(長(zhǎng)治學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)系,山西長(zhǎng)治 046011)

衰老是引起多種慢性疾病的主要原因之一。近年來,預(yù)防衰老逐漸成為人們關(guān)注的焦點(diǎn),提高機(jī)體免疫力的保健食品和藥品也應(yīng)運(yùn)而生。大量研究證明,中藥多糖尤其是補(bǔ)益類多糖可提高機(jī)體免疫器官質(zhì)量,增強(qiáng)動(dòng)物機(jī)體免疫功能,且具有安全、無(wú)毒、無(wú)殘留等優(yōu)點(diǎn),是一類優(yōu)良的生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑[1-2]。

中藥黃芪(Astragalusmembranaceus),又名北芪、綿芪,為豆科多年生草本植物,有膜莢黃芪和內(nèi)蒙黃芪兩種?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》中記載該藥味甘,性微溫,歸脾肺經(jīng),具有益氣固表、斂汗固脫、利水消腫之功效。研究表明黃芪中最主要的活性成分是黃芪多糖(Astragaluspolysaccharide),具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、保護(hù)腸道、抗衰老等作用。舒迎霜等[3]研究表明黃芪多糖能顯著提高犬血清中IgA、IgG、IgM和IFN-γ水平,促進(jìn)犬小腸IgA mRNA和SIgA蛋自表達(dá),提高機(jī)體免疫力。凌洪鋒等[4]關(guān)于黃芪多糖對(duì)小鼠衰老模型的抗氧化作用研究表明,黃芪多糖有較好的抗氧化作用。黃芪多糖的抗氧化性主要通過清除DPPH、超氧陰離子、羥基自由基來實(shí)現(xiàn)[5]。清除自由基的抗氧化類食品可表現(xiàn)出不同程度的延緩衰老作用[6],陳敏[7]研究黃芪多糖對(duì)家蠶壽命的影響,結(jié)果表明黃芪多糖可延長(zhǎng)家蠶壽命。

目前,關(guān)于黃芪多糖的抗氧化作用主要在禽畜中進(jìn)行,試驗(yàn)周期長(zhǎng)。果蠅(Drosophilamelanogaster)作為遺傳學(xué)模式生物之一,具有與人類十分相似的病理結(jié)構(gòu)、致病基因和衰老基因[8-9],因此常被用作壽命和抗衰老的生物模型[10-11]。但關(guān)于黃芪多糖對(duì)果蠅壽命的影響未見報(bào)道。因此,本文以果蠅為研究對(duì)象,用不同濃度黃芪多糖的培養(yǎng)基喂養(yǎng),研究黃芪多糖對(duì)果蠅壽命和抗氧化酶活性的影響,以期為黃芪多糖的開發(fā)提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

野生型黑腹果蠅(Drosophilamelanogaster),雄性成蟲重(0.531±0.049) mg,雌性成蟲重(0.714±0.052) mg 均由長(zhǎng)治學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)系遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供;黃芪多糖(純度UV≥90%)、超氧化物歧化酶(SOD)活力測(cè)定試劑盒(編號(hào)為A001-3)、總抗氧化能力(T-AOC)測(cè)定試劑盒(編號(hào)為A015-1)、丙二醛(MDA)含量測(cè)定試劑盒(編號(hào)為A003-1) 北京索萊寶科技有限公司。

BSA 124S-CW 電子天平 賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司;SMZ-B2連續(xù)變倍體視顯微鏡 重慶澳浦光電技術(shù)有限公司;TGL-20M高速冷凍離心機(jī) 長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司;723N可見光分光光度計(jì) 上海儀電分析儀器有限公司;Spectra Max M2多功能酶標(biāo)儀 美谷分子儀器(上海)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 果蠅培養(yǎng) 果蠅基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方為玉米粉10%,白糖5%,酵母粉1.5%,瓊脂1.5%,丙酸0.25%～0.4%。黃芪多糖培養(yǎng)基是在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別加1%(m/V)黃芪多糖母液1、5、10、15、20 mL,使其終濃度為0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 μg/mL。每天光照培養(yǎng)12 h,溫度為(25±1) ℃,濕度為40%～60%。

