申識川 王文芳 張玉紅

1.河南省濮陽市檢驗檢疫服務(wù)中心，河南濮陽457000；2.河南省濮陽市河道管理處，河南濮陽457000；3.河南省濮陽市動物疫病預(yù)防控制中心，河南濮陽457000

兔病毒性出血癥俗稱“兔瘟”、兔出血熱，是家兔及野兔的一種烈性、高致死性傳染病，由兔出血癥病毒（rabbit hemorrhagic disease virus，RHDV）引起，主要臨床癥狀表現(xiàn)為呼吸系統(tǒng)出血、肝壞死及實質(zhì)臟器水腫、淤血及出血性病變，以接觸傳播為主要傳播方式。該病發(fā)病急、發(fā)病率和病死率較高，被我國獸醫(yī)衛(wèi)生行政部門列為必須檢疫的二類傳染病。

1 兔出血癥病毒概述

兔出血癥病毒在病毒學(xué)分類上屬嵌杯病毒科兔病毒屬成員，表面無囊膜，直徑約40 nm，核衣殼呈20 面體對稱，和其他病毒結(jié)構(gòu)一樣，由病毒基因組和180 個衣殼蛋白亞單位聚合而成[1]。病毒基因組為單股正鏈RNA，整個基因組包括7 437 個核苷酸堿基，基因組5’末端沒有帽子結(jié)構(gòu)，3’末端有一個短的多聚腺嘌呤尾，編碼2 個開放閱讀框ORF1和ORF2，分別編碼結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白。RHDV包括有血凝性和無血凝性2 種，目前在我國這2 種毒株均存在。

2 VP60 蛋白基因及結(jié)構(gòu)

VP60 蛋白基因?qū)儆诘? 個開放閱讀框的一部分，第1 個開放閱讀框位于病毒基因組5’的末端，從第10 個核苷酸堿基開始延伸至第7 041 個核苷酸堿基，編碼1 個多聚蛋白前體，其中VP60 基因全長包括1 740 個核苷酸堿基。

研究表明，RHDV 的VP60 蛋白由多聚蛋白前體經(jīng)蛋白酶裂解而成，包括579 個氨基酸，分子質(zhì)量為60 ku，故名VP60 蛋白[2]，其結(jié)構(gòu)主要分為3個區(qū)域，NTA（氨基端1～65aa）、S 區(qū)（66～229aa）和P區(qū)（238～579aa），第230～237aa 是S 區(qū)和P 區(qū)連接處存在的一段短的鉸鏈區(qū)。P 區(qū)主要由P1 亞區(qū)和P2亞區(qū)組成，P2 亞區(qū)位于RHDV 衣殼蛋白表面，含有病毒株特異性抗原表位和紅細(xì)胞結(jié)合位點[3]。

3 VP60 蛋白表達

VP60 蛋白是機體主要保護性抗原，為了進一步搞清楚VP60 蛋白的結(jié)構(gòu)和功能，目前國內(nèi)學(xué)者構(gòu)建了多個VP60 蛋白表達系統(tǒng)，主要包括原核表達系統(tǒng)和真核表達系統(tǒng)。

3.1 原核表達系統(tǒng)

原核表達系統(tǒng)應(yīng)用時間較長，技術(shù)成熟，表達量高、周期短，是早期研究VP60 蛋白的首選，也是應(yīng)用最廣的表達系統(tǒng)。

安凱等[4]克隆了RHDV GS/YZ 株的VP60 截短基因，構(gòu)建了原核表達質(zhì)粒pET-RHDV-VP60，轉(zhuǎn)化大腸桿菌后表達出了VP60 聚合蛋白。將表達產(chǎn)物純化后免疫Balb/C 小鼠制備多抗，然后應(yīng)用間接ELISA 和免疫印跡試驗對重組蛋白的免疫原性進行分析。結(jié)果表明GS/YZ 株VP60 截短基因在大腸桿菌中成功表達，表達產(chǎn)物分子質(zhì)量約50 ku，其多抗效價為1∶32 000；免疫印跡試驗證明表達產(chǎn)物具有很好的免疫原性；免疫重組蛋白后的易感兔在攻毒后全部存活，與傳統(tǒng)滅活疫苗具有同樣的保護效果，為研發(fā)亞單位疫苗提供了借鑒。

熊梅等[5]利用擴增RHDV 的VP60 全長基因，構(gòu)建了重組表達質(zhì)粒pGEX-VP60，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，成功表達重組蛋白，后續(xù)的免疫印跡試驗表明表達的病毒蛋白具有與VP60 單抗良好的反應(yīng)原性。利用純化后的VP60 蛋白與兔的肝臟細(xì)胞膜蛋白進行pull-down 實驗，分析出與RHDV VP60 蛋白相互作用的兔肝臟細(xì)胞膜蛋白為ATP 合成酶β亞基，說明ATP 合成酶β 亞基可能與RHDV 的感染有關(guān)。

