曾 凱綜述，許利劍審校

0 引 言

消化道腫瘤是一種常見的惡性腫瘤。隨著中國居民預期壽命的延長以及生活環(huán)境、生活方式和飲食習慣的變化，消化道腫瘤的發(fā)病率逐年上升。胃癌發(fā)病率占我國腫瘤發(fā)病率的第2 位，結直腸癌為第3 位；胰腺癌則是癌中之王，一旦發(fā)現(xiàn)，患者往往已經進入晚期，愈后極差［1］。因此，進行有效篩查和早期診斷治療是目前臨床關注的熱點，尋找消化系統(tǒng)疾病特異性生物學檢測指標已成為當務之急。目前，由于具有易于檢測、穩(wěn)定性好等優(yōu)勢，外泌體源性miRNA 被視為具有潛力的生物學檢測指標［2］。本文外泌體源性miRNA 在消化道腫瘤中的進展作一綜述。

1 外泌體源性miRNA的概念和生物學特性

1.1 外泌體的定義細胞通過微泡結構選擇性地包裹蛋白質、RNA 等物質，并將其釋放到細胞外的環(huán)境中［3］，包裹了RNA 和蛋白質的小微泡（30～150nm）即稱為外泌體［4］。在正常生理及病理狀態(tài)下，多種細胞均可向外分泌外泌體，通過多囊泡體外膜與細胞膜融合后釋放到胞外基質中［5］。其內部成分與其分泌細胞的來源和機體的病理生理狀態(tài)有關。

1.2 miRNA 的定義微小RNA（miRNA）是在真核生物體內發(fā)現(xiàn)的短序、內源啟動的非編碼RNA，由大約21-25 個核苷酸組成。長初級轉錄物被一系列核酸酶切割形成成熟miRNA，從而在基因表達和mRNA 翻譯轉錄的控制中起特定作用［5］。miRNA 的調節(jié)網絡很復雜，單個miRNA 可調控多個基因表達，多個miRNA 的組合也可調控單個基因表達。miRNA 能夠將mRNA 鏈切割成兩條，阻斷核糖體將mRNA 翻譯成蛋白質［6-7］，目前確定作用包括參與細胞生長和組織分化的調節(jié)［8］，而這兩個過程的失調會直接導致癌癥的形成和發(fā)展［9］。大量研究表明人體miRNA 表達譜的特定變化與特定的腫瘤表型相關，并且大多數(shù)定位于基因組上與腫瘤相關的脆性位點，發(fā)揮類似腫瘤抑制基因和癌基因的作用［10］。

1.3 外泌體源性miRNA 的定義外泌體含有多種短鏈和長鏈RNA，其長度、類型和含量隨細胞狀態(tài)的變化而變化。目前，在外泌體中發(fā)現(xiàn)了4934 種miRNA，這些外泌體中包含的miRNA 被稱為外泌體源性miRNA。外泌體源性miRNA 作為臨床檢測指標有著極大的應用價值。首先，miRNA 的化學性質較蛋白質來說更為穩(wěn)定，且血清中的miRNA 可逃脫核糖核酸酶的消化［11］。此外，由于外泌體源性miR?NA 對比其他來源的miRNA 具有明顯優(yōu)勢，檢測外泌體源性的miRNA較直接檢測miRNA更適合。

