研究報(bào)道顯示，在熱應(yīng)激條件下Hsp70 通過(guò)過(guò)量表達(dá)修復(fù)機(jī)體因應(yīng)激所產(chǎn)生的損傷并緩解后期應(yīng)激的影響[25]。本研究結(jié)果表明常溫組的心肌細(xì)胞內(nèi)的Hsp70 表達(dá)量比較低，熱應(yīng)激處理后細(xì)胞的Hsp70表達(dá)量極顯著上升，也驗(yàn)證了上述觀(guān)點(diǎn)。Tang等[26]研究人員發(fā)現(xiàn)，純化的迷迭香提取物可以有效地提高在熱應(yīng)激下肉雞的Hsp70和晶狀體蛋白αB（CRYAB）的表達(dá)，緩解肉雞受熱應(yīng)激的影響。Xu 等[27]研究表明，輔酶Q10通過(guò)增加熱休克因子1（HSF1）的表達(dá)，加速HSF1與熱休克元件（HSE）的結(jié)合，增加Hsp70的表達(dá)保護(hù)熱應(yīng)激下的雞原代心肌細(xì)胞。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，熱應(yīng)激條件下心肌細(xì)胞的Hsp70 表達(dá)量表現(xiàn)出濃度依賴(lài)性，并在濃度為20 μg/ml 達(dá)到最高。結(jié)果表明Hsp70 在原代心肌細(xì)胞抗熱應(yīng)激效應(yīng)中起到重要作用，蟛蜞菊醇提物有效緩解心肌細(xì)胞抗熱應(yīng)激損傷可能與提升細(xì)胞Hsp70的表達(dá)量其密切相關(guān)。

4 結(jié)論

綜上所述，適當(dāng)濃度的蟛蜞菊醇提物對(duì)原代雞胚心肌細(xì)胞無(wú)毒性，并具有提升細(xì)胞活性作用。同時(shí)，蟛蜞菊醇提物可以有效緩解熱應(yīng)激下原代雞胚心肌細(xì)胞的損傷，在醇提物濃度為20 μg/ml時(shí)效果最好并顯著提高了心肌細(xì)胞Hsp70的表達(dá)。