胡 洋，潘韻錚，李慶菊，鄭仕中，卞 勇，時 樂，范方田，蔣寶平，許 立

(南京中醫(yī)藥大學(xué) 1.藥學(xué)院，江蘇 南京 210023， 2.翰林學(xué)院，江蘇 泰州 225300)

丹參是心血管疾病最常使用的中藥之一，丹酚酸B(Sal B)是其主要的水溶性成分[1]，具有廣泛的生理活性，其可通過抗炎[2]、抗氧化、鈣拮抗[3]、清除氧自由基等機(jī)制發(fā)揮心血管保護(hù)作用。心肌缺血作為心血管疾病的重要分型，在發(fā)生過程中往往伴隨著劇烈的炎癥反應(yīng)。許多文獻(xiàn)報道，抑制心肌缺血過程中的炎癥反應(yīng)能夠有效減輕心肌缺血損傷[4]。TLR4/NF-κB信號通路與炎癥反應(yīng)的發(fā)生密切相關(guān)，已有研究表明，抑制TLR4/NF-κB信號通路的激活可以減少多種促炎因子的分泌，緩解心肌缺血損傷[5-6]。IRAK1作為TLR4/NF-κB信號通路上的重要一環(huán)，抑制其磷酸化能夠有效阻斷TLR4/NF-κB信號通路的激活。

NLRP3炎癥小體是固有免疫的組成成分之一[7]，在許多炎癥性疾病的發(fā)生發(fā)展中扮演著中心角色。典型的NLRP3炎癥小體激活需要priming階段與激活階段的共同參與。priming階段刺激信號激活TLR4信號通路，然后促進(jìn)核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB激活，介導(dǎo)pro-IL-1β、pro-IL-18等炎癥因子前體的產(chǎn)生，激活階段刺激信號(如ROS、MSU、ATP等)可以促進(jìn)NLRP3/ASC/pro-caspase-1蛋白復(fù)合物的組裝，并活化caspase-1，之后活化的caspase-1將pro-IL-1β、pro-IL-18剪切活化為IL-1β和IL-18并釋放到胞外，介導(dǎo)一系列的炎癥反應(yīng)[8]。本文旨在探究丹酚酸B能否通過調(diào)控NLRP3炎癥小體激活的priming階段，抑制NLRP3激活，從而達(dá)到減輕缺氧誘導(dǎo)的大鼠H9C2細(xì)胞損傷的目的。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株與試劑大鼠H9C2細(xì)胞株購于南京凱基生物技術(shù)股份有限公司；丹酚酸B(純度≥98%)由南京虹橋醫(yī)藥技術(shù)研究所惠贈，批號：181218；胎牛血清購自BI公司，批號：1906287；CCK-8購自廣州賽國生物科技有限公司，批號：EZ2811A179；白介素1β(interleukin 1β，IL-1β)ELISA檢測試劑盒購自于杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司，批號：2301B41114；心肌肌鈣蛋白(cardiac troponin，cTn)ELISA檢測試劑盒購自于南京翼飛雪生物科技有限公司,批號：201903；乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)測定試劑盒購自于上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號：C0017；TLR4、Myd88、NF-κB、NLRP3、GAPDH引物合成于上海生工生物工程股份有限公司；TLR4(批號：00048459)、Myd88(批號：00056889)、IRAK1(批號：00022045)、NF-κB(批號：00057776)抗體購自于武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；NLRP3抗體(批號：AB214185)購自于艾博抗生物公司；羊抗兔二抗(批號：10249)、凝膠試劑盒(批號：NO.072319190723)、0.25%EDTA-胰酶購自于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號：2L8448)、SYBR熒光染料(批號：IL8353)購于鎮(zhèn)江愛必夢生物科技有限公司；不完全高糖/低糖培養(yǎng)基(批號：20190702)購自于江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；PBS緩沖液購于武漢博士德生物公司(批號：BC20190620)購自于江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；IRAK1抑制劑(批號：05370)購自于MedChemExpress公司，；厭氧產(chǎn)氣袋、缺氧盒以及氧氣指示劑購自于日本三菱公司。

1.2 儀器Synergy2多功能酶標(biāo)儀(美國Bioteck公司) ; Allegra 64R型超速冷凍離心機(jī)(美國Beckman公司) ; Bio-Rad電泳儀及凝膠成像儀(美國伯樂公司)；7500型定量PCR儀(美國ABI公司)，熒光倒置顯微鏡(德國ZEISS公司)。

