杜雪飛,王文君,李雪玉,周 華

(南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院,江蘇南京 211816)

基于綠色化學(xué)和可持續(xù)發(fā)展的理念,過去20年中生物技術(shù)得到了快速的發(fā)展[1]。酶是能夠催化復(fù)雜化學(xué)反應(yīng)的生物催化劑,具有高活性、高選擇性和高特異性等優(yōu)良的催化性能,已經(jīng)在生物技術(shù)領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。為進(jìn)一步拓寬酶的應(yīng)用領(lǐng)域,強(qiáng)化酶催化性能,提高酶活性和增加酶催化穩(wěn)定性已成為近年來生物工程領(lǐng)域的研究熱點[2]。糖是一類重要的化合物,它不只是簡單的能源物質(zhì),還是參與生理和病理過程的重要信息分子,同時不同的糖類物質(zhì)對酶的活性及催化穩(wěn)定性均有不同程度的保護(hù)促進(jìn)作用,如海藻糖對酶活性的保護(hù)作用已進(jìn)行了較為深入的研究[3]。當(dāng)前也有將葡聚糖應(yīng)用于酶催化過程中的相關(guān)報道,本文將對葡聚糖在酶固定化和酶催化反應(yīng)過程中的應(yīng)用進(jìn)展進(jìn)行綜述,分析葡聚糖對酶催化性能的影響因素,為葡聚糖在酶催化中的進(jìn)一步應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 酶催化應(yīng)用及存在問題

1.1 酶催化在各領(lǐng)域的應(yīng)用概況

酶自古以來就被用于食品和飲料產(chǎn)品的生產(chǎn),如奶酪、啤酒、白酒和醋等傳統(tǒng)食品的制造。隨著生物技術(shù)的不斷進(jìn)步,酶的應(yīng)用已從食品領(lǐng)域逐漸擴(kuò)展到醫(yī)藥、大宗化學(xué)品、日用化學(xué)品和環(huán)境保護(hù)等領(lǐng)域[4]。

1.1.1 酶在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用 近年來,藥物結(jié)構(gòu)變得越來越復(fù)雜,制藥過程的綠色化和環(huán)境友好性要求也越來越高,故尋找低成本、安全綠色的生物催化過程來替代傳統(tǒng)的化學(xué)催化過程是發(fā)展趨勢[5]。Ⅱ型糖尿病治療藥物西格列汀的合成,是近年來酶在制藥工業(yè)中的一個重要的成功應(yīng)用實例,篩選得到節(jié)桿菌中轉(zhuǎn)氨酶用于西格列汀前體的不對稱胺化,成功促使該藥物成為DPP-4抑制劑中的首選藥物[6]。阿托伐他汀是一類通過阻斷肝臟中的膽固醇的合成來降低人體內(nèi)膽固醇含量的一類藥物[7],開發(fā)了兩步法合成三種酶,包括乙酰丙醇脫鹵酶、葡萄糖脫氫酶和還原酮酶,采用多酶級連的方法合成了阿托伐他汀的關(guān)鍵中間體羥基腈[8]。與傳統(tǒng)化學(xué)法相比不僅減少了成本,還降低了對環(huán)境的污染[9]。

1.1.2 酶在食品領(lǐng)域的應(yīng)用 目前酶技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于乳制品、肉制品、飲料果汁、油脂等食品領(lǐng)域中。劉瑩等[10]采用果膠酶、纖維素酶和木聚糖酶制備芒果混汁和蘋果混汁,在降低酶用量的同時,溫和的反應(yīng)條件更好地保留了水果的營養(yǎng)成分,從而制備出了高出汁率、高營養(yǎng)的果汁。Yang等[11]研究發(fā)現(xiàn),葡萄糖氧化酶與木瓜蛋白酶及木聚糖酶復(fù)合使用,能夠催化面團(tuán)中類胡蘿卜素氧化,從而較好地改善面團(tuán)褐變現(xiàn)象。隨著人們對于食品安全及品質(zhì)的日益注重,安全高效的酶制劑越來越受到食品生產(chǎn)者的青睞。

1.1.3 酶在日用化學(xué)品制造領(lǐng)域中的應(yīng)用 相比于傳統(tǒng)日化行業(yè),利用酶來生產(chǎn)日化品不僅能夠降低能耗,還有效減少了環(huán)境污染。蛋白酶作為胰腺提取物在洗滌劑中的應(yīng)用歷史悠久,最新研究[12]開發(fā)了能夠在低溫下使用的親冷酶并應(yīng)用到洗滌劑產(chǎn)品中,親冷酶可在寒冷的環(huán)境中使用,其作用過程中不需要加熱,這將有效的節(jié)約能源并降低環(huán)境壓力。

