趙培強，董四君

1. 中國科學(xué)院城市環(huán)境研究所，中國科學(xué)院城市環(huán)境與健康重點實驗室，廈門361021 2. 中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049

自工業(yè)革命以來，一系列生態(tài)環(huán)境問題不斷地威脅著人類和其他生物的生存與健康。在保護生態(tài)系統(tǒng)安全方面，世界各國的科學(xué)家們付出了巨大努力，在這個過程中，生態(tài)毒理學(xué)作為生態(tài)學(xué)、環(huán)境科學(xué)和毒理學(xué)等學(xué)科交叉融合的一門綜合學(xué)科應(yīng)運而生?！吧鷳B(tài)毒理學(xué)”(Ecotoxicology)一詞是1969年6月由法國科學(xué)家薩豪特(Thuhaut R.)在一次國際會議上首次提出的[1]。有學(xué)者認為，生態(tài)毒理學(xué)是通過研究化合物對環(huán)境中生物的影響，從而最終實現(xiàn)保護生態(tài)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能的目的[2]。生態(tài)毒理學(xué)作為毒理學(xué)的分支，具有廣泛的研究領(lǐng)域，從生態(tài)系統(tǒng)角度可以分為大氣生態(tài)毒理學(xué)、土壤生態(tài)毒理學(xué)、淡水生態(tài)毒理學(xué)和河口與海洋生態(tài)毒理學(xué)等。生態(tài)毒理學(xué)研究對象主要是非人類生物，在物種豐富的自然界，選擇合適的研究對象至關(guān)重要。在生態(tài)毒理學(xué)研究中，一般選擇可以反映不同營養(yǎng)級特征的多個物種或具有代表性的原生物種作為實驗動物[3]。目前，在生態(tài)毒理學(xué)研究中常用實驗生物有很多，如爬行動物中的蜥蜴[4]，魚類中的斑馬魚[5-7]、青鳉魚[8]，軟體動物中的河蜆[9]，節(jié)肢動物中的枝角類[10]，環(huán)節(jié)動物中的蚯蚓[11]，線蟲動物中的秀麗隱桿線蟲[12]等。已有綜述類文章就上述各種生物在生態(tài)毒理學(xué)中的研究進展進行了論述。

鹵蟲屬(Artemia)生物又名豐年蝦(brine shrimp)，作為基礎(chǔ)研究的實驗動物已被廣泛應(yīng)用于水生生物學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、遺傳學(xué)、生理學(xué)、毒理學(xué)、放射生物學(xué)和分子生物學(xué)等領(lǐng)域的研究[3,13]。1956年，Michael等[14]在Science雜志上提出“由于鹵蟲對污染物的高度敏感性及其卵可以長期保存等特點，使其成為生物檢測中很好的實驗生物”。此后，有多位學(xué)者就鹵蟲的生物學(xué)特征[15]、致死實驗[16]及其在生物學(xué)中的應(yīng)用[17]等方面進行了綜合論述。1987年，Sorgeloos等[18]就鹵蟲在毒理學(xué)中的研究與應(yīng)用進行綜述，其中，將鹵蟲在水生毒理學(xué)中的研究整理成為了獨立章節(jié)。2006年，Nunes等[3]就鹵蟲在生態(tài)毒理實驗中的應(yīng)用進行了綜述。但是，由于學(xué)者們對生態(tài)毒理學(xué)與環(huán)境毒理學(xué)的理解不一致，導(dǎo)致文獻中所論述的部分研究內(nèi)容缺乏明確的生態(tài)毒理學(xué)意義。2006年，孟紫強[19]提出7條標準以區(qū)分環(huán)境毒理學(xué)與生態(tài)毒理學(xué)，為研究人員提供了參考。他主要從研究對象的不同、研究目的的差異、實驗動物種類及來源、研究結(jié)果是否最終涉及對人類的影響等方面闡述了兩者差異。自這7條標準提出至今，生態(tài)毒理學(xué)又已經(jīng)過了十幾年的發(fā)展。在此期間，隨著實驗方法與檢測技術(shù)的不斷完善與進步，鹵蟲在生態(tài)毒理學(xué)中的研究又有一些新的內(nèi)容和成果。鑒于上述情況，本文依托Web of Science、中國知網(wǎng)等數(shù)據(jù)庫，通過文獻精準檢索、深入閱讀，從鹵蟲在毒理學(xué)中的研究入手，分析實驗設(shè)計初衷與目的，篩選出涉及生態(tài)效應(yīng)的相關(guān)文獻，將涉及鹵蟲在水生生態(tài)毒理學(xué)研究的相關(guān)文章歸納總結(jié)。從物種特征、優(yōu)缺點與應(yīng)用；孵化飼養(yǎng)標準與質(zhì)量控制；實驗類型與暴露方式；主要關(guān)注指標與研究目的；存在問題與展望5個方面展開論述，為相關(guān)領(lǐng)域的學(xué)者和研究人員快速了解該研究方向提供參考。