1.3 方法

1.3.1大鼠H9C2心肌細(xì)胞培養(yǎng)以及藥物配制 將H9C2細(xì)胞正常培養(yǎng)在含有10%FBS的DMEM不完全培養(yǎng)基中，放置于普通培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)(37 ℃、5% CO2、95%空氣)，觀察細(xì)胞形態(tài)。將Sal B溶解在無菌PBS溶液中，配置成5 mmol·L-1母液，放置于-20 ℃冰箱待用，根據(jù)實驗需要，再將其用完全培養(yǎng)基稀釋至各濃度。使用完全培養(yǎng)基將IRAK1抑制劑依照說明稀釋為50 μmol·L-1備用。

1.3.2CCK8法測定不同濃度Sal B對H9C2細(xì)胞狀態(tài)的影響 H9C2細(xì)胞生長至大約80%左右消化，然后以104個/mL濃度種于96孔板中，待細(xì)胞貼壁后，吸棄培養(yǎng)液，PBS洗滌2遍，每孔加入不同濃度Sal B (1 、5、10 、15 、20、25、30、35 μmol·L-1)繼續(xù)培養(yǎng)48 h，然后每孔加入10 μL CCK8溶液孵育1 h，之后450 nm處測定OD值，實驗重復(fù)3次。

1.3.3實驗分組以及模型構(gòu)建 實驗分組為：對照組：正常生長的細(xì)胞；模型組：缺氧處理的細(xì)胞；實驗處理組：使用1、5、25 μmol·L-1Sal B預(yù)處理24 h后缺氧造模的細(xì)胞；IRAK1抑制劑組：使用IRAK1抑制劑預(yù)處理2 h后缺氧造模的細(xì)胞。缺氧模型構(gòu)建：待H9C2細(xì)胞匯合度達(dá)到約80%時消化，然后以4×105個/mL濃度于6孔板中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后加入不同濃度的Sal B培養(yǎng)24 h或IRAK1抑制劑培養(yǎng)2 h，之后改用不含血清的DMEM低糖培養(yǎng)基，置于安寧包所致缺氧體系中培養(yǎng)6 h，同時使用氧氣指示劑，實時監(jiān)測體系內(nèi)氧氣濃度。根據(jù)廠商說明，安寧包會快速吸收密閉容器中的O2，并維持約95% N2，5% CO2體系6 h[9-10]。

1.3.4CCK-8法檢測細(xì)胞活力 H9C2細(xì)胞生長至大約80%左右使用胰酶消化，然后將細(xì)胞以104個/mL密度接種于2塊96孔板中，隨機(jī)將2塊96孔板分為正常組和缺氧組。正常組細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)，缺氧組細(xì)胞分為缺氧模型組以及Sal B預(yù)處理組。缺氧組細(xì)胞使用不同濃度Sal B預(yù)處理24 h后缺氧造模6 h，之后加入CCK-8培養(yǎng)1 h，測450 nm處OD值，根據(jù)公式計算細(xì)胞活性，即：

H9C2細(xì)胞活性/%=(各實驗組OD值-空白孔OD值)/(對照組OD值-空白孔OD值)×100%，實驗重復(fù)3次。

1.3.5微孔板法檢測LDH 將稀釋后的細(xì)胞接種到6孔板中，設(shè)置模型組、對照組、Sal B預(yù)處理低、中、高劑量組，IRAK1抑制劑組，待細(xì)胞貼壁后Sal B預(yù)處理組換用不同濃度Sal B處理24 h；細(xì)胞貼壁后22 h抑制劑組換用IRAK1抑制劑培養(yǎng)2 h。在缺氧造模前將培養(yǎng)液更換為不加血清的DMEM低糖培養(yǎng)基，之后缺氧造模6 h，取各組上清，微孔板法測定LDH表達(dá)水平。

1.3.6ELISA檢測cTn和IL-1β 將稀釋后的細(xì)胞接種到6孔板中，設(shè)置模型組，對照組，Sal B預(yù)處理低，中，高劑量組，待細(xì)胞貼壁后Sal B預(yù)處理組換用不同濃度Sal B處理24 h；細(xì)胞貼壁后22 h抑制劑組換用IRAK1抑制劑培養(yǎng)2 h。在缺氧造模前將培養(yǎng)液更換為不加血清的DMEM低糖培養(yǎng)基，之后缺氧造模6 h，取各組上清，ELISA法測定cTn以及IL-1β表達(dá)水平。

