張佳瑜，徐晨悅，趙伊珂，周彥宏，金 鑫，張國紅，趙志英

(河北醫(yī)科大學 1.第二臨床醫(yī)學院，2.臨床學院實驗中心，3.基礎醫(yī)學院藥理教研室，教育部血管與神經(jīng)生物學重點實驗室，河北 石家莊 050017)

在生理狀態(tài)下，機體受到強烈的機械、化學及熱刺激后，局部組織損傷，釋放前列腺素E、組胺、羥色胺、緩激肽等致痛物質(zhì)，興奮傷害性感受器，產(chǎn)生異常動作電位，經(jīng)由三叉神經(jīng)節(jié)或背根神經(jīng)節(jié)中的中小型神經(jīng)元感受并向中樞傳遞,引起疼痛反應。目前的鎮(zhèn)痛藥主要包括中樞性鎮(zhèn)痛藥和非中樞性抗炎藥[1]，后者主要是非甾體類抗炎藥(non-steroidal anti-inflammatory drugs，NSAIDs)，通過抑制花生四烯酸環(huán)氧化酶(cyclooxygenase，COX)的活性來抑制炎性介質(zhì)的分泌而發(fā)揮作用，但存在消化道潰瘍、腎臟毒性、血小板功能障礙等不良反應，以及鎮(zhèn)痛效果較弱的特點。使用NSAIDs，用藥劑量達到一定水平以上時，增加藥物劑量既不能增強其鎮(zhèn)痛作用，又明顯增加藥物的毒性反應。因此，臨床上如果需要長期使用NSAIDs，或日用劑量已經(jīng)達到限制性用量時，應考慮更換為阿片類鎮(zhèn)痛藥[2]，但阿片類藥物由于其成癮性等副作用限制了其臨床應用。

通過聯(lián)合用藥可以增加主要藥物的鎮(zhèn)痛效果或減輕副作用，減少阿片類藥物的應用。鉀離子通道在維持神經(jīng)細胞膜電位和興奮性中起重要作用，多項研究表明[3]，電壓門控性鉀離子通道家族(voltage dependent potassium channel，Kv)中，Kv7通道開放劑可以通過提高電壓依賴性鉀電流[voltage dependent potassium currents，IK( M)] 使膜靜息電位處于超極化狀態(tài)，降低神經(jīng)元的興奮性，阻斷疼痛信號的產(chǎn)生和神經(jīng)傳導，具有良好的鎮(zhèn)痛應用前景。

目前臨床上應用的NSAIDs主要是阿司匹林(aspirin)，醋酸扭體法和熱板法是最常見的篩選鎮(zhèn)痛藥的方法，因此，本課題組選用兩種Kv7通道開放劑氟吡汀(flupirtine)、瑞替加濱(retigabine)，通過醋酸扭體法和熱板法探究其是否能提高阿司匹林的鎮(zhèn)痛作用，以期為新型鎮(zhèn)痛藥的開發(fā)以及不同類型鎮(zhèn)痛藥的聯(lián)合應用提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物與試劑

1.1.1實驗動物 清潔級健康小鼠，由河北醫(yī)科大學實驗動物中心提供。實驗動物使用許可證號:SYXK(冀)2018-008。

1.1.2試劑和儀器 注射用精氨酸阿司匹林，瑞陽制藥有限公司，批號：17083102；瑞替加濱，上海源葉生物科技有限公司，純度98%，批號：D17S6K3493；馬來酸氟吡汀，上海源葉生物科技有限公司，純度99%，批號：N03M9W60415；冰醋酸，天津市永大化學試劑有限公司，批號：20160625；生理鹽水，石家莊四藥有限公司，批號：1801203402；RCY-2熱板測痛儀，石家莊市冀星實驗儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1扭體法 清潔級小鼠42只(♂♀兼用)，體質(zhì)量(20±2)g，隨機分成6組，即對照組、阿司匹林組(600 mg·kg-1)、氟吡汀組(20 mg·kg-1)、瑞替加濱組(20 mg·kg-1)、阿司匹林(600 mg·kg-1)+氟吡汀(20 mg·kg-1)組、阿司匹林(600 mg·kg-1)+瑞替加濱(20 mg·kg-1)組，每組7只。分組腹腔注射給藥，給藥后30min，腹腔注射冰醋酸(1.2%，10ml·kg-1)，然后觀察記錄20min內(nèi)各組扭體反應潛伏期及扭體反應次數(shù)。

