楊思靜,劉小芳,劉建志,冷凱良,2,邵緒卿

(1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部極地漁業(yè)開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東青島 266071;2.青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室,海洋藥物與生物制品功能實(shí)驗(yàn)室,山東青島 266200;3.中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,山東青島 266003;4.山東信諾檢測(cè)技術(shù)有限公司,山東青島 266101)

鯊魚屬于脊索動(dòng)物門、軟骨魚綱,共分成8目22科465種,其中,真鯊科種類最多,角鯊科次之,主要分布于熱帶、亞熱帶海域,分布于我國(guó)黃海、東海、南海等海域[1]。針對(duì)鯊魚捕撈業(yè),聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織(FAO)1999年簽署了IPOA-Shark指導(dǎo)方針,鯊魚捕撈業(yè)應(yīng)以可持續(xù)發(fā)展為基礎(chǔ)來進(jìn)行管理,以便可以提供持續(xù)的鯊魚相關(guān)食品、就業(yè)和收入來源[2];區(qū)域漁業(yè)管理組織(RFMO)中,大西洋金槍魚國(guó)際養(yǎng)護(hù)委員會(huì)(ICCAT)和海洋勘探國(guó)際委員會(huì)(ICES)已經(jīng)成功開發(fā)鯊魚數(shù)據(jù)庫并且應(yīng)用于鯊魚捕撈業(yè)中[3]。目前鯊魚的加工利用集中于魚鰭、魚肉和魚皮加工,頭部和肝臟等部位常被作為加工副產(chǎn)物而丟棄,造成資源浪費(fèi)和環(huán)境污染[4]。提高鯊魚肝臟等加工副產(chǎn)物的利用率,是目前行業(yè)關(guān)注與亟待解決的關(guān)鍵問題。

鯊魚肝臟中含有豐富的脂類物質(zhì),具有較好的開發(fā)利用價(jià)值,是提升鯊魚資源利用度和加工產(chǎn)業(yè)產(chǎn)品附加值的重要突破點(diǎn)。鯊魚肝臟中,n-3系列多不飽和脂肪酸,特別是EPA和DHA含量豐富,二者在降低膽固醇含量和促進(jìn)腦神經(jīng)發(fā)育中發(fā)揮重要作用[5]。鯊魚肝中還含有豐富的角鯊烯和烷氧基甘油。角鯊烯不僅可以作為保濕劑應(yīng)用于醫(yī)藥、化妝品行業(yè),還具有防止氧化降解、提高機(jī)體自身免疫、降低心血管疾病等作用[6];烷氧基甘油可用于糖尿病、哮喘、抗炎、提高免疫力、抗腫瘤等醫(yī)用領(lǐng)域[7]。然而,受自身生活習(xí)性、儲(chǔ)能方式等的影響,不同品種鯊魚肝臟脂質(zhì)組成和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值存在較大差異[8],但目前鮮有文獻(xiàn)對(duì)此進(jìn)行系統(tǒng)研究報(bào)道,僅少數(shù)研究關(guān)注了個(gè)別品種鯊魚肝脂肪酸組成或角鯊烯含量[9-11]。因此,應(yīng)對(duì)不同品種鯊魚肝的脂質(zhì)組成與差異對(duì)比繼續(xù)研究和闡釋。

本研究對(duì)深海長(zhǎng)尾鯊(Alopiassuperciliosus)、大青鯊(Prionaceglauca)、路氏雙髻鯊(Sphyrnalewini)、鐮狀真鯊(Carcharhinusfalciformis)的魚肝脂質(zhì)進(jìn)行了系統(tǒng)的檢測(cè),對(duì)比分析了不同品種鯊魚肝在脂質(zhì)組成、脂肪酸組成、角鯊烯含量以及烷氧基甘油含量等方面的差異,旨在為鯊魚肝脂質(zhì)資源的高效精準(zhǔn)利用提供科學(xué)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鯊魚肝 深海長(zhǎng)尾鯊(A.superciliosus)、大青鯊(P.glauca)、路氏雙髻鯊(S.lewini)、鐮狀真鯊(C.falciformis)四種鯊魚魚肝,由福建宏東漁業(yè)股份有限公司提供,真空包裝低溫運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室,于-20 ℃冰箱貯存?zhèn)溆?。四種鯊魚的捕撈位點(diǎn)和魚體基礎(chǔ)數(shù)據(jù)見表1;37種脂肪酸甲酯(純度≥95%)、膽固醇(純度≥99%)、角鯊烯(純度≥98%)、十八烷氧基甘油(純度≥98%)等標(biāo)準(zhǔn)品 美國(guó)Sigma公司;甘油三酯試劑盒、膽固醇試劑盒 北京中生北控生物科技有限公司;氯仿、甲醇、正己烷、正庚烷、無水乙醇、乙酸酐等分析純?cè)噭?上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