1.2.2 果蠅生存實(shí)驗(yàn) 收集剛羽化8 h內(nèi)未交配的雌、雄果蠅各600只,分成6組,分別培養(yǎng)在不同濃度黃芪多糖(0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 μg/mL)的培養(yǎng)基中,每組5管,每管20只，對(duì)照組不加黃芪多糖。每6 d更換一次相應(yīng)濃度的培養(yǎng)基,每天定時(shí)觀察、記錄統(tǒng)計(jì)死亡的果蠅數(shù),非正常死亡的果蠅不計(jì)在內(nèi),直到最后一只果蠅死亡。對(duì)統(tǒng)計(jì)的結(jié)果進(jìn)行整理,計(jì)算果蠅的半數(shù)死亡時(shí)間、平均壽命、最高壽命。每組最后存活的4只果蠅死亡天數(shù)的算術(shù)平均數(shù)作為最高壽命[12]。

1.2.3 果蠅逆重力爬行實(shí)驗(yàn) 取剛羽化8 h內(nèi)的雌雄果蠅各6組,每組3管,每管20只。每 6 d更換一次相應(yīng)濃度的培養(yǎng)基,培養(yǎng)30 d后,將果蠅轉(zhuǎn)移至干凈的指管中,輕拍指管使所有果蠅落至底部。統(tǒng)計(jì)1 min內(nèi)爬過標(biāo)記(距管底6 cm)的果蠅數(shù)量[13]。

1.2.4 果蠅抗氧化活性實(shí)驗(yàn) 取剛羽化8 h內(nèi)未交配的雌、雄果蠅各6 組,分別培養(yǎng)在不同濃度的黃芪多糖培養(yǎng)基中,每組設(shè)3管重復(fù),每管20只,每6 d更換一次相應(yīng)濃度的培養(yǎng)基,將培養(yǎng)30 d的果蠅移入麻醉瓶中,用乙醚使其麻醉、分別稱取20 mg雌、雄果蠅放入4 ℃預(yù)冷的研缽中,加入預(yù)冷的生理鹽水100 μL,充分研磨后,經(jīng)4 ℃,3500 r/min離心15 min,取上清液按照試劑盒步驟進(jìn)行SOD、T-AOC活性及MDA含量的測(cè)定。其中,組織液中可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定,根據(jù)1%果蠅組織液適當(dāng)稀釋后于595 nm測(cè)定吸光值,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.0087x+0.011,R2=0.9934,計(jì)算組織液中蛋白質(zhì)含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,并用t 檢驗(yàn)進(jìn)行組間差異檢驗(yàn),以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)結(jié)果均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃芪多糖對(duì)果蠅壽命的影響

黃芪多糖對(duì)果蠅壽命的影響結(jié)果見表1。由表1可知,在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi),黃芪多糖對(duì)雌、雄果蠅的平均壽命、半數(shù)死亡時(shí)間和最高壽命的影響呈先延長(zhǎng)后縮短的趨勢(shì),均顯著高于對(duì)照(P<0.05)。當(dāng)黃芪多糖濃度為1.0 μg/mL時(shí),雌、雄果蠅的半數(shù)死亡時(shí)間最長(zhǎng),分別比對(duì)照提高了52.09%和53.65%,黃芪多糖對(duì)提高雄果蠅半數(shù)死亡時(shí)間比雌果蠅高1.56%;另外,雌、雄果蠅的平均壽命最高,與對(duì)照相比,分別延長(zhǎng)了27.69%和25.77%;最高壽命最長(zhǎng),分別比對(duì)照延長(zhǎng)了16.71%和15.78%,黃芪多糖對(duì)延長(zhǎng)雌果蠅平均壽命和最高壽命的影響分別高于雄性1.92%和0.93%。表明黃芪多糖可提高雌、雄果蠅的平均壽命,半數(shù)死亡時(shí)間和最高壽命。這與研究黨參多糖[14]、山刺玫果多糖[15]和紫薯多糖[16]具有抗氧化性,延緩衰老結(jié)果相一致。最高壽命可以體現(xiàn)出果蠅對(duì)具有功能因子物質(zhì)的適應(yīng)性及耐受性[17]。本文研究結(jié)果表明黃芪多糖對(duì)雌、雄果蠅最高壽命的提高幅度不同,可能是由于雌、雄果蠅對(duì)受試藥物黃芪多糖的適應(yīng)性和敏感性不同造成,與丘婷等[18]研究六味地黃生物制劑多糖對(duì)果蠅抗氧化作用的影響的結(jié)果相一致。

