和燦興

（云南省麗江市玉龍縣畜牧獸醫(yī)局 674100）

結(jié)核分枝桿菌共有三個型， 分別為牛型結(jié)核分枝桿菌、人型結(jié)核分枝桿菌以及禽型結(jié)核分枝桿菌， 其中牛型結(jié)核分枝桿菌對牛的感染力最強(qiáng)， ?；冀Y(jié)核病時多數(shù)是由此種病原導(dǎo)致的[1]。 患病牛只臨床表現(xiàn)為低燒、咳嗽，伴有生產(chǎn)繁殖性能降低，如救治不及時則會導(dǎo)致牛只死亡。 人如果飲用了患有結(jié)核病牛的牛乳或肉質(zhì)，則會感染該病。 牛結(jié)核病不僅對牛產(chǎn)業(yè)發(fā)展產(chǎn)生了巨大的影響，也嚴(yán)重危害人類的身體健康。 所以，找到快速、準(zhǔn)確的檢測方法是控制牛結(jié)核病發(fā)生、發(fā)展的重要手段之一。

1 病原學(xué)方法

患病牛的病變器官、痰液、尿液、糞便、乳汁以及多數(shù)分泌物中均有結(jié)核分枝桿菌的存在， 可以通過無菌方法獲得以上病料，做涂片鏡檢或細(xì)菌培養(yǎng)，必要時也可以進(jìn)行動物接種。 涂片鏡檢法在這三種方法中是較為便捷且迅速的診斷方法， 但是該方法檢出陽性率較低，涂片后，在顯微鏡下觀察很難分辨出細(xì)菌是活躍狀態(tài)還是已經(jīng)死亡[2]， 所以該方法僅作為診斷的輔助依據(jù)。 結(jié)核分枝桿菌的細(xì)菌培養(yǎng)對外在條件的要求較高，且在體外環(huán)境下該細(xì)菌生長較為緩慢， 需要半個月到一個月的時間菌落才能被看見，這種方法耗時較長，一般不作為診斷方法。

2 免疫學(xué)方法

2.1 結(jié)核菌素皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)

這種方法是世界衛(wèi)生組織推薦的用來檢測牛結(jié)核病的診斷方法，結(jié)核菌素皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)是用牛結(jié)核菌素進(jìn)行皮內(nèi)接種，利用遲發(fā)性變態(tài)反應(yīng)的原理，72～96h 后根據(jù)牛接種皮服的腫脹程度，來確定牛是否已經(jīng)被結(jié)核分枝桿菌感染。 這種方法較病原學(xué)方法有很大的優(yōu)勢，不僅檢出率高，而且耗時較短，但是這種診斷方法也有一定的缺點(diǎn)， 就是接種后如果牛的接種部位受到物理性或化學(xué)性的刺激時也會表現(xiàn)為腫脹， 這種腫脹很難與接種引發(fā)的腫脹相鑒別，所以容易產(chǎn)生一定的誤差。 此外，這種方法還不能鑒別是由于牛只接種結(jié)核疫苗后產(chǎn)生的變態(tài)反應(yīng)還是天然感染后產(chǎn)生的反應(yīng)， 所以在應(yīng)用結(jié)核菌素皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)之前應(yīng)當(dāng)先對牛的接種史進(jìn)行了解[3]。

2.2 Elisa 法

Elisa 法也稱酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)，是通過酶結(jié)合特定的抗原或抗體后發(fā)生顯色反應(yīng)而判斷牛只體內(nèi)是否含有某種病原的方式，這種方法操作較為簡單，特異性很高，在檢測牛結(jié)核病方面較為實(shí)用，但在實(shí)際的生產(chǎn)中這種方法并沒有被推廣，這是因?yàn)榻Y(jié)核分枝桿菌的抗原性不強(qiáng)， 屬間和種間存在的共同抗原決定簇是如何發(fā)揮作用的還未可知， 結(jié)合分支桿菌激發(fā)的機(jī)體體液免疫是如何發(fā)揮作用的也尚需要更深層次的研究， 所以目前來說，用Elisa 法來檢測牛結(jié)核病仍處于試驗(yàn)階段。

2.3 膠體金法

膠體金法是許多疾病診斷中常用的免疫學(xué)診斷方法之一，這種方法特異性和敏感性都很高， 而且不需要酶標(biāo)儀等其他的儀器，肉眼就可以判讀結(jié)果，在目前我國獸醫(yī)臨床中應(yīng)用交廣。作為膠體金標(biāo)記抗原的常用抗原蛋白為MPB70 和MPB83，這兩種抗原蛋白作為標(biāo)記抗原時，結(jié)核病的檢出率大大提升，這種方法配合結(jié)核菌素皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)聯(lián)合使用， 能夠較為準(zhǔn)確地診斷出牛是否患有結(jié)核病。

2.4 γ-干擾素診斷法

這種方法在1990 年就已經(jīng)被建立起來了，其原理是體外培養(yǎng)的致敏淋巴細(xì)胞接收到特異性抗原的刺激后會被活化， 從而分泌出γ-干擾素，再用Elisa 法對γ-干擾素的含量進(jìn)行測定，就可以判斷出牛只是否患有結(jié)核病。 這個方法在澳大利亞、 阿根廷、美國等國家已經(jīng)進(jìn)行了生產(chǎn)試驗(yàn)，其檢出率在77%～93%，比結(jié)核菌素皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)的檢出率高10%左右。

2.5 免疫過氧化物酶法

這種方法是通過單克隆抗體來檢測結(jié)核分枝桿菌的表面抗原MPB70，這種方法與其他方法相比檢測速度更快，成本較低，對操作人員的要求較低， 特別是在分枝桿菌混合感染的過程中更能顯現(xiàn)出優(yōu)勢。

3 分子生物學(xué)法

3.1 PCR 法

PCR 法早在1989 年就在結(jié)核病的診斷方面發(fā)揮作用了，30年來，學(xué)者們不斷完善這一方法，現(xiàn)在這一方法已經(jīng)足夠靈敏且特異性很高，但是由于PCR 操作對環(huán)境有一定的要求，要避免操作過程中污染造成的假陰性或假陽性， 所以使用PCR 法進(jìn)行牛結(jié)核病的診斷時，要嚴(yán)格按照操作規(guī)程進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，才能保證結(jié)果的可靠。

3.2 DNA 核酸探針技術(shù)

分枝桿菌屬有共同的抗原基因?yàn)?ku， 所以想要利用DNA核酸探針技術(shù)來檢測牛只體內(nèi)是否存在結(jié)核分枝桿菌則需要合成特異性的探針才能獲得準(zhǔn)確的結(jié)果。

牛結(jié)核病的診斷技術(shù)大體可以分為三類， 分別是病原學(xué)檢測、血清學(xué)檢測和分子生物學(xué)檢測，不論哪種方法都有其優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)， 各個養(yǎng)殖戶應(yīng)當(dāng)選擇適合自己實(shí)際情況的方法對牛場內(nèi)的牛只進(jìn)行結(jié)核病的普查，也可以多種方法配合使用，以達(dá)到更好的效果。