1.1.4 酶在環(huán)境保護(hù)領(lǐng)域中的應(yīng)用 有機(jī)農(nóng)藥的使用和大量的印染廢水已成為當(dāng)前工業(yè)領(lǐng)域最重要的水體污染之一,酶在環(huán)境保護(hù)領(lǐng)域中的應(yīng)用已經(jīng)逐漸受到重視[13]。漆酶能夠催化含有發(fā)色基團(tuán)的化合物如蒽醌、三芳基甲烷、靛青類和偶氮類染料等,因而常被用作生物漂白處理染料廢水[14-15]?？祻膶毜萚16]研究發(fā)現(xiàn)白腐漆酶在最適脫色條件下對活性藍(lán)(RB亮藍(lán))的脫色率達(dá)到了90%,真菌表達(dá)的漆酶和氧化還原介體組成的漆酶介質(zhì)系統(tǒng),可以將靛藍(lán)染料氧化為無色的靛紅染料,并且可以減少用水量及污染物的產(chǎn)生。

1.2 酶催化應(yīng)用過程中存在的問題

酶雖然能夠在溫和條件下進(jìn)行催化反應(yīng),且具有很高的底物專一性和環(huán)境友好特點,然而應(yīng)用于規(guī)?；a(chǎn)品制備過程中的酶來源較窄,空間結(jié)構(gòu)相對柔性易失活,催化穩(wěn)定性差,客觀上限制了其應(yīng)用的進(jìn)一步擴(kuò)大。因此增強(qiáng)酶的催化性能,提高其操作穩(wěn)定性是當(dāng)前酶工程領(lǐng)域研究的熱點課題。

針對酶催化來源較窄的問題,近年來隨著DNA重組和蛋白質(zhì)工程技術(shù)的迅速發(fā)展,宏基因組技術(shù)、基因挖掘技術(shù)和酶的定向進(jìn)化技術(shù)已經(jīng)逐漸成為新酶篩選和改造的主流技術(shù),已經(jīng)有越來越多的高性能酶成功運用于酶催化過程中[17]。針對工業(yè)生產(chǎn)中酶活性低穩(wěn)定性差的問題,目前研究主要集中于兩方面:一是基于結(jié)構(gòu)與功能的構(gòu)效關(guān)系,從分子改造的角度進(jìn)行酶活性改造;二是基于穩(wěn)定酶催化活性中心的微環(huán)境出發(fā)[18],采用工程手段對酶的催化活性進(jìn)行強(qiáng)化,包括酶的固定化、酶催化反應(yīng)過程的調(diào)控等[19]。葡聚糖又被稱為右旋糖苷,是一種由葡萄糖單體組成的以糖苷鍵相連的一種同型多糖[20]。近年來,關(guān)于葡聚糖在酶催化性能強(qiáng)化中的研究得到了越來越多的重視,下文將對葡聚糖在酶固定化和酶催化過程中應(yīng)用展開具體綜述。

2 葡聚糖在酶固定化中的應(yīng)用

固定化酶是將生物酶鏈接固定到固體載體上,通過固體載體來限制生物酶三維結(jié)構(gòu)變化,從而提高酶的儲存穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性(高溫或低溫)、操作穩(wěn)定性(極端pH或有機(jī)溶劑)。同時固定載體的引入使酶可以從反應(yīng)溶液中較為容易地分離出來,實現(xiàn)了催化劑的重復(fù)利用,有效促進(jìn)了酶在工業(yè)生產(chǎn)中的運用[21-22]。

2.1 葡聚糖作為酶交聯(lián)劑

酶與載體的連接方式會直接影響到固定化酶的活性的影響。由于空間位阻效應(yīng)或構(gòu)象限制,通過共價鍵直接固定化的酶即使固定率較高,但其活性和回收率通常較低。間隔臂的引入在一定程度上解決了這一問題。研究表明[23],通過乙二胺、鹽酸乙二胺、琥珀酸酐和戊二醛等交聯(lián)劑的作用,可以使固定化酶的活性回收率得到提高。但活性回收率的改善會受到交聯(lián)劑鏈長的限制,由于短鏈交聯(lián)劑對酶的交聯(lián)限制了酶構(gòu)象的完整展示,從而影響了酶催化活性的發(fā)揮,故利用長鏈交聯(lián)劑對酶進(jìn)行修飾交聯(lián),實現(xiàn)酶的柔性固定,能夠顯著提高固定化酶的催化活性和穩(wěn)定性。