表1 四種鯊魚的捕撈位點(diǎn)和魚體基礎(chǔ)數(shù)據(jù)(n=3)Table 1 Fishing sites and basic body datas of the four kinds of sharks(n=3)

SP-752紫外分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司;G1530A氣相色譜儀、SP-2560(100 m×0.25 mm×0.20 μm)毛細(xì)管柱、INNOWax毛細(xì)管柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm)、DB-5(30 m×0.25 mm×0.25 μm)毛細(xì)管柱 美國(guó)Agilent公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 營(yíng)養(yǎng)成分含量的測(cè)定 蛋白質(zhì)含量測(cè)定按照CB 5009.5-2016分光光度法規(guī)定執(zhí)行;水分含量測(cè)定按照GB 5009.3-2010直接干燥法規(guī)定執(zhí)行;總脂含量測(cè)定按照GB 5009.6-2016 索氏抽提法規(guī)定執(zhí)行;灰分含量測(cè)定按照GB 5009.4-2010高溫灼燒法規(guī)定執(zhí)行。

1.2.2 脂質(zhì)組成的測(cè)定

1.2.2.1 魚肝總脂質(zhì)的提取 采用Folch法[12]提取鯊魚肝臟總脂質(zhì)。樣品勻漿后取適量采用氯仿-甲醇溶液(2/1,V/V)室溫振蕩提取4 h,過濾收集提取液,加入一定體積0.88%氯化鈉溶液,充分混勻后靜置過夜分層,收集下層氯仿層,旋蒸脫溶后采用氯仿-甲醇溶液(2/1,V/V)復(fù)溶,即得鯊魚肝臟總脂提取液。

1.2.2.2 甘油酯含量的測(cè)定 適量總脂提取液氮?dú)獯蹈?以50 μL異丙醇/Triton X-100溶液(9∶1;V/m)復(fù)溶,以50 μL異丙醇做空白對(duì)照,按試劑盒說明測(cè)定總脂中甘油酯含量。

1.2.2.3 磷脂含量的測(cè)定 按照GB/T 5537-2008鉬藍(lán)比色法規(guī)定執(zhí)行。

1.2.2.4 游離脂肪酸含量的測(cè)定 適量總脂提取液氮?dú)獯蹈?用3 mL正庚烷溶解,振蕩1 min后加入1 mL脂肪酸顯色劑(5%醋酸銅溶液,用吡啶調(diào)pH至6.1),振蕩2 min,靜置10 min后取上層有機(jī)相于715 nm處測(cè)OD值,以油酸為對(duì)照品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(Y=0.1178X+0.0019,R2=0.9985),計(jì)算總脂中游離脂肪酸的含量。

1.2.2.5 膽固醇含量的測(cè)定 參照文獻(xiàn)[13]方法,采用Agilent SP-2560氣相色譜柱進(jìn)行測(cè)定;以氮?dú)鉃檩d氣,進(jìn)樣溫度和檢測(cè)器溫度分別為280和290 ℃;升溫程序:起始溫度200 ℃,以30 ℃/min上升至290 ℃,保持9 min。外標(biāo)法定量。

1.2.3 脂肪酸組成的測(cè)定 樣品前處理:參照文獻(xiàn)[14]方法,取適量總脂提取液氮?dú)獯蹈?加入10%硫酸甲醇溶液,充入氮?dú)?密封,于90 ℃甲酯化反應(yīng)30 min,冷卻至室溫,以正己烷振蕩提取,靜置分層,進(jìn)氣相色譜分析。

氣相色譜條件:采用Agilent INNOWax毛細(xì)管柱分析測(cè)定;進(jìn)樣口溫度240 ℃,分流比20∶1,進(jìn)樣量1 μL;載氣為高純氮?dú)?流速1 mL/min;FID檢測(cè)器溫度250 ℃,氫氣流速40 mL/min,空氣流速450 mL/min,尾吹氣(氮?dú)?流速40 mL/min;升溫程序:起始溫度170 ℃,以3 ℃/min升溫至210 ℃,保持30 min,單個(gè)樣品分析過程為43.3 min。各脂肪酸含量采用面積歸一化定量。