1 鹵蟲屬的生物學(xué)特征、優(yōu)缺點及應(yīng)用(Species characteristics of Artemia, its advantages and limitations in experiments and testing areas)

鹵蟲屬(Artemia)為甲殼動物亞門(Crustacea)、鰓足綱(Branchiopoda)、無甲目(Anostaca)、鹵蟲科(Artemidae: Branchinectidae)唯一的屬。因此，該屬生物統(tǒng)稱為鹵蟲。其發(fā)育過程包括：卵、無節(jié)幼蟲、后無節(jié)幼蟲、擬成蟲和成蟲5個階段。卵在適宜溫度、鹽度下，大約18～30 h孵化為無節(jié)幼蟲，無節(jié)幼蟲到性成熟一般需要8 d。鹵蟲這一特點使其成為實驗室條件下研究多世代遺傳毒性效應(yīng)的理想物種[20]。成蟲體長0.7～1.5 cm，體節(jié)分明，分為頭、胸和腹3個部分[15]。鹵蟲具有2種生殖類型：孤雌生殖和兩性生殖。不同生殖類型主要由種的特性決定[21]，Sukumaran和Grant[20]研究了不同生殖類型的2種鹵蟲(有性生殖種Artemiafranciscana和孤雌生殖種Artemiaparthenogenetica)，對化學(xué)誘變劑的毒性效應(yīng)及其子代在生態(tài)風(fēng)險預(yù)測中的敏感性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，孤雌生殖種Artemiaparthenogenetica子代在化學(xué)誘變劑影響下出現(xiàn)DNA損傷的概率更大，該物種更適合生態(tài)風(fēng)險預(yù)測。鹵蟲具有2種生殖方式，卵胎生和卵生。其中，卵生方式又有2種卵產(chǎn)生，非滯育卵和滯育卵[21]。滯育卵可長期保存，這對該物種適應(yīng)惡劣條件，保持物種延續(xù)具有重要意義。目前，很多學(xué)者以滯育卵為實驗材料研究環(huán)境中化合物對孵化率的影響，從而預(yù)測環(huán)境中化合物對鹵蟲種群可能產(chǎn)生的生態(tài)風(fēng)險。例如：Migliore等[22]研究了多種抗生素對鹵蟲孵化率的影響，并評估了集約化養(yǎng)殖中使用抗生素可能造成的環(huán)境風(fēng)險；Arulvasu等[23]研究了納米銀對鹵蟲孵化率的影響，驗證了納米銀在mmol·L-1濃度水平下即可對鹵蟲孵化率產(chǎn)生影響；Sheppard等[24]模擬原油泄露后水體中生物降解過程，并以鹵蟲孵化率作為評估指標之一對水體的生態(tài)風(fēng)險進行評估。