1.4 外泌體源性miRNA 的生物學特性外泌體源性miRNA 對比其他來源的miRNA 具有以下優(yōu)勢：①易于檢出，Emming 等［8］研究發(fā)現(xiàn)，血清和唾液中miRNA 的表達主要來自外泌體，即在天然體液（如尿液、腦脊液、乳汁等）中檢測到的miRNA 多為外泌體源性miRNA［12］；②不易降解，由于一些miRNA 在循環(huán)中與蛋白結合成復合物，部分復合物能夠存在于外泌體內容物中，使得miRNA 在循環(huán)中能夠保持活性和穩(wěn)定以防止被降解。豐富的miRNA 確實存在于循環(huán)中的外泌體內，且大都跟RNA 誘導沉默復合體蛋白結合形成復合物而存在。Yan 等［13］通過分析結直腸癌血清中miRNA 證實了被外泌體包裹的miRNA 在人體循環(huán)中具有更好的生物學穩(wěn)定性。③作為有效載體，細胞能通過釋放微泡將生物活性脂類、核酸、蛋白質等物質轉運至靶細胞，從而調節(jié)靶細胞的活動，發(fā)揮抗凋亡、促進增殖、抗菌、抗腫瘤、促血管生成、誘導細胞分化和調節(jié)免疫等作用［14］?？傊捎谄洫毺氐哪遗輼咏Y構，外泌體不僅可保護miRNA 免于降解，還可作為將其運輸至靶細胞的有效載體。

2 外泌體源性miRNA的檢測

2.1 外泌體的分離純化為測得血漿、尿液、唾液、糞便中的外泌體源性miRNA，首先要分離和富集樣本中的外泌體。外泌體分離技術種類較多，傳統(tǒng)的分離技術包括超速離心、超濾、沉淀以及基于免疫親和的外泌體分離提取方法，新興的分離技術包括納米粒子追蹤分析，電化學外泌體定量法，表面等離子體共振，微流控技術，光敏磁珠檢測［15-18］。目前最常用的是超速離心，該方法得到的外泌體量多、成本低，但是回收率低、純度不足。而超濾法回收率較高，但過膜易損耗變形。其余各方法由于價格昂貴，成本較高，效率較低等局限性，尚未大規(guī)模應用。因此，在診斷領域中應用外泌體來進行檢測需要解決的首要障礙是確立最優(yōu)的方式及建立標準去分離提純外泌體［18］。

2.2 外泌體源性miRNA 的檢測目前外泌體中的miRNA 檢測一般是基于核苷酸雜交和擴增原理。通過Northern blot、微陣列芯片、實時聚合酶鏈鎖反應（RT-PCR）、電化學檢測等檢測手段，將分離純化后的外泌體中的miRNA 的雜交信號轉化為可測量信號。RNA 核酸雜交技術由于樣品需要量大、耗時長、靈敏度低等缺點，目前使用較少［19］。微陣列芯片技術的優(yōu)點是高通量，但會受到miRNA 家族中與其類似的序列交叉雜而交造成靈敏度下降。實時聚合酶鏈鎖反應具有較高的靈敏度和實用性，但由于miRNA 自身的限制，對引物的設計要求很高且溫度難以控制，僅在實驗室使用較多。電化學生物傳感器相對于其他幾種方法來說，能耗低并且易于集成化，能夠高效、靈敏的應用于大批量的miRNA 檢測，且能較為迅速地獲得檢測結果。因此，基于電化學技術的miRNA 生物傳感器在實驗診斷領域有極大的應用前景。

3 外泌體源性miRNA 在常見消化道腫瘤中的研究

消化道腫瘤臨床確診的金標準是組織活檢。盡管組織活檢具有高精度和高可靠性，但侵入性和高成本使得對于肝、膽囊、胰腺的活檢很難進行，尤其是胰腺處于腹膜后位，侵入性活檢對患者造成創(chuàng)傷較大。糞便潛血試驗和結腸鏡檢查作為篩查方法可降低結直腸癌的死亡率［2，20］，但這些技術有靈敏度低、創(chuàng)傷性和不適感等局限性。CA19-9和癌胚抗原已被廣泛用作腫瘤標志物，不足之處是這些標志物的檢測對消化道腫瘤的敏感性和特異性還不夠高。因此，找到簡便易行可靠的消化道腫瘤的生物標志物顯得有意義。綜合研究發(fā)現(xiàn)，外泌體源性miRNA 與食管癌、胃癌、結直腸癌、肝癌、胰腺癌關聯(lián)較大，而與膽囊癌、小腸癌等關聯(lián)較小。