1.2.4 角鯊烯的測(cè)定 樣品前處理:參照文獻(xiàn)[15]方法,取適量總脂提取液經(jīng)KOH-甲醇溶液皂化后,用正己烷/氯仿=4/1(V/V)萃取三次,合并上層萃取液定容后,進(jìn)氣相色譜分析。

氣相色譜檢測(cè)條件:采用Agilent DB-5毛細(xì)管柱進(jìn)行測(cè)定;以氮?dú)鉃檩d氣,流速30 mL/min,氫氣流速為40 mL/min,空氣流速為450 mL/min;進(jìn)樣口溫度250 ℃,分流比10∶1;升溫程序:起始溫度為160 ℃,以15 ℃/min升溫至220 ℃,保持2 min后,以5 ℃/min升溫至300 ℃,保持22 min。

1.2.5 烷氧基甘油的測(cè)定 樣品前處理:參照文獻(xiàn)[16]方法,取適量總脂提取液經(jīng)KOH乙醇溶液皂化后用正己烷提取,離心后收集上清液,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至干,加入乙酸酐進(jìn)行回流酯化,用正己烷定容后進(jìn)氣相色譜分析。

氣相色譜檢測(cè)條件:采用Agilent DB-5毛細(xì)管柱進(jìn)行測(cè)定;以氮?dú)鉃檩d氣,流速30 mL/min,氫氣流速為40 mL/min,空氣流速為450 mL/min;進(jìn)樣口溫度300 ℃,分流比10∶1;升溫程序:起始溫度為200 ℃,保持1 min后,以20 ℃/min上升至280 ℃,保持10 min。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”表示,每項(xiàng)指標(biāo)平行測(cè)定3次。采用SPSS 20.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,以P<0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 鯊魚肝基本營(yíng)養(yǎng)成分組成分析

四種鯊魚肝的基本營(yíng)養(yǎng)組成見表2。由表可知,四種鯊魚肝的水分含量范圍在29.11%±1.27%～70.23%±1.31%,蛋白質(zhì)含量范圍在9.05%±0.66%～21.33%±0.81%,脂肪含量范圍在7.20%±0.33%～60.42%±1.89%,灰分含量范圍在0.13%±0.02%～1.68%±0.12%。不同品種鯊魚魚肝的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和灰分含量差異顯著(P<0.05)。其中,深海長(zhǎng)尾鯊魚肝的蛋白質(zhì)含量最高,為21.33%±0.81%,其脂肪含量最低;路氏雙髻鯊魚肝的脂肪含量最高,為60.42%±1.89%,蛋白質(zhì)含量最低。本研究中的四種鯊魚肝脂質(zhì)含量低于突尼斯海域的玲瓏星鯊(Mustelusmustelus,64.25%±0.37%)和白斑角鯊(Squalusacanthias,65.98%±0.49%)[17]。不同鯊魚棲息環(huán)境與生活習(xí)性不同,蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝轉(zhuǎn)化模式存在差異[18],推測(cè)這是導(dǎo)致不同品種鯊魚魚肝基本營(yíng)養(yǎng)組成呈現(xiàn)顯著性差異的主要原因。

表2 四種鯊魚肝蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和灰分和水分含量(n=3)Table 2 Protein,lipid,ash and moisture contents of the four kinds of shark livers(n=3)

表4 四種鯊魚肝總脂脂肪酸組成(n=3,%)Table 4 Fatty acid compositions of the lipid from the four kinds of shark livers(n=3,%)

續(xù)表

2.2 鯊魚肝脂質(zhì)組成分析

四種鯊魚肝脂質(zhì)組成見表3。由表可知,鯊魚肝脂質(zhì)主要由甘油酯、磷脂、游離脂肪酸組成,含量排序?yàn)?甘油酯>磷脂>游離脂肪酸>膽固醇。相較于南方烏鯊(Etmopterusgranulosus)[19]以及海參、凡納濱對(duì)蝦等其他水產(chǎn)動(dòng)物[20],鯊魚肝中甘油酯含量略高,推測(cè)與本研究中采用的檢測(cè)方法有關(guān),鯊魚肝中存在的二?；视兔岩矔?huì)在脂肪酶的作用下部分水解并參與后續(xù)顯色反應(yīng),進(jìn)而對(duì)甘油酯的準(zhǔn)確定量產(chǎn)生一定影響。