初孵化的無節(jié)幼蟲自身貯存一定量的卵黃，具有很高的營養(yǎng)價值，是很好的生物餌料[15]，同時也是研究食物鏈傳遞中重要的被捕食生物。利用該特點開展的研究很多。Perez和Wallace[25]研究了不同濃度污染物暴露下草蝦對鹵蟲的捕食成功率。也有學(xué)者研究受污染的鹵蟲被捕食者進食后的毒性效應(yīng)[26-27]。Xu和Wang[28]對比魚類在不同暴露條件(水相與食物相)下對重金屬的攝入率，他們以示蹤性同位素109Cd、75Se和65Zn標記鹵蟲后投喂給紅鯛魚(Lutjanusargentimaculatus)，以此作為食物相暴露途徑。Ajuzie[29]以進食利馬原甲藻(Prorocentrumlima)后的鹵蟲為餌料投喂鱸魚(Dicentrarchuslabrax)幼魚，觀察鱸魚的行為變化。鹵蟲為典型的濾食性動物，可攝食1～50 μm的顆粒物，對5～16 μm的顆粒攝入率更高[21]，張穎等[30]曾研究鹵蟲對湛江等鞭金藻(Isochrysiszhanjiangensis)、杜氏鹽生藻(Dunaliellasalina)和青島大扁藻(Platymonashelgolondica)的攝食率，發(fā)現(xiàn)鹵蟲對粒徑最小的等鞭金藻(藻體長度4.4～7.1 μm)攝食率最高。鹵蟲這一特點有利于研究水體中細顆粒物的生態(tài)毒性，如納米材料的生態(tài)毒性。目前，已有大量文獻報道納米材料(納米銀[31]、納米氧化銅[32]、納米二氧化鈦[33-34]和納米級微塑料[35]等)對鹵蟲的生態(tài)毒性。鹵蟲具有廣食性，除自然界中的細菌、微藻和小型原生動物外，其食物還包括人工生產(chǎn)的麥麩、豆粕、米糠和乳清粉等[21]。該特點除了利于鹵蟲適應(yīng)多變環(huán)境外也利于其實驗室飼養(yǎng)，這也是鹵蟲被大量用于實驗室研究的原因之一。

鹵蟲具有廣泛的地理分布，除南極洲外，全球多數(shù)地區(qū)的鹽田或鹽湖均有分布。鹵蟲對極端條件具有很強的適應(yīng)性，可以在其他生命形式不能生存的環(huán)境下存活[36]。由于其較強的環(huán)境適應(yīng)能力，有學(xué)者認為鹵蟲對一些環(huán)境化合物的敏感性較其他甲殼綱動物低，并就此進行了實驗驗證。Davoren和Fogarty[37]測試分析了代表水生生態(tài)系統(tǒng)3個營養(yǎng)級的7種生物在特定環(huán)境下的敏感性，結(jié)果表明，7種生物中鹵蟲的敏感性低于其中5種生物。Sanchez-Fortun和Barahona[38]對比了淡水與河口附近的4種小型浮游動物對菊酯類殺蟲劑的敏感性，發(fā)現(xiàn)鹵蟲的敏感性低于其他3種生物。Watson等[39]研究廢水中的含氯消毒劑副產(chǎn)物對一系列生物的毒性效應(yīng)時，發(fā)現(xiàn)該實驗中所有采樣點的含氯消毒劑副產(chǎn)物對鹵蟲無節(jié)幼蟲均未產(chǎn)生明顯的致死效應(yīng)，但對其孵化率產(chǎn)生影響。Zaleska-Radziwill等[40]、李娟英等[41]也曾獲得類似的結(jié)果。Schultz等[42]利用鹵蟲耐受性強的特點，對鹵蟲進行毒物包封，然后投喂魚類，研究毒物在食物鏈中的傳遞。雖然，鹵蟲對部分化合物敏感性差，但是研究鹵蟲的生態(tài)毒性對反映其生境或所處生態(tài)位的影響意義明顯。而且有學(xué)者認為鹵蟲是生態(tài)毒理學(xué)研究的代表性浮游動物[43-44]。

除上述研究外，關(guān)于鹵蟲在水生生態(tài)毒理學(xué)研究中的應(yīng)用還有很多，主要集中在以下幾個方面：(1)有機污染物的生態(tài)毒性研究，目前，使用鹵蟲研究其生態(tài)毒性的有機污染物包括各類殺蟲劑[38,45]、抗生素和藥物[40,46]、防污劑[47]等；(2)納米材料的毒性研究，其中，研究最多的是納米級金屬氧化物的生態(tài)毒性[31,48-49]，也有學(xué)者研究石墨烯納米顆粒[50]、納米級微塑料[51]的生態(tài)毒性；(3)污染物治理后的生態(tài)風(fēng)險評估，Watson等[39]以鹵蟲為研究對象，評估污水處理廠中氯化消毒后廢水的生態(tài)毒性，Redshaw等[52]研究生物競爭法治理水華后的水體對水生生物鹵蟲(Artemiasalina)、?？?Aiptasiapallida)的生態(tài)毒性，發(fā)現(xiàn)生物競爭法可以降低有毒藻類對水生生物的毒害；(4)特殊環(huán)境的生態(tài)風(fēng)險評估，有學(xué)者利用鹵蟲研究污水處理廠污泥浸出液的生態(tài)毒性[41]，還有學(xué)者利用鹵蟲研究海上鉆井平臺鉆井液的生態(tài)毒性[53]等。