1.2.2熱板法 清潔級小鼠，♀，體質(zhì)量(20±2)g，首先設定熱板溫度為(55 ±0.5)℃，選出痛閾在30s內(nèi)的雌鼠供實驗使用。將48只雌鼠隨機分成6組，即對照組、阿司匹林組(600 mg·kg-1)、氟吡汀組(20 mg·kg-1)、瑞替加濱組(20 mg·kg-1)、阿司匹林(600 mg·kg-1)+氟吡汀(20 mg·kg-1)組、阿司匹林(600 mg·kg-1)+瑞替加濱(20 mg·kg-1)組。給藥前先測定各小鼠給藥前舔后足潛伏期時間，然后每組小鼠給予相應的藥物, 給藥15、30、45、60 min分別測定小鼠舔后足潛伏期時間1次。痛閾按60s計算，對60s不舔后足的小鼠，應立即取出。統(tǒng)計數(shù)據(jù)，計算不同時間舔后足潛伏期延長率。舔后足潛伏期延長率/%=(給藥后各時間點測定的舔后足潛伏期-給藥前舔后足潛伏期)/給藥前舔后足潛伏期×100%。

2 結果

2.1 對醋酸所致小鼠扭體反應的影響與對照組相比，阿司匹林組扭體反應潛伏期時間明顯延長(P<0.01)，扭體次數(shù)明顯減少(P<0.01)；氟吡汀組、瑞替加濱組扭體反應潛伏期差異無顯著性，但扭體次數(shù)明顯減少(P<0.01)；阿司匹林+氟吡汀組扭體反應潛伏期時間明顯延長(P<0.05)，扭體次數(shù)明顯減少(P<0.01)；阿司匹林+瑞替加濱組扭體反應潛伏期時間也明顯延長(P<0.01)，扭體次數(shù)也明顯減少(P<0.01)。

與阿司匹林組相比，阿司匹林+氟吡汀組扭體反應潛伏期無差異，但扭體次數(shù)明顯減少(P<0.01)；阿司匹林+瑞替加濱組扭體反應潛伏期明顯延長(P<0.01)，扭體反應次數(shù)明顯減少(P<0.01)。

氟吡汀組與瑞替加濱組在扭體反應中的鎮(zhèn)痛作用未見明顯差異，但與阿司匹林+氟吡汀組相比，阿司匹林+瑞替加濱組明顯延長了扭體反應潛伏期時間(P<0.01)。見Tab 1 。

Tab 1 Effect of turning body induced by

*P<0.05,**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsaspirin;△△P<0.01vsaspirin+flupirtine

2.2 對熱板致痛的鎮(zhèn)痛作用與對照組相比，除瑞替加濱組外，各給藥組在給藥15 min后舔后足潛伏期延長率均明顯增加(P<0.05)；第30 min、45 min和60 min，除阿司匹林+瑞替加濱組與對照組相比舔后足潛伏期延長率明顯增加外(P<0.05或P<0.01)，其余各組與對照組差異無顯著性，但存在增加趨勢。與阿司匹林組相比，除阿司匹林+氟吡汀組給藥45 min舔后足潛伏期延長率下降外，阿司匹林+氟吡汀組和阿司匹林+瑞替加濱組在其余各時間舔后足潛伏期延長率均較阿司匹林組有增加趨勢，其中阿司匹林+瑞替加濱組在30 min和60 min時與阿司匹林組差異有顯著性(P<0.05)。與阿司匹林+氟吡汀組相比，阿司匹林+瑞替加濱組在45 min和60 min舔后足潛伏期明顯延長，舔后足潛伏期延長率差異有顯著性(P<0.01，P<0.05)。見Tab 2。