1.3.7實時熒光定量PCR檢測基因表達(dá)水平 實驗分組以及細(xì)胞處理方法同上，缺氧造模后使用Trizol提取各實驗組細(xì)胞RNA，并根據(jù)試劑盒使用說明將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，-20 ℃保存待用。之后取各實驗組cDNA進(jìn)行實時熒光定量PCR測定，反應(yīng)體系為EvaGreen 5 μL，cDNA 1 μL，上下游引物各0.3 μL，無核酶水3.4 μL。引物序列見Tab 1。

Tab 1 Primer sequences of selected genes

1.3.8Western blot檢測蛋白表達(dá) 實驗分組以及處理方法同上，之后提取各實驗組細(xì)胞總蛋白，并用nanodrop測定各組蛋白濃度，然后將各組蛋白濃度稀釋到同一水平，以每孔30 μg上樣量跑膠。條件為：預(yù)電泳濃縮膠60 V電泳30 min，待Marker完全跑開后改用90 V繼續(xù)電泳下層膠，充分分離后改用350 mA電流轉(zhuǎn)PVDF膜1.5 h，之后PVDF膜用5%脫脂奶粉(1× TBST溶液配制)在室溫條件下封閉1 h， 4 ℃孵育一抗過夜，隔天使用1× TBST溶液將PVDF膜洗滌3次，每次15 min，然后室溫孵育二抗1 h，再把膜用1× TBST溶液洗滌3次，每次15 min。曝光顯影，實驗重復(fù)三次,用軟件進(jìn)行半定量分析。

1.3.9統(tǒng)計學(xué)分析 使用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，多樣本均數(shù)間比較采用單因素方差分析，兩樣本之間比較用t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度Sal B對H9C2細(xì)胞活力的影響如圖所示，當(dāng)Sal B濃度為30 μmol·L-1及以上時，與對照組相比，H9C2細(xì)胞存活率存在顯著性差異。綜合細(xì)胞存活率以及顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)觀察，本實驗分別選用1、5、25 μmol·L-1作為Sal B預(yù)處理的低，中，高濃度。

Fig 1 Survival rate of H9C2 treated with different concentrations of Sal

*P<0.05,**P<0.01vsControl

2.2 Sal B對缺氧造模后H9C2細(xì)胞的影響如Fig 2所示，缺氧造模處理后，模型組H9C2細(xì)胞活力降低，高劑量Sal B預(yù)處理組H9C2細(xì)胞活性升高，且與模型組差異存在顯著性。

Fig 2 Cell activity of each n=6)

##P<0.01vsControl;*P<0.05vsModel

2.3 Sal B降低缺氧造模后細(xì)胞上清中的LDH、cTn、IL-1β水平大量文獻(xiàn)表明，在心肌缺血發(fā)生過程中LDH，cTn等心肌損傷標(biāo)志物以及IL-1β等炎癥因子的分泌量會增加。如Fig 3所示，與對照組相比，缺氧造模后，H9C2細(xì)胞LDH,cTn以及IL-1β分泌量升高。與模型組相比，中，高劑量組Sal B，IRAK1抑制劑預(yù)處理可以降低H9C2缺氧造模后的LDH分泌量，高劑量組Sal B，IRAK1抑制劑預(yù)處理可以降低H9C2缺氧造模后的cTn水平，提示Sal B對缺氧導(dǎo)致的H9C2心肌細(xì)胞損傷有一定的保護(hù)作用。且與模型組相比，高劑量組Sal B，IRAK1抑制劑預(yù)處理可以降低H9C2缺氧造模后的IL-1β分泌量，提示其作用機(jī)制可能與抑制心肌缺血過程中炎癥因子的分泌有關(guān)。

2.4 Sal B降低缺氧造模后細(xì)胞TLR4、Myd88、IRAK1、NF-κB、NLRP3 mRNA表達(dá)水平如Fig 4所示，與對照組相比，缺氧造模組的TLR4、Myd88、IRAK1、NF-κB、NLRP3 mRNA表達(dá)水平明顯升高；使用Sal B預(yù)處理后TLR4、Myd88、IRAK1、NF-κB、NLRP3 mRNA表達(dá)水平降低，與模型組差異有顯著性。與模型組相比，IRAK1抑制劑組的TLR4、Myd88 mRNA表達(dá)水平差異未見顯著性；IRAK1、NF-κB、NLRP3表達(dá)水平降低，且與Sal B預(yù)處理高劑量組比較差異未見顯著性。

Fig 3 Effect of Sal B on levels of LDH,cTn and IL-1β in supernatant of H9C2 cells induced by

A：The expression level of LDH; B：The expression level of cTn; C：The expression level of IL-1 (1:Control; 2:Model;3: 1 μmol·L-1; 4:5 μmol·L-1; 5: 25 μmol·L-1; 6:IRAK1 inhibitor).##P<0.01vsControl;**P<0.01vsmodel group.