2 孵化飼養(yǎng)標準與質(zhì)量控制(Breeding standards and quality control of experimental designs)

在動物實驗中，為保證實驗數(shù)據(jù)真實有效地反映實驗結(jié)果，實驗動物標準化管理至關(guān)重要。以鹵蟲為實驗生物開展的研究已有很多，隨著實驗設(shè)備與操作技術(shù)的優(yōu)化，對鹵蟲的孵化飼養(yǎng)環(huán)節(jié)已基本建立了一套標準方案。筆者通過文獻閱讀發(fā)現(xiàn)，鹵蟲孵化飼養(yǎng)標準方面的最詳細的資料是聯(lián)合國糧農(nóng)組織1996年發(fā)布的鹵蟲孵化培養(yǎng)方法[54]。其中，鹵蟲的孵化條件為：最佳孵化鹽度范圍為5‰～35‰，最佳孵化溫度范圍為25～28 ℃，最佳孵化pH應(yīng)>8，孵化時溶解氧濃度必須≥2 mg·L-1，最佳孵化溶解氧濃度為5 mg·L-1；如使用非商業(yè)滅菌后的蟲卵進行孵化時，應(yīng)使用次氯酸鹽進行消毒，以防止細菌感染。若進行完全滅菌可以用次氯酸鹽對蟲卵進行脫殼處理。孵化過程需要24 h持續(xù)關(guān)照，光照強度>2 000 lux，蟲卵濃度為2～5 g·L-1。鹵蟲的養(yǎng)殖條件為：最佳鹽度范圍為32‰～65‰，最常用鹽度為35‰；最佳溫度范圍為19～25 ℃；最佳pH范圍為6.5～8；最佳溶解氧濃度為2.5 mg·L-1，養(yǎng)殖密度為5 000～18 000只·L-1。飼養(yǎng)鹵蟲的主要餌料為微藻、干藻制品、酵母和細菌以及食品生產(chǎn)下腳料等。在投喂策略方面，以單細胞藻類為餌料時，如果沒有關(guān)于攝食率或最佳飼料水平的數(shù)據(jù)，可以嘗試以不同的藻類濃度投喂，通過顯微鏡觀察估計飼料水平。投喂充足的動物的腸道完全充滿，并排出緊實的糞便顆粒。喂食不足的動物的腸道是空的或沒有被填滿，通常排出松散的糞便顆粒。以干粉類食物投喂時，培養(yǎng)第1周時水體透明度應(yīng)保持在15～20 cm，之后，水體透明度保持在20～25 cm。在控制感染方面，非循環(huán)水培養(yǎng)系統(tǒng)可采用抗生素殺菌，如土霉素。循環(huán)水培養(yǎng)系統(tǒng)最佳滅菌方法是提高鹽度，最高可將鹽度提高到50‰～65‰。學(xué)者們在使用不同品種的鹵蟲開展實驗時，大都基于上述孵化飼養(yǎng)條件進行優(yōu)化。如Arulvasu等[23]選擇(30±1) ℃下飼養(yǎng)鹵蟲，而Bartolome和Sanchez-Fortun[55]則選擇在25 ℃、pH 8.6、光照1 000 lux下孵化蟲卵。這與不同品種鹵蟲對環(huán)境的耐受性不同有關(guān)。

在測試分析試驗中，除了規(guī)范操作外，質(zhì)量控制也非常重要，它可以將測試分析結(jié)果的誤差控制在允許限度內(nèi)，從而提高實驗的可靠性，對實驗結(jié)果的可行性具有重要有意義。在涉及鹵蟲的生態(tài)毒理學(xué)試驗中，不同類型的實驗存在不同的質(zhì)量控制。如在急性暴露實驗中，有學(xué)者認為死亡率<0.2為無毒性效應(yīng)[56]，有學(xué)者以10 s不移動作為個體死亡的標志[55]，在慢性暴露(14 d)的實驗中，有學(xué)者認為對照組的平均死亡率<20%則實驗有效[57]。也有學(xué)者并未設(shè)置質(zhì)量控制程序[33,58]。