3 討論

疼痛是臨床常見的癥狀之一，目前臨床上疼痛治療的藥物很多，阿司匹林是常用的藥物之一。本文通過醋酸扭體法和熱板法研究Kv7通道開放劑氟吡汀和瑞替加濱與阿司匹林的聯(lián)合應用，為臨床疼痛治療和新型復方鎮(zhèn)痛藥物的開發(fā)提供一種新的方案。

阿司匹林是常用的NSAIDs，通過抑制體內(nèi)前列腺素的生物合成，降低前列腺素本身的致痛作用，并且降低前列腺素使末梢感受器對緩激肽等致痛因子增敏作用。但阿司匹林的胃腸道、泌尿系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)等方面的不良反應發(fā)生率較高; 同時作為癌痛第一階梯的主要用藥，阿司匹林存在最大有效劑量，此時再增加藥物劑量并不能增強其止痛效果，反而使藥物的毒性反應明顯增加，限制了其臨床應用。

GroupIncrement percentage of latent period/%15 min30 min45 min60 minControl-26.37±4.53-19.56±8.25-4.23±10.23-16.13±19.78Aspirin3.12±12.36*-5.26±18.6624.51±30.54-7.07±20.52Flupirtine23.18±17.11*-1.76±11.5215.32±26.1415.47±17.31Retigabine-25.17±7.98-20.43±13.98-18.52±15.752.75±11.09Aspirin+Flupirtine6.68±10.96*18.29±15.86-5.58±8.33-3.96±6.86Aspirin+Retigabine25.69±17.19*73.33±22.83**#33.27±5.29△△64.77±22.89*#△

*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05vsaspirin;△P<0.05,△△P<0.01vsaspirin+flupirtine

氟吡汀和瑞替加濱是唯一被批準用于臨床的神經(jīng)元Kv7通道開放劑，近年來，氟吡汀的鎮(zhèn)痛作用已逐漸被證實，并在各種疼痛的臨床治療觀察中效果良好。另外有研究表明[4]，氟吡汀能協(xié)同增強嗎啡、曲馬多的鎮(zhèn)痛作用。瑞替加濱作為抗癲癇藥物已在國外上市，但研究表明瑞替加濱對神經(jīng)病理性疼痛、炎性疼痛、內(nèi)臟性疼痛等多種疼痛具有鎮(zhèn)痛作用[5-7]。研究表明，Kv7通道在初級傳入神經(jīng)元以及丘腦和脊髓神經(jīng)元中表達。Kv7.2-5參與IK( M)的產(chǎn)生，IK(M) 通過控制動作電位的產(chǎn)生和頻率，使細胞復極來降低周圍和中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮性，從而發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用[8]。

醋酸扭體法是最常見的篩選鎮(zhèn)痛藥的方法，簡便、敏感且重復性好，醋酸刺激引起小鼠腹膜炎癥而產(chǎn)生疼痛，表現(xiàn)為腹部收縮內(nèi)凹、臀部歪扭、腹前壁緊貼籠底和后肢伸張樣的扭體反應。醋酸介導的扭體反應可能是由腹腔pH值降低而直接刺激傷害性傳入神經(jīng)元和促進炎癥遞質(zhì)的合成導致，是外周疼痛的經(jīng)典模型。本實驗中，阿司匹林、氟吡汀和瑞替加濱都表現(xiàn)出明顯的鎮(zhèn)痛作用，阿司匹林組扭體次數(shù)與后兩者相比無明顯差異，但更明顯延長了小鼠扭體潛伏期時間(P<0.01)，表現(xiàn)出更強的鎮(zhèn)痛作用。與阿司匹林組相比，阿司匹林+瑞替加濱組的扭體潛伏期明顯延長(P<0.01)，阿司匹林+氟吡汀組和阿司匹林+瑞替加濱組扭體次數(shù)明顯減少(P<0.01，P<0.01)，說明氟吡汀、瑞替加濱能增強阿司匹林的鎮(zhèn)痛作用，發(fā)揮聯(lián)合鎮(zhèn)痛作用。