李傳山等[6]應(yīng)用利用原核表達載體pET32a 構(gòu)建成功了RHDV 西北分離株VP60 蛋白的重組表達質(zhì)粒，誘導(dǎo)大腸桿菌BL21 表達后，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，VP60 蛋白成功表達，重組蛋白分子質(zhì)量約為75ku。隨后的免疫印跡試驗證明，原核表達的VP60 蛋白具有免疫原性。該研究進一步表明兔出血癥病毒在我國西北干旱半干旱的自然條件下其遺傳變異和免疫學(xué)特征沒有較大變化。

3.2 真核表達系統(tǒng)

張帥等[7]運用分子克隆技術(shù)，使用Hr1、Hr3、WPRE、SV40、CAG、Melt 等順式作用元件及元件組合對pFastBacDual 供體質(zhì)粒進行改造后轉(zhuǎn)染sf9 細(xì)胞，成功提高了兔出血癥病毒衣殼蛋白VP60 在Bacto-Bac 系統(tǒng)的表達量。經(jīng)免疫鑒定，表達的重組VP60 蛋白既能夠和VP60 單抗發(fā)生反應(yīng)，也能和RHDV 多抗血清發(fā)生反應(yīng)，具有良好的反應(yīng)原性。

原冬偉等[8]、張夏蘭[9]分別將RHDV TP 株、Yaan株的VP60 基因擴增，插入到真核表達載體pcDNA3.1(+)中，成功構(gòu)建真核表達質(zhì)粒pcDNA-VP60，轉(zhuǎn)染RK13 細(xì)胞和Vero 細(xì)胞后都表達出了VP60蛋白。隨后他們又用重組質(zhì)粒分別免疫了小鼠和1月齡試驗兔。動物試驗表明，重組質(zhì)粒能夠誘導(dǎo)動物機體產(chǎn)生保護性抗體。

陳柳等[10]利用桿狀病毒表達系統(tǒng)對RHDV VP60蛋白的表達和細(xì)胞定位進行了研究。研究結(jié)果表明，VP60 蛋白能在sf9 昆蟲細(xì)胞中正確表達，能自組裝形成病毒樣顆粒；表達的VP60 蛋白定位于sf9細(xì)胞的細(xì)胞膜上，VP60 蛋白可能有助于RHDV 感染并入侵宿主細(xì)胞。

4 VP60 變異研究

向華等[11]、田浪等[12]克隆出了國內(nèi)RHDV 不同分離株的VP60 基因，與GenBank 上的其他毒株進行了比較，他們的研究結(jié)果表明，VP60 基因序列全長都是1 740 bp，都是編碼579 個氨基酸，各毒株核苷酸序列同源性在90.0%到98.0%之間，氨基酸同源性在94.1%到99.0%之間，強毒株間的氨基酸同源性為95%～100%，氨基酸變異多發(fā)生于C、E區(qū)，且氨基酸變異沒有引起VP60 蛋白高級結(jié)構(gòu)的根本性變化。

陳銘等[13]應(yīng)用RT-PCR 方法克隆出了RHDV 榮昌分離株的VP60 主要抗原表位基因序列，測序后，與RHDV 其他16 株的主要抗原表位序列進行了比較分析，研究結(jié)果表明RHDV 榮昌分離株的主要抗原表位基因大小為506 bp，與其他16 株的核苷酸序列同源性較高，推導(dǎo)的氨基酸同源性可達80%。

5 展 望

VP60 蛋白是RHDV 的結(jié)構(gòu)蛋白，在感染宿主和誘導(dǎo)機體免疫應(yīng)答過程中起著重要的作用，是國內(nèi)外研究RHDV 的一個熱點和重要內(nèi)容，除了原核表達和真核表達之外，也有學(xué)者嘗試在馬鈴薯中表達該蛋白。隨著生命科學(xué)技術(shù)的發(fā)展和研究手段的更新，關(guān)于VP60 蛋白的結(jié)構(gòu)、在感染宿主中的作用和刺激機體產(chǎn)生保護性抗體的機理將會更清楚，也會促進學(xué)者研發(fā)出更有效的RHDV 疫苗和診斷試劑，更有助于RHDV 的防控和治療，降低養(yǎng)兔業(yè)的損失，保障我國養(yǎng)兔業(yè)健康發(fā)展。