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(1.福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院,福建福州 350002; 2.福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室,福建福州 350005; 3.福建農(nóng)林大學(xué)安溪茶學(xué)院,福建福州 350002)

尿酸(Uric acid,UA)是嘌呤代謝的最終產(chǎn)物,尿酸高會引發(fā)高尿酸血癥(Hyperuricemia,HUA),進(jìn)而發(fā)展成痛風(fēng)、關(guān)節(jié)炎等病癥。目前,我國約有13.3%的人尿酸偏高,高尿酸血癥患者約1.2億人,痛風(fēng)發(fā)病率達(dá)到0.3%[1-2]。高尿酸血癥發(fā)病年齡逐漸年輕化,主要原因是長期不良的飲食習(xí)慣和營養(yǎng)狀況,現(xiàn)已和高血壓、高血糖、高血脂并稱為“四高”[3-4],且彼此呈正相關(guān)關(guān)系,因此,尿酸與總膽固醇(Total Cholesterol,TCHO)、血糖(Blood glucose,GLU)和甘油三酯(Trilaurin,TG)含量也具有相關(guān)性。腎臟是產(chǎn)生尿酸的主要器官,與尿酸生成直接相關(guān),肌酐(Creatinine,CRE)和腺苷脫氨酶(Adenosine deaminase,ADA)是腎臟的重要組成物質(zhì),二者含量的高低是腎臟功能強(qiáng)弱的主要判定方法,因此與尿酸息息相關(guān)。另外,肝臟與腎臟之間密切相關(guān),丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(Alanine aminotransferase,ALT)和天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(Aspartate aminotransferase,AST)是肝臟的主要形成物質(zhì),故和尿酸含量相關(guān)。別嘌醇(Allopurinol,API)是用于治療高尿酸血癥的藥物,能抑制黃嘌呤氧化酶活性,減少尿酸的合成,但有嚴(yán)重的副作用如過敏、皮疹、腹瀉,甚至?xí)种乒撬柩?xì)胞前體的活性,減少全血細(xì)胞[5-6]。因此,尋找代替別嘌醇的物質(zhì)十分重要。

六大茶類中,烏龍茶的茶黃素含量比較高,黑茶的茶褐素含量比較高[7]。前人對茶多酚[8-9]、兒茶素[10-14]以及綠茶提取物[15-16]、紅茶提取物[17]、黑茶提取物[18]在降尿酸方面的研究取得一定進(jìn)展,但是茶黃素(Theaflavins,TF)和茶褐素(Theabrownine,TB)對小鼠降尿酸作用尚未明確。

本研究以喂食自主設(shè)計(jì)的特制飼料建立了慢性高尿酸血癥小鼠的新模型,連續(xù)給小鼠灌胃茶黃素和茶褐素,斷尾取血檢測尿酸含量及其它相關(guān)生化成分,比較不同濃度的茶黃素、茶褐素對小鼠患高尿酸血癥的預(yù)防及改善作用的差異,為烏龍茶、黑茶的保健功效研究和降尿酸的輔助產(chǎn)品開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

CR小鼠 SPF級I,54 只,8 周,雌性,20～22 g,福建醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(動(dòng)物生產(chǎn)許可證號:SCXK(閩)2016-0002)，適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后開始實(shí)驗(yàn);別嘌醇、氧嗪酸鉀 湖北巨勝科技有限公司;茶黃素(純度99%) 上海金畔生物科技有限公司;茶褐素(純度90%) 濟(jì)南魯源生物科技有限公司;普通飼料(許可證號:SXCK(遼)2017-0001) 沈陽茂華生物科技有限公司;酵母粉(許可證號:SC20142050300018) 安琪酵母股份有限公司;蛋黃粉(許可證號:豫XK13-217-00123) 洛陽奇泓生物科技有限公司;海魚粉(許可證號:冀飼證201907933) 海興瑞祥飼料有限公司;白糖(許可證號:SC12153092204984) 云南云縣甘化有限公司;玉米粉(許可證號:SC10161042201225) 三原星緣農(nóng)副產(chǎn)品加工有限公司;豬油(許可證號:SC10337130200099) 臨沂新程金鑼肉制品集團(tuán)有限公司;膽固醇(C8280)、豬膽鹽(G8310) 北京索萊寶科技有限公司。