3 實驗類型與暴露方式(Types of experimental designs and the style of Artemia’s exposure to toxic pollutants)

毒理學(xué)實驗中最常見的毒性作用類型是急性毒性作用和慢性毒性作用，特別是與小型無脊椎動物相關(guān)的生態(tài)毒性實驗。通常研究人員根據(jù)研究目的選擇毒性作用類型，如研究水華爆發(fā)后藻類的毒性時，通常研究藻毒素的急性毒性[59-60]，而研究一些環(huán)境化合物對物種生活史、繁殖策略和遺傳毒性時選擇研究化合物的慢性或長期毒性作用[20]。文獻檢索結(jié)果顯示，在以鹵蟲為研究對象的生態(tài)毒性實驗中，研究化合物對鹵蟲的急性毒性作用的文獻數(shù)量明顯多于慢性毒性作用的，這可能與化合物在水體中的穩(wěn)定性、鹵蟲的生命周期以及急性毒性實驗的可操作性等有關(guān)。鹵蟲的急性毒性試驗中，一般的暴露時間為24 h和48 h。有學(xué)者將鹵蟲的無節(jié)幼體暴露于4種有機磷農(nóng)藥中，濃度為半數(shù)致死濃度(LC50)，觀察暴露24 h后鹵蟲的運動行為(游泳速度)、形態(tài)差異和乙酰膽堿酯酶活性變化[61]。Toussaint等[62]在LC50下將鹵蟲暴露24 h，比較鹵蟲與其他浮游動物對11種化合物急性毒性的敏感性。Sabour等[63]將鹵蟲暴露于含藻毒素的水體中24 h后，以鹵蟲的LC50為標準，分析比較水華中易爆發(fā)的幾種藻類的急性毒性。以鹵蟲為研究對象的急性毒性試驗主要包括急性制動實驗、死亡率實驗、行為變化實驗和彗星實驗等。急性制動實驗是計算鹵蟲在毒物暴露24 h和48 h后靜止不動的鹵蟲的數(shù)量[64]。死亡率實驗通常是計算同一濃度毒物暴露24、48、72和96 h后鹵蟲的死亡率，以及不同濃度暴露24 h和48 h后群體中10%、20%和50%個體死亡(LC10、LC20和LC50)的致死濃度[33]。行為變化實驗主要是研究鹵蟲在毒物暴露24 h和48 h后，用一個由攝像機組成的游泳行為記錄儀記錄其游泳過程，主要記錄鹵蟲的游泳速度和路徑[47,65-66]。彗星實驗主要用于分析毒物暴露后生物DNA的受損情況[23]。

除急性毒性試驗外，也有部分學(xué)者關(guān)注環(huán)境化合物對鹵蟲的慢性毒性實驗。Bustos-Obregon和Vargas[43]研究鹵蟲暴露于有機磷酸酯二嗪農(nóng)的慢性毒性效應(yīng)，以確定鹵蟲是否可作為水生環(huán)境污染的指示指標。李娟英等[41]研究污水處理廠污泥浸出液對鹵蟲的慢性毒性作用，主要是關(guān)注浸出液對鹵蟲的生長抑制作用。Bergami等[57]對鹵蟲進行納米微塑料的長期暴露(14 d)實驗，考察其長期暴露下的死亡率。Schiavo等[49]研究納米氧化鋅對鹵蟲的慢性毒性效應(yīng)與時間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)納米氧化鋅對鹵蟲的毒性效應(yīng)與暴露時間成正相關(guān)。