表3 四種鯊魚肝脂質(zhì)組成(n=3)Table 3 The lipid compositions of the four kinds of shark livers(n=3)

路氏雙髻鯊魚肝磷脂含量最高,占總脂的21.20%±0.18%,其次是大青鯊,占總脂的18.23%±0.24%。四種鯊魚肝中,深海長(zhǎng)尾鯊和路氏雙髻鯊的磷脂含量具有顯著性差異(P<0.05)。與其他地域和種屬的鯊魚相比,本研究涉及的四種鯊魚肝磷脂含量大于南方烏鯊(0.7%)[19]、加勒比水域絲鯊(未檢測(cè)到)、加尼福尼亞水域的鼬鯊(5.1%)以及斯里蘭卡西海岸五種鯊魚肝油磷脂含量(0.4%～2.7%)[21];與其他海產(chǎn)品相比,這四種鯊魚肝磷脂含量高于牡蠣的14.51%[22],低于海星的73.70%～86.69%[23]以及太平洋真鱈魚卵的58.7%[24];與陸基食品原料的磷脂含量相比,這四種鯊魚肝磷脂含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于雞蛋的3.36%～4.40%和大豆的6.67%[25]。已有研究指出,海洋磷脂在調(diào)節(jié)機(jī)體脂代謝、糖代謝方面具有優(yōu)于陸基磷脂的生理活性[26-27],因此,磷脂資源的開發(fā)利用將是鯊魚肝資源高值化利用的重要方向。

四種鯊魚肝油中膽固醇含量在0.73%±0.12%～4.72%±0.45%之間,與已報(bào)道的斯里蘭卡西海岸五種鯊魚肝油中膽固醇含量(2.9%～12.7%)[21]基本一致,低于鰹魚肝油[28]和鮟鱇魚肝油[29]。在人體中,膽固醇主要來自于自身的合成,只有少量需要從食物中補(bǔ)充,即可滿足身體需要。過高的膽固醇會(huì)增加罹患心腦血管疾病以及腎臟疾病的風(fēng)險(xiǎn)。在開發(fā)鯊魚肝脂質(zhì)資源時(shí),應(yīng)注意采取必要的工藝控制終端產(chǎn)品中膽固醇的含量,可以考慮在加工工藝中采用超臨界萃取法、β-環(huán)狀糊精包合法進(jìn)行脫除[30]。

2.3 鯊魚肝脂肪酸組成分析

四種鯊魚肝總脂脂肪酸組成見表4。由表4可知,四種鯊魚肝總脂共檢測(cè)出30種脂肪酸。對(duì)于飽和脂肪酸,四種鯊魚肝油中主要以C16∶0、C18∶0為主;鐮狀真鯊魚肝總脂的飽和脂肪酸含量最高,為45.03%。對(duì)于單不飽和脂肪酸,四種鯊魚肝油主要以C16∶1、C18∶1n9c為主;路氏雙髻鯊魚肝總脂的單不飽和脂肪酸含量最高,為39.0%。對(duì)于多不飽和脂肪酸,四種鯊魚肝油主要以C20∶4n6、C20∶5n3(EPA)和C22∶6n3(DHA)為主;深海長(zhǎng)尾鯊魚肝總脂的多不飽和脂肪酸含量最高,為46.78%。四種鯊魚肝總脂多不飽和脂肪酸含量范圍為27.29%～46.78%。與其他種屬的鯊魚肝油相比,本研究中涉及的四種鯊魚肝油的多不飽和脂肪酸含量均高于太平洋睡鯊(Somniosuspacificus)肝油中的13.3%、喙吻田氏鯊(Deaniacalcea)肝油中的7.2%[19]。本研究中涉及的四種鯊魚肝總脂中n-3系列多不飽和脂肪酸,特別是EPA+DHA含量豐富,與其他種屬的鯊魚相比,EPA+DHA含量均遠(yuǎn)高于太平洋睡鯊肝油的7.7%和葡萄牙角鯊(Centroscymnusplunkeit)肝油的1.2%[19]。這四種鯊魚肝油中,深海長(zhǎng)尾鯊魚肝總脂脂肪酸中EPA+DHA含量最高,為37.27%,EPA和DHA含量分別為4.40%±0.30%和32.87%±0.73%,其次為大青鯊,EPA+DHA總量為33.64%,EPA和DHA含量分別為6.75%±0.59%和26.89%±0.81%,均高于鰩魚肝油的2.51%和20.9%以及鮟鱇魚肝油的3.95%和12.5%[29]。深海長(zhǎng)尾鯊、大青鯊和鐮狀真鯊的EPA+DHA總量均高于已有報(bào)道的玲瓏星鯊(Mustelusmustelus)(26.90%)和白斑角鯊(Squalusacanthias)(19.54%)[17]。另外,不同品種鯊魚魚肝總脂中n-3 PUFA/n-6 PUFA比值存在差異,比值范圍為5.16～13.48,推測(cè)可作為鯊魚肝原料來源鑒別的有效指標(biāo)。