表1 黃芪多糖對(duì)果蠅壽命的影響Table 1 Effects of Astragalus polysaccharide on life span of D. melanogaster

注:不同小寫字母表示相同指標(biāo)不同處理間差異顯著(P<0.05),表2～表4同。

2.2 黃芪多糖對(duì)果蠅逆重力爬行能力的影響

黃芪多糖對(duì)果蠅逆重力爬行能力的影響見表2,由表2可知,隨著黃芪多糖濃度的增加,雌、雄果蠅逆爬行能力呈先增加后下降趨勢(shì)。當(dāng)黃芪多糖濃度為1.0 μg/mL時(shí),雌、雄果蠅的逆爬行能力最強(qiáng)分別為64.50%±3.03%和57.37%±3.39%,與對(duì)照相比差異顯著(P<0.05),其中雌果蠅逆重力爬行能力增加了14.16%,雄果蠅逆重力爬行能力增加了27.97%。當(dāng)黃芪多糖濃度為2.0 μg/mL時(shí),與對(duì)照相比,雌果蠅逆重力爬行能力下降了11.77%,差異顯著(P<0.05);雄果蠅逆重力爬行能力下降了2.28%,差異不顯著。比較發(fā)現(xiàn),同一濃度下,黃芪多糖對(duì)雄果蠅逆重力爬行能力增加量大于對(duì)雌性的影響,說明黃芪多糖可明顯增強(qiáng)機(jī)體運(yùn)動(dòng)能力,且對(duì)雄果蠅逆重力爬行能力的作用較強(qiáng)。

表2 黃芪多糖對(duì)果蠅逆重力爬行能力的影響Table 2 Effects of Astragalus polysaccharide on the negative geotaxis ability of D. melanogaster

表3 黃芪多糖對(duì)果蠅SOD和T-AOC的影響Table 3 Effects of Astragalus polysaccharide on SOD and T-AOC contents of D. melanogaster

2.3 黃芪多糖對(duì)果蠅SOD和T-AOC的影響

表3是不同濃度黃芪多糖對(duì)果蠅超氧化物歧化酶SOD酶活性和T-AOC含量的測(cè)定結(jié)果。由表3可知,隨著黃芪多糖濃度的逐漸增加,雌、雄果蠅體內(nèi)SOD酶活性和T-AOC含量呈先增加后下降趨勢(shì),但均高于對(duì)照。當(dāng)黃芪多糖的濃度為1.0 μg/mL時(shí),雌果蠅體內(nèi)SOD酶和T-AOC活性最高,為(172.54±1.62)和(209.4±2.35) U/mg prot,分別比對(duì)照提高了53.85%和59.03%;雄果蠅體內(nèi)SOD酶和T-AOC活性最高,為(123.87±1.14)和(201.17±1.78) U/mg prot,分別比對(duì)照提高了56.52%和55.73%,差異極顯著(P<0.05)。當(dāng)黃芪多糖的濃度為2.0 μg/mL時(shí),雌、雄果蠅體內(nèi)SOD酶和T-AOC的活性雖高于對(duì)照,但與對(duì)照相比差異不顯著(P>0.05)。

自由基學(xué)說是目前公認(rèn)的衰老學(xué)說之一[19]。正常情況下,機(jī)體通過產(chǎn)生和清除自由基維持機(jī)體的正常生理功能,使生物體保持平衡[20]。但是當(dāng)環(huán)境因素發(fā)生改變,就會(huì)誘導(dǎo)機(jī)體的抗氧化機(jī)制,保持自由基的產(chǎn)生與消除的平衡,對(duì)機(jī)體預(yù)防疾病與抗衰老等具有重要意義?？偪寡趸?T-AOC)是體內(nèi)非酶促和酶促系統(tǒng)抗氧化物質(zhì)的總和,可綜合反映機(jī)體的抗氧化能力[21],SOD作為體內(nèi)清除活性氧的主要抗氧化酶被認(rèn)為是機(jī)體內(nèi)自由基清除能力的間接評(píng)價(jià)指標(biāo)[22]。表3中當(dāng)黃芪多糖的濃度為1.0 μg/mL時(shí),雌、雄果蠅體內(nèi)SOD酶和T-AOC活性都最高,但是黃芪多糖對(duì)雄性果蠅SOD酶活性的提高幅度高于雌性2.67%,黃芪多糖對(duì)雌性果蠅T-AOC活性的提高幅度高于雄性3.3%。說明黃芪多糖可增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力,但是對(duì)雌果蠅體內(nèi)的非酶促抗氧化能力T-AOC影響較大,對(duì)雄果蠅的酶促抗氧化能力SOD影響較大。張碧瑩等[23]研究甘薯汁對(duì)果蠅壽命及抗氧化能力的影響,發(fā)現(xiàn)甘薯汁對(duì)提高雄蠅體內(nèi)SOD活性表現(xiàn)出更強(qiáng)的作用,這與本文研究結(jié)果一致。