毒性效應(yīng)除了與毒物接觸時間有關(guān)外，與暴露方式也有很大關(guān)系。不同的暴露方式產(chǎn)生的效應(yīng)存在差異，有學(xué)者進行了10項不同的試驗，對比不同的暴露條件下同一種納米銀懸浮液的毒性，發(fā)現(xiàn)納米材料危害的高質(zhì)量鑒定應(yīng)該基于統(tǒng)一的毒性測試方法及納米材料的特性[67]。鹵蟲在水生生態(tài)毒理學(xué)實驗中的暴露方式有很多，根據(jù)化合物種類分為單一毒物暴露和多種毒物暴露。Schiavo等[49]研究了單一毒物氧化鋅納米顆粒對鹵蟲的生態(tài)毒性。Sanchez等[68]研究了西班牙南部砷污染(NaAsO2)與鹵蟲生物入侵的關(guān)系。Rotini等[32]研究了氧化銅納米顆粒對鹵蟲等幾種海洋模式生物的生態(tài)毒性。類似研究還有很多，但是，在實驗室以外的環(huán)境中單一污染物單獨存在的可能性較小，所以更多的研究涉及多種毒物暴露。多種毒物暴露實驗主要分為：多種毒物分別暴露和混合物暴露。有學(xué)者以鹵蟲為研究對象采用分別暴露的方式研究地表水中抗菌藥物、雌激素和細胞抑制劑的生態(tài)風(fēng)險[40]。Minguez等[69]研究了48種藥物分別暴露對鹵蟲的毒性效應(yīng)，并根據(jù)公式計算出藥物混合物的生態(tài)毒性。當(dāng)2種或多種化合物同時存在于環(huán)境中時，研究其生態(tài)毒性必須以混合物暴露為暴露方式，如在農(nóng)田附近水體中除草劑和殺蟲劑往往同時存在，Van den Brink等[70]研究了殺蟲劑和除草劑混合物對鹵蟲的聯(lián)合毒性，Sabour等[63]研究了水華中藻類有毒成分(通常為多種化合物的混合物)對鹵蟲的生態(tài)毒性。

根據(jù)暴露生物種類劃分，暴露方式分為單一物種暴露和多物種暴露。每一項研究除了考慮研究意義外，其可行性也是一個重要因素。當(dāng)研究的化合物種類很多時，研究人員通常選擇代表性物種作為實驗對象。Migliore等[22]研究5種藥品進入環(huán)境后的生態(tài)風(fēng)險時，只選擇了代表性的鹵蟲作為研究對象。還有學(xué)者以鹵蟲為實驗動物研究了56種殺蟲劑的生態(tài)毒性[71]。另外，在研究特定環(huán)境下水體的生態(tài)風(fēng)險時，也會選擇代表性物種作為研究對象。Serrano等[72]研究了高鹽度水中有機污染物的分布和潛在生態(tài)風(fēng)險，他們通過分析不同采樣點采集的鹵蟲體內(nèi)污染物濃度，揭示了高鹽度水體中的代表性生物面臨的潛在威脅。動物生態(tài)學(xué)實驗中的研究對象往往是生態(tài)系統(tǒng)中的種群、群落和生態(tài)系統(tǒng)。所以，在生態(tài)毒理學(xué)的研究中，通常認為多物種或不同種群的暴露結(jié)果的生態(tài)學(xué)意義更加明顯。另外，隨著實驗室條件優(yōu)化、模式生物的開發(fā)和實驗設(shè)備的進步，越來越多的生態(tài)毒理學(xué)實驗以多物種暴露為主。目前，在水生生態(tài)毒理學(xué)的研究中大量實驗選擇以生物組系(bioassay battery)或多物種組成的微生態(tài)系統(tǒng)(Microcosm)為研究對象，研究環(huán)境化合物對整個生物組系或微生態(tài)系統(tǒng)的毒性效應(yīng)，從而更好地反映化合物對不同物種或不同營養(yǎng)級生物的影響，進一步推測化合物對生態(tài)系統(tǒng)的影響及化合物在生態(tài)系統(tǒng)中遷移轉(zhuǎn)化規(guī)律。涉及鹵蟲的多物種暴露實驗主要有對比暴露、生物組系暴露。目前，以鹵蟲為實驗動物進行的對比暴露實驗包括同一物種不同品種間的對比和不同營養(yǎng)級多個物種間的對比。有學(xué)者對比了乙基甲磺酸對于不同繁殖方式的2種鹵蟲的遺傳毒性，發(fā)現(xiàn)在相同毒物暴露下不同生殖策略的多代遺傳毒性存在差異[20]。還有研究比較了鹵蟲等5種水生生物分別暴露于多種化合物中的敏感性，結(jié)果表明，5個試驗物種對大多數(shù)化學(xué)物質(zhì)的中毒濃度排序相似[73]。生物組系暴露是生態(tài)毒理學(xué)中最常用的暴露方式。生物組系暴露為多種暴露試驗的組合，其主要實驗類型有發(fā)光細菌實驗、藻類毒性試驗、種子發(fā)芽實驗、浮游動物致死率實驗和幼魚中毒效應(yīng)實驗等[64,74]。其中，浮游動物致死率實驗中，常用物種之一就是鹵蟲。有研究以三角褐指藻的毒性試驗和鹵蟲的急性致死實驗為測試組系評估意大利近海鉆井活動產(chǎn)生的鉆井液可能對海洋生態(tài)系統(tǒng)產(chǎn)生的生態(tài)風(fēng)險[53]。通常認為實驗物種越多越能夠準確反映化合物對生態(tài)系統(tǒng)的毒性，因此，Davoren和Fogarty[37]、Libralato等[75]和Faimali等[59]多位學(xué)者都選擇了多物種暴露的生物組系暴露方式來評估環(huán)境中某種或某類化合物的生態(tài)毒性。由于不同生物對不同化合物的敏感性不同，生物組系暴露中選擇合適的生物很重要。有學(xué)者評估了幾種浮游動物的毒性測定方法的敏感性，發(fā)現(xiàn)藻類生物測定法比以鹵蟲為實驗動物的無脊椎動物死亡率測定法更敏感[76]。