5424R小型臺式高速冷凍離心機(jī) 德國艾本德股份公司;ADVIA2400全自動(dòng)生化分析儀 美國西門子醫(yī)學(xué)診斷產(chǎn)品有限公司;HW-2旋渦混合器 常州市金壇友聯(lián)儀器研究所;BSA6202電子天平 賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 特制飼料配制 參考文獻(xiàn)[19],自制特制飼料。特制飼料是以酵母粉10%、蛋黃粉10%、海魚粉20%、氧嗪酸鉀0.1%、白糖15%、玉米粉15%、豬油10%、膽固醇4%、豬膽鹽0.3%和普通飼料15.6%配制加工而成。

1.2.2 動(dòng)物分組及實(shí)驗(yàn)方法 將54只ICR小鼠隨機(jī)分成9組,分別為正常組、模型組、茶黃素低、中、高3個(gè)劑量組(TF1、TF2、TF3)、茶褐素低、中、高3個(gè)劑量組(TB1、TB2、TB3)、陽性組,每組6只,實(shí)驗(yàn)分組飼料及灌胃樣品劑量詳見表1,所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均在(23±2) ℃下飼養(yǎng),每天12 h日光燈照射(7 am～7 pm),自由進(jìn)食和飲水。陽性組隔天灌胃,其余組連續(xù)灌胃21 d。第21 d灌胃藥物1 h后,稱量小鼠體重,處死小鼠,稱量其心、肝、肺、腎四個(gè)臟器的重量并計(jì)算臟器系數(shù)(臟器系數(shù)=臟器重量/小鼠體重)。

表1 不同濃度的茶黃素、茶褐素 對高尿酸血癥小鼠的尿酸抑制實(shí)驗(yàn)Table 1 Uric acid inhibition test of different concentrations of theaflavins and theaflavins on hyperuricemia mice

1.2.3 指標(biāo)檢測 第21 d給所有小鼠摘眼球取血,加1.5% EDTA抗凝劑50 μL,至3000 r/min離心5 min,取上清液于4 ℃保存靜置12 h后放置全自動(dòng)生化分析儀檢測血清中的尿酸(UA)、總膽固醇(TCHO)、葡萄糖(GLU)、甘油三酯(TG)、腺苷酸脫氫酶(ADA)、肌酐(CRE)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)指標(biāo)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 新慢性高尿酸血癥模型的建立

模型組與正常組相比,血清的尿酸含量極顯著增高57%(P<0.01，見表2),說明用特制飼料喂食小鼠致慢性高尿酸血癥造模成功,且不影響小鼠生命、生理活動(dòng)。同時(shí),模型組的血清TCHO、ADA、AST與正常組相比分別極顯著升高111%、279%、100%(P<0.01),血清ALT與正常組相比顯著升高31%(P<0.05),血清GLU極顯著降低63%(P<0.01),血清CRE、TG含量與正常組相比無顯著性,說明喂食特制飼料對小鼠的膽固醇、血糖含量有非常明顯的影響,且對小鼠肝臟、腎臟有一定影響。

表2 新慢性高尿酸血癥小鼠模型與正常組的對比Table 2 Comparison of new chronic HUA mice model and contorl group