2.4 黃芪多糖對(duì)果蠅MDA的影響

表4是黃芪多糖對(duì)果蠅MDA的變化。由表4可知,隨著黃芪多糖濃度的逐漸增加,雌雄果蠅體內(nèi)MDA的含量呈先下降后上升趨勢(shì),但均低于對(duì)照。當(dāng)黃芪多糖濃度為1.0 μg/mL時(shí),雌、雄果蠅體內(nèi)MDA的含量最低,為(0.65±0.03)和(0.87±0.02) nmol/mg prot,與對(duì)照相比,分別下降了38.68%和41.21%,且差異顯著(P<0.05)。

MDA是自由基作用于不飽和脂肪酸而產(chǎn)生的脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物,通常作為機(jī)體脂質(zhì)過氧化程度的指標(biāo)[24]。當(dāng)黃芪多糖濃度為1.0 μg/mL時(shí),雌、雄果蠅體內(nèi)SOD和T-AOC抗氧化活性最強(qiáng),MDA的含量最少,表明黃芪多糖可顯著(P<0.05)增強(qiáng)機(jī)體抗氧化脂質(zhì)程度。此時(shí),雄性果蠅體內(nèi)MDA含量的下降幅度高于雌性2.53%,說明黃芪多糖可顯著降低雄果蠅機(jī)體脂質(zhì)過氧化程度。

表4 黃芪多糖對(duì)果蠅MDA含量的影響Table 4 Effects of Astragalus polysaccharide on MDA content of D. melanogaster

3 結(jié)論

目前,關(guān)于黃芪多糖的抗氧化作用主要在禽畜中進(jìn)行,試驗(yàn)周期長(zhǎng)。因果蠅飼養(yǎng)容易,世代代周期短,易于操作,重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn),已在衛(wèi)生部頒布的《保健食品功能學(xué)評(píng)價(jià)程序和檢驗(yàn)方法》中被用作動(dòng)物模型來研究抗衰老活性及動(dòng)物抗衰老機(jī)制[25-26]。本文以果蠅為研究對(duì)象,研究黃芪多糖的抗氧化和抗衰老作用,結(jié)果表明,當(dāng)黃芪多糖濃度為1.0 μg/mL時(shí),可提高雌、雄果蠅的平均壽命、半數(shù)死亡時(shí)間和最高壽命,增強(qiáng)果蠅的逆重力爬行能力,機(jī)體SOD酶活性和T-AOC含量含量最高,MDA含量最低。且該濃度下,黃芪多糖對(duì)提高雄果蠅的半數(shù)死亡時(shí)間,逆重力爬行能力,SOD酶活性和MDA的含量的影響均高于雌性,說明黃芪多糖可增強(qiáng)雄果蠅的體質(zhì),提高其抗氧化能力;但是對(duì)雌果蠅的平均壽命和最高壽命以及T-AOC含量的影響高于雄性,說明喂食雌、雄果蠅黃芪多糖時(shí),在一定程度上激活雄果蠅機(jī)體的抗氧化機(jī)制抵御環(huán)境改變的能力強(qiáng)于雌果蠅,但是隨著喂食時(shí)間和生活時(shí)間的延長(zhǎng),雌果蠅可持續(xù)發(fā)揮抗氧化機(jī)制延長(zhǎng)其壽命強(qiáng)于雄果蠅?？赡苡捎诖?、雄果蠅體型大小不同,體質(zhì)不同,所以影響的效果也不一樣,還有待進(jìn)一步研究。