3.1 胃癌黃聲凱等［21］檢測了21 例胃癌、結直腸癌患者血清中外泌體源性miR-378 和miR-21 的表達，與健康對照組比較結果顯示，miR-378 在胃癌患者血清中表達下降而miR-21表達升高。研究發(fā)現(xiàn)，miR-21 可通過下調Serpini1 的表達縮短細胞周期，加速細胞增殖，后者在調控細胞增殖、防止細胞癌變的過程中發(fā)揮著重要作用［22］。已知程序性細胞死亡基因4（programmed cell death protein 4，PDCD4）能促使細胞凋亡，而miR-21 能夠通過下調PDCD4的表達，從而抑制細胞凋亡并間接促進胃黏膜上皮細胞的增殖［23］。除Serpini1 和PDCD4，人第10 號染色體缺失的磷酸酶、張力蛋白同源的基因和富含半胱氨酸反轉錄蛋白基因也是miR-21的直接靶基因，這些抑癌基因表達的下調促進了胃黏膜上皮細胞的癌變。miR-378 可通過負調控血管內皮生長因子和MAPK1 的表達起到抑癌基因的作用［24］，其下調的機制及其在致癌作用中的作用仍不清楚，但Deng等［25］的研究數(shù)據表明，miR-378 的表達受其上游啟動子中的DNA 甲基化調節(jié)，miR-378 可分別通過負調節(jié)CDK6 和VEGF 的表達而在胃癌中充當腫瘤抑制劑。綜上，通過ROC 曲線分析其診斷效能顯示，將血清外泌體源性miR-378 和miR-21 水平聯(lián)合應用作為胃癌診斷標志物有一定的診斷價值，靈敏度和特異度高達92.0%和87.0%，遠高于癌胚抗原和CA-199［26］。Molina-Castro 等［27］研究結果還顯示，胃癌患者血清miR-378的表達可作為選擇腫瘤治療方式（手術或是放化療）的重要參數(shù)。雖然miR-378和miR-21 在結直腸癌和胃癌患者血清中的表達無明顯差異，但是作為初步篩選胃和結直腸癌是非常理想的生物學指標。

3.2 食管癌miRNA-21 在食管癌細胞及其相應的外泌體中含量豐富。Liu 等［28］采用qRT-PCR 技術比較了食管癌患者和對照組血漿miR-93-5p 的表達情況，并通過建立細胞模型，研究miR-93-5p 對受體細胞生物學功能的影響。結果顯示，血漿miR-93-5p表達上調顯著增加食管癌的風險，并與預后不良相關。外泌體傳遞的miR-93-5p 促進受體食管癌細胞增殖，影響抑癌基因PTEN 及其下游蛋白p21 和cy?clin D1 的表達。此外，也有研究表明RNU6-1/miR-16-5p、miR-25-3p/miR-320a、let-7e-5p/miR-15b-5p、miR-30a-5p/miR-324-5p、miR-17-5p/miR-194-5p 等生物標記的改變也與食管癌的發(fā)生有著統(tǒng)計學相關性。但是，目前臨床上未有關于食管癌中特異性地表達外泌體源性miRNA的臨床研究。

3.3 結直腸癌大量的臨床研究均發(fā)現(xiàn)了結直腸癌中外泌體源性miRNA 的特異性表達。陶靈佳等［29］總 結 出miR-18a-5p、miR-21-5p、miR-29a-5p、miR-92a-5p、miR-143-5p 和miR-378-5p 在結直腸癌患者體內表達異常，認為可成為潛在的診斷標記物。另外有研究表明，8種miRNA（let-7a、miR-1224-5p、miR-1229、miR-1246、miR-150、miR-21、miR-223和miR-23a）在原發(fā)性結直腸癌患者的血清外泌體中顯著升高，并且在行腫瘤根治術后下調，使用定量實時PCR 在獨立樣品組中驗證了這些外泌體源性miRNA 在結直腸癌中升高。更有臨床意義的是，在早期（TNM I 期）結直腸癌樣品中miRNA 的差異性表達。Wang 等［30］表明在早期結腸癌患者血清外泌體源性miR-125a-3p 和miR-320c 明顯上調，可對于原發(fā)性結直腸癌的早期檢出有極大的幫助。