注:小寫字母不同表示各試樣間差異顯著,P<0.05;大寫字母不同表示各試樣間差異極顯著性,P<0.01;表2同。

2.2 對HUA小鼠體重及變化量的影響

模型組與正常組相比體重顯著降低10.7%(P<0.05，圖1),說明喂食特制飼料會顯著影響小鼠體重。與模型組相比,灌胃200 mg/kg茶褐素使小鼠體重極顯著上升8%(P<0.01);灌胃濃度為400 mg/kg時(shí),茶黃素和茶褐素均使小鼠體重上升,灌胃800 mg/kg茶褐素也使小鼠體重升高,但沒有顯著性差異;灌胃800 mg/kg茶黃素后小鼠體重略有下降;灌胃陽性藥對小鼠體重幾乎沒有影響。

圖1 茶黃素、茶褐素對HUA小鼠體重的影響Fig.1 Effect of TF and TB on weight in HUA mice注：模型組與正常組比較：*表示差異顯著P<0.05， **表示差異極顯著P<0.01；與模型組比較： #表示差異顯著P<0.05，##表示 差異極顯著P<0.01，圖2～圖6同。

各組小鼠在第21 d后的體重變化量,見圖2。其中,與模型組相比,200 mg/kg茶黃素組、200、400、800 mg/kg茶褐素組這4組的體重變化量顯著高于模型組小鼠的體重變化量，且增加量超過20%；模型組、陽性組、400、800 mg/kg茶黃素組的小鼠體重增加量與其它組相比較低。說明喂食特制飼料后,灌胃不同濃度的茶褐素和200 mg/kg茶黃素對小鼠的體重均有升高作用,而灌胃400、800 mg/kg茶黃素對小鼠體重增長有輕微的抑制作用。

圖2 茶黃素、茶褐素對HUA小鼠體重變化量的影響Fig.2 Effect of TF and TB on the weight changes of HUA mice

2.3 對HUA小鼠血清尿酸含量的影響

與模型組相比,灌胃800 mg/kg茶黃素后,小鼠血清尿酸水平極顯著減少20%(P<0.01，圖3);陽性組的血清尿酸含量極顯著降低18%(P<0.01);灌胃400 mg/kg茶黃素對小鼠血清尿酸含量沒有顯著影響,灌胃400、800 mg/kg的茶褐素和200 mg/kg茶黃素組小鼠尿酸含量反而升高。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[20],茶褐素能調(diào)節(jié)尿酸水平,預(yù)防心腦血管疾病。本實(shí)驗(yàn)在檢測過程中發(fā)現(xiàn)灌胃茶褐素反而會刺激尿酸升高,其原因可能是茶褐素作為提取純化后的單體物質(zhì)對小鼠尿酸的作用不如純茶效果好,或可能是實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ突驅(qū)嶒?yàn)對象不同導(dǎo)致的結(jié)果差異。綜上,灌胃800 mg/kg茶黃素對HUA小鼠有降尿酸作用且效果較好,另外,灌胃不同濃度的茶黃素對高尿酸血癥小鼠的降尿酸作用存在差異,效果表現(xiàn)為:800 mg/kg茶黃素>400 mg/kg茶黃素。

圖3 茶黃素、茶褐素對HUA小鼠血清尿酸含量的影響Fig.3 Effect of TF and TB on serm uric acid contents of HUA mice

2.4 對HUA小鼠血清中TCHO、GLU、TG含量的影響

與正常組相比,喂食特制飼料后,模型組小鼠的血清TCHO含量顯著升高210%(P<0.05，見圖4),血清GLU含量則極顯著降低了63%(P<0.05),血清TG含量沒有顯著變化。與模型組相比,灌胃400、800 mg/kg茶黃素能極顯著升高血清中TCHO含量(P<0.01);灌胃200、800 mg/kg茶黃素能極顯著升高小鼠血清GLU的含量(P<0.01);灌胃不同濃度的茶黃素均能降低小鼠血清TG含量,但沒有顯著性差異。與模型組相比,灌胃不同濃度的茶褐素均能降低小鼠血清TCHO和TG含量;但沒有顯著性差異;灌胃不同濃度的茶褐素均能升高小鼠血清GLU含量。陽性組能極顯著降低小鼠的血清TCHO含量(P<0.01),對血清GLU、TG含量沒有顯著影響。說明茶黃素對高尿酸血癥小鼠的血清TG含量有降低作用,對高尿酸血癥小鼠的血清GLU含量、TCHO含量有升高作用;茶褐素對高尿酸血癥小鼠的血清TG含量有降低作用,對高尿酸血癥小鼠的血清GLU含量有升高作用,對血清TCHO含量有降低作用。可以看出,茶黃素和茶褐素對喂食小鼠特制飼料導(dǎo)致的低血糖有較好的緩解作用,同時(shí)對小鼠血脂含量有改善作用,但二者對小鼠膽固醇含量的影響不明顯。