熱板法[9]是利用一定強度的溫熱刺激動物軀體的某一部位以產(chǎn)生痛反應，以刺激開始至出現(xiàn)反應的潛伏期為測痛指標。在本實驗中，阿司匹林較氟吡汀和瑞替加濱并未顯示出鎮(zhèn)痛優(yōu)勢，但與阿司匹林組相比，阿司匹林+氟吡汀組的舔后足潛伏期延長率均有增加趨勢，阿司匹林+瑞替加濱組在30 min和60 min的舔后足潛伏期延長率明顯增加(P<0.05)，進一步證明了氟吡汀、瑞替加濱能增強阿司匹林的鎮(zhèn)痛作用。

此外，在兩組研究中，我們發(fā)現(xiàn)氟吡汀組與瑞替加濱組的鎮(zhèn)痛作用未顯示出明顯差異，但阿司匹林+瑞替加濱組卻較阿司匹林+氟吡汀組顯示出更強的鎮(zhèn)痛效果。我們推測，此現(xiàn)象可能是由于氟吡汀、瑞替加濱的結構不同，與相應受體結合的基團存在差異[10]，從而導致兩者與受體的親和力不同，使得瑞替加濱與阿司匹林聯(lián)用較氟吡汀與阿司匹林聯(lián)用顯示出更強的鎮(zhèn)痛效果。有研究表明[10-11]，瑞替加濱EC50值小于氟吡汀，也支持了我們的推測。

阿片類藥物、膽堿及地塞米松與阿司匹林聯(lián)合應用的鎮(zhèn)痛作用已被證實[12-13]。本文研究表明，阿司匹林和Kv7通道開放劑氟吡汀、瑞替加濱單用有鎮(zhèn)痛作用，而當阿司匹林和氟吡汀或瑞替加濱聯(lián)合應用時，氟吡汀或瑞替加濱能增強阿司匹林的鎮(zhèn)痛作用，其效果比單用阿司匹林更為明顯，這也進一步說明聯(lián)合用藥比單一藥物鎮(zhèn)痛有更為明顯的效果。阿司匹林通過抑制體內(nèi)前列腺素的生物合成，減少了疼痛信號的產(chǎn)生，同時減少中樞COX-2表達上調(diào)以抑制中樞痛覺超敏，而氟吡汀、瑞替加濱則通過開放Kv7通道，提高了IK( M)，使膜靜息電位處于超極化狀態(tài)，降低中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元興奮性，抑制了疼痛信號的傳導和中樞痛覺超敏。有文獻報道[14]，具有不同機制的藥物聯(lián)合應用很可能表現(xiàn)為協(xié)同作用，而具有相似機制的藥物聯(lián)合應用表現(xiàn)為相加作用。本實驗中，阿司匹林和Kv7通道開放劑通過不同機制發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用，故推斷兩者的相互作用可能為協(xié)同作用。

阿司匹林和Kv7通道開放劑的聯(lián)合應用符合多模式鎮(zhèn)痛的理念，即聯(lián)合使用不同作用機制的鎮(zhèn)痛藥物，通過多種機制產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用，從而獲得更好的鎮(zhèn)痛效果，降低藥物副作用。本實驗采用小劑量阿司匹林進行探究，聯(lián)合應用效果與阿司匹林的劑量關系仍需進一步探究；另外，雖然氟吡汀、瑞替加濱的副作用相對較少，但它們可能產(chǎn)生抑制平滑肌收縮[15]、肝臟毒性等不良反應，與阿司匹林聯(lián)合應用的安全性也需進一步驗證。