2.4 鯊魚肝角鯊烯與烷氧基甘油含量分析

四種鯊魚肝油角鯊烯和烷氧基甘油含量分析結(jié)果見表5。四種鯊魚肝油中角鯊烯含量差異顯著(P<0.05),范圍為(59.52±1.96)～(330.51±4.96) mg/kg,其中路氏雙髻鯊含量最高。已有報(bào)道指出,白斑角鯊(S.acanthias)和高鰭白眼鮫(Carcharhinusplumbeus)肝油中幾乎沒有檢測(cè)到角鯊烯,光尾鯊(pristurus)肝油的角鯊烯含量小于1%,而黑鮫(Dalatiaslicha)肝油中角鯊烯含量則高達(dá)79%[31]。不同種類鯊魚肝油中角鯊烯含量差異較大,推測(cè)與不同種類鯊魚的棲息海域以及食物鏈密切相關(guān)。

表5 四種鯊魚肝角鯊烯與烷氧基甘油含量(n=3)Table 5 Squalene and alkoxyglycerol contents ofthe lipid from the four kinds of shark livers(n=3)

四種鯊魚肝油中烷氧基甘油含量差異顯著(P<0.05),范圍為(91.13±4.15)～(207.47±6.50) mg/g,其中路氏雙髻鯊含量最高。唐小紅[32]測(cè)得印度深海鯊魚肝油中烷氧基甘油平均值為(105.41±3.44) mg/g;王林祥等[33]測(cè)得澳洲塔斯瑪尼亞灣深海鯊魚油中總烷氧基甘油含量為274.9 mg/g。鯊魚肝油中烷氧基甘油主要包括十六烷氧基甘油、十六一烯烷氧基甘油、十八烷氧基甘油、十八一烯烷氧基甘油等形式,因不同結(jié)構(gòu)烷氧基甘油存在功能差異,后續(xù)研究可關(guān)注解析不同品種鯊魚肝油中烷氧基甘油的精細(xì)組成,為該部分資源的精準(zhǔn)利用提供指導(dǎo)。

3 結(jié)論

本研究對(duì)深海長(zhǎng)尾鯊、大青鯊、路氏雙髻鯊、鐮狀真鯊等四種鯊魚肝的脂質(zhì)組成進(jìn)行了系統(tǒng)分析對(duì)比,結(jié)果顯示,鯊魚肝富含磷脂、n-3系列多不飽和脂肪酸、角鯊烯與烷氧基甘油,營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富,具有極高的開發(fā)利用價(jià)值。不同品種鯊魚肝營(yíng)養(yǎng)組成,特別是脂質(zhì)組成各具特征:其中,深海長(zhǎng)尾鯊魚肝中蛋白質(zhì)含量豐富,為21.33%±0.81%;路氏雙髻鯊魚肝中脂質(zhì)含量豐富(60.42%±1.89%),其磷脂(21.20%±0.18%)、角鯊烯(330.51±4.96 mg/kg)、烷氧基甘油(207.47±6.50 mg/g)含量均為四種鯊魚中最高;深海長(zhǎng)尾鯊和大青鯊魚肝油中以EPA、DHA為主的多不飽和脂肪酸含量豐富,分別達(dá)到總脂脂肪酸的37.27%和33.64%。鯊魚肝的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值取決于各營(yíng)養(yǎng)成分的含量、組成以及各營(yíng)養(yǎng)成分間的交互作用,對(duì)鯊魚魚肝資源進(jìn)行開發(fā)時(shí)應(yīng)結(jié)合魚肝自身特征進(jìn)行定向利用。