圖4 茶黃素、茶褐素對HUA小鼠血清總膽固醇、 葡萄糖、甘油三酯含量的影響Fig.4 Effect of TF and TB on serum TCHO, CLU,TG contents of HUA mice

2.5 對HUA小鼠ADA、CRE的影響

與正常組相比,喂食特制飼料后,模型組小鼠的血清ADA含量極顯著升高379%(P<0.01，見圖5),血清CRE含量有降低但沒有顯著性差異。與模型組相比,陽性組對小鼠血清ADA含量顯著下降(P<0.05),血清CRE含量顯著上升(P<0.05)。與模型組相比,灌胃不同濃度的茶黃素能能顯著降低小鼠血清ADA含量(P<0.05);灌胃800 mg/kg茶黃素的高尿酸血癥小鼠血清CRE含量顯著下降(P<0.05);灌胃200 mg/kg茶黃素的高尿酸血癥小鼠血清CRE含量顯著上升(P<0.05);灌胃400 mg/kg茶黃素對血清CRE含量沒有顯著影響。灌胃不同濃度茶褐素的血清CRE含量顯著升高(P<0.05);灌胃400、800 mg/kg茶褐素的血清ADA含量顯著升高(P<0.05);灌胃200 mg/kg茶褐素的血清ADA含量顯著下降(P<0.05)。可以看出,茶黃素對小鼠的腎臟損傷有改善作用,而茶褐素的效果不理想。

圖5 茶黃素、茶褐素對HUA小鼠 血清腺苷酸脫氫酶、肌酐含量的影響Fig.5 Effect of TF and TB on serum ADA,CRE contents of HUA mice

2.6 對HUA小鼠ALT、AST的影響

與正常組相比,喂食特制飼料后,模型組小鼠的血清ALT、AST含量均顯著升高(P<0.05,見圖6)。與模型組相比,陽性組的小鼠血清AST含量顯著降低(P<0.05),ALT含量降低,但差異不顯著。與模型組相比,灌胃不同濃度的茶黃素均能顯著降低高尿酸血癥小鼠的血清ALT含量(P<0.05);灌胃200、800 mg/kg茶黃素能極顯著降低高尿酸血癥小鼠的血清AST含量(P<0.01),灌胃400 mg/kg茶黃素對高尿酸血癥小鼠的血清AST含量沒有顯著性影響。灌胃400、800 mg/kg茶褐素的小鼠血清ALT含量極顯著升高(P<0.01),小鼠血清AST含量顯著升高(P<0.05);灌胃200 mg/kg茶褐素的高尿酸血癥小鼠血清ALT含量升高,血清AST含量降低,但均無顯著性差異。可以看出,茶黃素對小鼠的肝臟損傷有改善作用,而茶褐素的效果不理想。

圖6 茶黃素、茶褐素對HUA小鼠 血清腺苷酸脫氫酶、肌酐含量的影響Fig.6 Effect of TF and TB on serum ALT,AST contents of HUA mice

2.7 對HUA小鼠臟器系數(shù)的影響

與正常組相比,模型組小鼠的心、肝、肺、腎器官重量均有升高,臟器系數(shù)也均大于正常組,說明喂食特制飼料能使慢性高尿酸血癥小鼠臟器變大,對臟器有不良影響(見表2)。