葡聚糖含有大量的羥基,具有較強(qiáng)的結(jié)合水能力,同時葡聚糖具有良好的生物相容性,其結(jié)構(gòu)中含有的羥基可被氧化成醛基用于與酶表面氨基發(fā)生特異性反應(yīng)。以醛基葡聚糖為交聯(lián)劑對吸附固定的酶進(jìn)一步交聯(lián),通過酶分子與葡聚糖在載體內(nèi)部交聯(lián)成網(wǎng)的方法提高固定化酶的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。Ren等[24]研究發(fā)現(xiàn),利用中空二氧化硅微球吸附固定脂肪酶CRL,并使用醛基葡聚糖進(jìn)一步交聯(lián),脂肪酶的加載量線性增加至(171±3.4) mg/g,固定化CRL的熱穩(wěn)定性和對pH的耐受性均有顯著提高,6次重復(fù)使用后剩余活性為82%±2.1%。Cesar等[25]以青霉素G?；?、羥腈裂解酶、乙醇脫氫酶和兩種不同的腈酶為原料,用醛基葡聚糖經(jīng)沉淀和交聯(lián)制備交聯(lián)酶聚合體(CLEAs),與戊二醛相比,以醛基葡聚糖為交聯(lián)劑,酶活性損失顯著降低。牟海霞[26]利用交聯(lián)酶聚集體技術(shù),采用醛基葡聚糖作為交聯(lián)劑,對腈水合酶進(jìn)行固定化,獲得腈水合酶交聯(lián)酶聚集體,酶活回收率為49.63%。同游離酶相比,固定化酶顯示了有更好的pH、熱穩(wěn)定性、以及對高濃度底物的耐受性。這些研究表明了葡聚糖作為長鏈交聯(lián)劑在酶固定化過程中能夠保證固定化酶構(gòu)象的完整性有效提高酶的催化活性、穩(wěn)定性和酶的回收利用率。相比于其它交聯(lián)劑,葡聚糖因其良好的生物相容性,多羥基長鏈結(jié)構(gòu),能夠?qū)崿F(xiàn)酶的柔性固定等特點,常被優(yōu)先考慮應(yīng)用到酶的交聯(lián)固定化過程中。

2.2 葡聚糖作為載體修飾劑

固定化酶的活性在一定程度上依賴于固定化載體材料的物理化學(xué)特性[27],酶的固定化對載體材料有很高的要求。理想的載體材料應(yīng)具備良好的機(jī)械強(qiáng)度、熱穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性、耐生物降解性及對酶的高度親和性、并能保持較高的酶活性等特點[28]。目前有很多研究嘗試從酶固定化載體入手,對載體材料進(jìn)行修飾以提高酶固定化的效率和穩(wěn)定性。Goncalves等[29]首先用葡聚糖修飾二氧化硅載體,而后將葡萄糖苷酶固定在二氧化硅載體上,固定化葡聚糖糖苷酶熱穩(wěn)定性明顯增強(qiáng)。劉瑤[30]用葡聚糖修飾過的磁性微球通過共價結(jié)合固定木瓜蛋白酶,研究表明木瓜蛋白酶固定在葡聚糖磁性微球上后,其活性中心沒有受到明顯影響,仍具有催化活性,而且對變性劑的抵抗能力大為提高。雖然目前關(guān)于葡聚糖在修飾酶固定化載體的報道相對較少,但這為研究者尋求強(qiáng)化酶催化性能手段提供了一種新的思路。