Fig 4 Effect of Sal B on relative mRNA levels in H9C2 cells induced by hypoxia(n=3)

A：mRNA expression levels of TLR4; B：mRNA expression levels of myd88; C：mRNA expression levels of IRAK1(1:Control; 2:Model;3: 1 μmol·L-1; 4:5 μmol·L-1; 5: 25 μmol·L-1; 6:IRAK1 inhibitor); D：mRNA expression levels of NF-κB(1:Control; 2:Model;3: 1 μmol·L-1; 4:5 μmol·L-1; 5: 25 μmol·L-1; 6:IRAK1 inhibitor); E：mRNA expression levels of NLRP3(1:Control; 2:Model;3: 1 μmol·L-1; 4:5 μmol·L-1; 5: 25 μmol·L-1; 6:IRAK1 inhibitor).#P<0.05,##P<0.01vsControl;**P<0.01vsModel.

2.5 Sal B降低缺氧造模后細(xì)胞TLR4、Myd88、IRAK1、NF-κB、NLRP3蛋白表達(dá)水平如Fig 5所示，缺氧造模處理后心肌細(xì)胞TLR4、Myd88、IRAK1、NF-κB、NLRP3蛋白表達(dá)水平升高；用Sal B預(yù)處理后蛋白表達(dá)水平降低。與模型組相比，IRAK1抑制劑組的TLR4、Myd88 蛋白表達(dá)水平差異顯著性；IRAK1、NF-κB、NLRP3蛋白表達(dá)水平顯著降低，且與Sal B預(yù)處理高劑量組比較差異未見顯著性。

3 討論

心肌缺血是一種血氧供需失衡的狀態(tài)[11]。研究表明多種疾病都會導(dǎo)致心肌缺血的發(fā)生，如高血壓、冠心病、動脈粥樣硬化等。當(dāng)機(jī)體受到外部環(huán)境或自身損傷因子等因素刺激時，TLR4/NF-κB信號通路首先被激活，并帶來劇烈的炎癥級聯(lián)反應(yīng)[12]。NLRP3炎癥小體作為固有免疫的組成部分之一，在心肌缺血的炎癥性損傷中扮演著重要的角色[13]。諸多研究顯示，抑制心肌缺血過程中的NLRP3炎癥小體的激活，能夠有效減輕心肌缺血損傷[14]。

經(jīng)典的NLRP3炎癥小體激活需要啟動階段與激活階段兩個步驟，且在心肌細(xì)胞中必須兩個階段共同參與才能有效的誘導(dǎo)NLRP3炎癥小體激活[15]。Priming階段作為心肌細(xì)胞中NLRP3炎癥小體激活的啟動步驟，與心肌細(xì)胞中NLRP3炎癥小體的激活密切相關(guān)。Sal B作為丹參中藥理活性最強(qiáng)的水溶性成分之一，具有良好的抗炎活性。本實驗結(jié)果表明，Sal B能夠有效抑制缺氧誘導(dǎo)后心肌細(xì)胞中NLRP3炎癥小體的priming階段相關(guān)基因與蛋白表達(dá)，減少cTn等心肌損傷標(biāo)志物和IL-1β等炎癥因子的分泌，并減弱心肌細(xì)胞缺氧損傷，這為Sal B在臨床上抗心肌缺血的應(yīng)用提供了一定參考。但本實驗僅在體外進(jìn)行了驗證，未能對相關(guān)信號通路進(jìn)行更加充分的研究，后續(xù)將加入動物實驗，更加明確Sal B抑制NLRP3炎癥小體激活的機(jī)制。

Fig 5 Sal B inhibited protein expression of NLRP3 priming after hypoxia(n=3)*P<0.05,**P<0.01 vs Control

總之，Sal B能夠有效抑制缺氧誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞損傷，其作用機(jī)制可能與抑制NLRP3炎癥小體priming階段的激活有關(guān)。