表3 不同濃度的茶黃素、茶褐素對HUA小鼠臟器重量和臟器系數(shù)的影響(n=6)Table 3 Effects of different concentrations of TF and TB on organ weight and organ coefficient in HUA mice(n=6)

灌胃不同濃度的茶黃素能降低小鼠的心臟、肝臟重量。其中,灌胃400 mg/kg茶黃素組的小鼠心臟重量與正常組最接近,灌胃800 mg/kg茶黃素組的小鼠肺臟重量與正常組最接近,說明茶黃素能夠適當(dāng)保護(hù)HUA小鼠的心、肺。

灌胃不同濃度的茶褐素能降低小鼠的肝臟重量,降低肝臟系數(shù)。200 mg/kg茶褐素組的小鼠心臟重量與正常組最接近,臟器系數(shù)也相同,說明茶褐素能適當(dāng)保護(hù)高尿酸血癥小鼠的心臟。陽性組的小鼠臟器重量均低于模型組,與正常組相近,說明API能適當(dāng)保護(hù)HUA小鼠的臟器。

3 結(jié)論與討論

本實(shí)驗(yàn)通過酵母粉、海魚粉、蛋黃粉等多種物質(zhì)配制成的特制飼料飼喂小鼠建立新慢性高尿酸血癥小鼠模型,研究茶黃素和茶褐素對HUA小鼠的降尿酸作用。研究發(fā)現(xiàn),茶黃素對新慢性高尿酸血癥小鼠的尿酸含量有明顯降低作用,且不同濃度的茶黃素對高尿酸血癥小鼠的降尿酸作用效果表現(xiàn)為:800 mg/kg茶黃素>400 mg/kg茶黃素>200 mg/kg茶黃素。

與空白對照組相比,這種慢性高尿酸血癥小鼠模型能使GLU含量顯著降低;這與宋春蕾等[21]結(jié)果尿酸與血糖之間存在的正相關(guān)關(guān)系有不同,其原因有待進(jìn)一步的研究探索。通過灌胃不同的茶葉天然活性成分,小鼠的GLU含量與模型組相比能顯著上升,但與空白對照組相比,各組小鼠的GLU含量總體均有降低。說明灌胃不同茶葉天然活性成分對正常小鼠的GLU含量有降低作用。與模型組相比,茶褐素對新慢性高尿酸血癥小鼠的尿酸含量沒有降低作用。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)高濃度的茶黃素對喂食特制飼料造成的高尿酸血癥小鼠有顯著降低尿酸含量的作用,同時(shí)還能顯著降低血清AST、ADA、TG含量;茶褐素對高尿酸血癥小鼠的血清CRE含量有顯著升高作用,灌胃400、800 mg/kg對高尿酸血癥小鼠的ALT、TG含量有還能顯著升高小鼠的血清ADA含量;高尿酸血癥小鼠的體重;二者均有一定的保護(hù)小鼠心、肺的作用。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果的變化趨勢推測,低于200 mg/kg茶褐素可能有一定作用,但該推測有待于進(jìn)一步研究。此外,實(shí)驗(yàn)過程中有多組小鼠的毛色與正常組相比較灰黃暗淡,解剖過程中發(fā)現(xiàn)1例小鼠的肝器官癌變,有可能是喂食特制飼料引起對體內(nèi)蛋白合成和基礎(chǔ)代謝的影響。關(guān)于茶黃素和茶褐素對體內(nèi)蛋白合成和基礎(chǔ)代謝是否有一定的影響,茶黃素、茶褐素對尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因表達(dá)量的變化是否有影響,還有待進(jìn)一步的研究。關(guān)于茶黃素的保健功效是今后茶葉天然活性成分的研究重點(diǎn)之一,本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)給小鼠灌胃茶黃素能降低其尿酸含量,為茶黃素被用于開發(fā)新的降尿酸保健品或輔助產(chǎn)品提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和研究方向。