2.3 葡聚糖作為固定化添加劑

在固定化過程中酶的性能會受到很多因素的影響,如果處理不好,酶的活性、穩(wěn)定性、選擇性都會降低,可以在固定化過程中加入一些添加劑來保護(hù)酶活,使用的添加劑主要有牛血清蛋白、蛋白胨和葡聚糖等多糖類物質(zhì)等[31-32]。近些年來很多學(xué)者嘗試在酶固定化過程中添加一定濃度的糖醇類物質(zhì)對酶進(jìn)行保護(hù)以提高固定化酶的性能[33-34]。楊小民等[35]研究發(fā)現(xiàn)添加葡聚糖的纖維素酶的物理熱變性溫度可以提高到129.6 ℃,紅外譜圖和示差掃描量熱譜圖的結(jié)果表明,在高溫下葡聚糖能形成玻璃態(tài),能夠有效地保護(hù)酶,并且隨著溫度的提高,葡聚糖和酶分子之間能更好地接觸和混合,從而對酶的保護(hù)作用明顯增加。周海燕等[36]以月桂酸與植物甾醇為底物,將葡聚糖與脂肪酶共吸附于大孔樹脂中催化合成植物甾醇酯,考察其催化活性,固定化過程中加入質(zhì)量7.5%的葡聚糖共吸附固定,酯化率達(dá)到了96.2%,比簡單吸附的固定化酶反應(yīng)時間縮短4 h。在酶的固定化過程中添加葡聚糖等多糖類物質(zhì)作為保護(hù)劑,能夠提高固定化酶的催化活性和對高溫的耐受性,關(guān)于葡聚糖作為酶固定化過程中的保護(hù)性添加劑其保護(hù)性機(jī)理還沒有得到科學(xué)具體的闡述,但相關(guān)研究都表明其作為添加劑對酶催化性能的提高起到了積極地作用。

2.4 葡聚糖作為酶修飾劑

蛋白多糖復(fù)合物在工業(yè)應(yīng)用中具有重要意義[37-41]。用聚合物修飾酶蛋白可以顯著提高酶在溶液中的穩(wěn)定性,可為對冷凍敏感的酶蛋白提供低溫保護(hù)。在用多糖對酶進(jìn)行修飾時,形成額外的分子間和分子內(nèi)橋可以提高酶的穩(wěn)定性。其中利用葡聚糖對酶進(jìn)行修飾是一種正在引起廣泛關(guān)注和重視的方法[42],葡聚糖較好的水溶性和生物相容性,有助于維持酶制劑表面微量的水,保持固定化酶的穩(wěn)定性和催化活性[43]。

Yapaoz等[44]合成了不同摩爾比的脲酶-醛基葡聚糖復(fù)合物,比較了該復(fù)合物與游離酶在pH、溫度、熱穩(wěn)定性和貯存穩(wěn)定性方面的差異,結(jié)果表明,在25、80 ℃時,酶活力分別比游離酶高1.4倍和2.5倍,復(fù)合物在有機(jī)溶劑介質(zhì)中具有較高的催化活性,同時發(fā)現(xiàn)葡聚糖顯著提高了脲酶的熱穩(wěn)定性和貯存穩(wěn)定性。李蘇等[45]將醛基葡聚糖連接到漆酶分子上,研究了漆酶在酸性溶液環(huán)境中的穩(wěn)定性是否提高,結(jié)果表明通過葡聚糖修飾使得漆酶在pH3、50 ℃下的酶活半衰期從0.07 h提高到17.1 h,在含30%(體積)乙腈、pH3下的酶活半衰期從0.11 h提高到10.3 h。葡聚糖含有大量的羥基,具有較強(qiáng)的結(jié)合水的能力,醛基化后的葡聚糖作為修飾劑可與酶表面的氨基基團(tuán)發(fā)生特異性反應(yīng),能夠很好地改善酶的穩(wěn)定性和催化活性。因此利用葡聚糖修飾酶成為目前提高酶催化性能和穩(wěn)定性的一種有效的手段[46]。

3 葡聚糖在酶催化過程中的應(yīng)用

3.1 葡聚糖在有機(jī)溶劑酶催化體系中的應(yīng)用

有機(jī)溶劑酶催化體系所用的有機(jī)溶劑并不是絕對無水的,維持酶空間結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的少量水是必須的[47]。在非水相酶催化反應(yīng)體系中,當(dāng)所用有機(jī)溶劑極性過強(qiáng)時,有機(jī)溶劑會剝奪酶分子表面微環(huán)境中的必需水從而使酶失活[48]。有學(xué)者研究表明[49],在有機(jī)相中加入某些添加劑如聚乙二醇、多元醇等多羥基化合物均可起到穩(wěn)定酶活性的作用。糖類化合物含有大量的羥基,故在反應(yīng)體系中加入一些糖類化合物可以很好地維持酶的表面水化作用,改善酶催化的微環(huán)境,有力促進(jìn)酶催化能力的提升。Kajiwara等[50]利用葡聚糖對圓柱形念珠菌脂肪酶進(jìn)行改性,將賴氨酸殘基與羰基偶聯(lián),通過改變脂肪酶周圍的微環(huán)境使酶在有機(jī)溶劑中親水性增強(qiáng);在pH8.0條件下,用葡聚糖改性的脂肪酶在25%(V/V)二甲基亞砜、乙醇、2-丙醇、甲苯和異辛烷中均表現(xiàn)出較高的穩(wěn)定性。Cabrera等[51]通過離子交換將硫酸葡聚糖覆蓋在脂肪酶CALB分子的表面,或用琥珀酸酐、1-乙基-3-碳二亞胺對酶進(jìn)行琥珀酰化或氨化,酶在有機(jī)溶劑中對扁桃酸甲酯的選擇性加,產(chǎn)物ee值(對映體過量百分?jǐn)?shù))從83%上升到了90%。葡聚糖在酶催化的有機(jī)溶劑反應(yīng)體系中具有重要的作用,具有多羥基結(jié)構(gòu)的葡聚糖能夠維持酶蛋白表面微環(huán)境中的必需水,從而保證了酶在有機(jī)溶劑反應(yīng)體系中活性的穩(wěn)定。