3.4 肝細胞癌外泌體源性miR-223 的表達下調與肝細胞癌相關，且具有特異性和高靈敏性。不管是血清還是活檢病理組織，均出現(xiàn)下調。這表明了miR-223 可作為肝細胞癌潛在的無創(chuàng)生物標志物。Rui 等［31］報告指出，miR-223 在肝細胞癌中過表達，增加了抗癌藥物在肝細胞癌細胞系中的敏感性。研究通過對在不同類型患者血清miR-223的表達及ROC 曲線分析，表明肝細胞癌患者miR-223 表達水平下調，同時進一步說明肝細胞癌患者細胞增殖調控紊亂［32］。另外值得注意的是，Xiao 等［33］的研究顯示在不同感染類型的肝細胞癌患者中，乙型肝炎、丙型肝炎和諾如病毒組患者的miR-30e 和miR-223均出現(xiàn)顯著下調，且下調幅度相似，表明血清miR-30e和miR-223不受肝細胞癌類型的限制，提示其可作為診斷的廣譜型生物標志物，具有重要的臨床診斷意義，因此后續(xù)可通過較大的隊列研究進一步探究其診斷價值。

3.5 胰腺癌外泌體源性let-7a在體外和體內實驗中均被證明能抑制胰腺癌細胞的細胞增殖、轉移和化學敏感性，是負責腫瘤化學敏感性的CXCR4的下游靶基因［33］。Furusato 等［34］研究首先檢測了各種胰腺腫瘤組織中l(wèi)et-7a 基因的表達水平，結果顯示與正常胰腺組織相比，let-7a 在腫瘤組織中減少，該研究觀察到let-7a與胰腺腫瘤組織中的CXCR4表達呈負相關，研究同時在兩個胰腺腫瘤細胞Bxpc-3 和Panc-1 中 檢 測 到let-7a 水 平，用100ng/mL SDF-1a（CXCR4 的同源配體）處理，let-7a 水平降低50%，表明CXCR4 有調節(jié)胰腺腫瘤細胞中l(wèi)et-7a 水平的能力。另一方面，用強效CXCR4 抑制劑AMD3100（200nM）處理的細胞后，let-7a mRNA 水平顯著增加，let-7a 在體外增加了胰腺癌對于化療藥（吉西他濱）的敏感性。這提供了對胰腺癌細胞的發(fā)病機制和耐藥性的更深入理解，并有助于開發(fā)更強大的治療方法用于治療胰腺癌。數(shù)據表明let-7a 在胰腺腫瘤細胞增殖，侵襲和轉移中起關鍵作用，該研究認為CXCR4可能通過let-7a在胰腺細胞癌的發(fā)病機制中發(fā)揮作用，因此，let-7a 不失為一個潛在的診斷胰腺癌的特異性生物學指標。

4 結語與展望

由于多數(shù)患消化道腫瘤的患者在晚期時才能得到確診，且總體預后較差，因此消化道腫瘤在所有癌癥類型中死亡率較高［1］。臨床實踐表明，特異性生物學檢測指標對于消化道腫瘤的早期診斷和治療非常重要。本文綜述了外泌體源性miRNA 與常見的消化道腫瘤的關系，并提出外泌體源性miR?NA 作為臨床檢測指標有著極大的應用價值。雖然近幾年外泌體源性miRNA 的研究越發(fā)火熱，但基本上都取材于細胞培養(yǎng)液中的外泌體miRNA 進行研究，直接在患者體液中提取外泌體miRNA 進行的較少。大部分外泌體及其信號通路研究目前都只處于早期階段，很多研究還僅限于細胞實驗，在動物實驗中需要進一步驗證。相信不久的將來會有更多特異性的生物學指標被發(fā)現(xiàn)，使得患者在不經過侵入性檢測的情況下做出消化道腫瘤的診斷，此外新的治療策略（如囊泡介導的基因治療）也是另一個富有前景的領域。