3.2 葡聚糖在無溶劑酶催化體系中的應(yīng)用

隨著對酶催化反應(yīng)體系研究的深入和不同學(xué)科之間的交叉,各種新的酶促反應(yīng)體系也相繼被應(yīng)用于生產(chǎn)當(dāng)中,其中無溶劑酶促反應(yīng)體系是一類重要的非水相體系中酶促反應(yīng)體系。

無溶劑酶催化反應(yīng)體系以低熔點底物為反應(yīng)溶劑,克服了有機(jī)溶劑毒性大、易揮發(fā)、產(chǎn)物不易分離等缺點,既降低了生產(chǎn)成本,又減少了對環(huán)境的污染,是酶催化領(lǐng)域中具有良好發(fā)展?jié)摿Φ木G色環(huán)保工藝[52]。Bi等[53]以大孔樹脂為載體,在無溶劑體系中固定化假絲酵母菌脂肪酶(CRL),采用葡聚糖在載體上柔性固定CRL,通過油酸與脂肪醇的酶酯化反應(yīng)合成了油酸油酯,發(fā)現(xiàn)20000 Da葡聚糖固定化脂肪酶的效果最好,最佳反應(yīng)條件下,酯的收率達(dá)到92.6%。無溶劑體系的低成本、低污染等特點使其成為工業(yè)生產(chǎn)中一種重要的綠色生產(chǎn)工藝,因而探求高催化效率的無溶劑酶催化體系具有重要的現(xiàn)實意義。目前的報道成功的說明了葡聚糖在無溶劑酶催化體系中的應(yīng)用得到了認(rèn)可。未來隨著研究的深入,其應(yīng)用會更加的廣泛。

4 總結(jié)與展望

本文綜述了葡聚糖在酶固定化和催化反應(yīng)過程中的應(yīng)用。在酶的固定化過程中,葡聚糖因其含有大量的羥基、較強(qiáng)的水合能力以及良好的生物相容性,可作為酶交聯(lián)劑、酶及載體修飾劑用于酶的固定化過程之中,多項研究表明顯著了提高了固定化酶的活性和催化穩(wěn)定性。同時由于多羥基化合物對酶空間結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定具有保護(hù)作用,故將葡聚糖作為保護(hù)性添加劑加入到酶的催化反應(yīng)體系中,尤其是在有機(jī)溶劑反應(yīng)體系中,葡聚糖能夠減弱有機(jī)溶劑對酶分子表面微環(huán)境必需水的剝奪,有效維持了酶空間結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定、提高了酶的催化性能;在無溶劑酶催化體系中,葡聚糖的添加也明顯促進(jìn)了酶催化效率的提高,為無溶劑酶催化這一環(huán)境友好反應(yīng)體系的進(jìn)一步推廣應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

雖然近年來葡聚糖在多個酶催化反應(yīng)實例中得到了成功的應(yīng)用,但葡聚糖在酶催化性能強(qiáng)化中的作用機(jī)理研究仍然存在諸多不足:如葡聚糖的加入如何影響酶的空間結(jié)構(gòu)變化;葡聚糖如何影響酶表面微量水的濃度;不同分子量的葡聚糖對酶結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定作用是否有差異;葡聚糖結(jié)構(gòu)中羥基的醛基化率如何影響酶交聯(lián)的效果等,都值得進(jìn)行深入的研究。隨著相關(guān)研究的不斷深入,葡聚糖對酶催化性能強(qiáng)化的機(jī)理將會得到進(jìn)一步的解析,葡聚糖在酶催化中的應(yīng)用也將不斷增加,為豐富多羥基化合物對酶催化穩(wěn)定性作用機(jī)制的認(rèn)識作出貢獻(xiàn)。