暴露方式根據(jù)暴露場景分為原位暴露和實驗室暴露。由于環(huán)境要素復(fù)雜多變，原位暴露在生態(tài)毒理學(xué)研究中具有重要意義，原位暴露可以更好地反映化合物對研究區(qū)域生態(tài)系統(tǒng)的影響。Serrano等[72]采集野外原生鹵蟲并利用氣相色譜-高分辨率飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(GC-TOF MS)檢測其體內(nèi)的多種有機污染物，分析高鹽水生生態(tài)系統(tǒng)的有機污染模式，從而預(yù)測采樣區(qū)潛在生態(tài)風(fēng)險。Napiorkowski等[77]采集原位水體樣品養(yǎng)殖鹵蟲，預(yù)測采樣點水體的生態(tài)毒性。由于原位暴露的不可控因素較多，目前，利用鹵蟲開展的暴露實驗多以實驗室暴露為主。如上文論述的納米材料[31]、殺蟲劑[38,45]、抗生素[40,46]和重金屬[68]等生態(tài)毒性實驗均是在實驗室條件下開展的。

4 主要關(guān)注指標與研究目的(Key experimental indicators and research objective)

涉及鹵蟲的毒性試驗很多，不同實驗設(shè)計的研究目的不盡相同。通過化合物暴露，研究目的最終關(guān)系到人類健康的研究通常被認為是環(huán)境毒理學(xué)的范疇，以化合物對生態(tài)系統(tǒng)中的非人類生物的毒性效應(yīng)為指標，進而分析化合物對生態(tài)系統(tǒng)的影響的研究通常被認為是生態(tài)毒理學(xué)的范疇[19]。在眾多水生生態(tài)毒理學(xué)文獻中，以鹵蟲為實驗動物的研究中最常使用的實驗指標包括卵的孵化率、生長狀況、行為變化和死亡率等。Migliore等[22]以鹵蟲孵化率和死亡率為實驗指標分析了抗生素的生態(tài)毒性。Vismara[78]研究了甲醇、乙醇和正丙醇對鹵蟲孵化率的影響，并得出了不同化合物對鹵蟲的LC50，從而揭示3種化合物在環(huán)境中對鹵蟲生存繁衍的影響。以行為變化為實驗指標的研究主要是觀察化合物暴露后鹵蟲游泳行為的變化[65,79]和化合物對鹵蟲趨光性的抑制作用[55]等。除此之外，也有學(xué)者通過組織形態(tài)學(xué)變化來判斷化合物對鹵蟲的毒性效應(yīng)。Kachenton等[80]對納米鈦暴露后的鹵蟲進行組織切片觀察，發(fā)現(xiàn)鹵蟲整個腸道阻塞，上皮細胞形態(tài)異常，出現(xiàn)增生、絨毛變形、排列紊亂、嚴重水腫和壞死等現(xiàn)象。隨著儀器設(shè)備及試驗方法的不斷更新優(yōu)化，無脊椎動物在生態(tài)毒理學(xué)研究中被關(guān)注的指標越來越多，分子層面的一些指標也開始用于無脊椎動物的生態(tài)毒性研究。Venkateswara Rao等[61]利用彗星實驗研究納米銀顆粒對鹵蟲的DNA損傷，發(fā)現(xiàn)納米銀顆粒濃度與DNA損傷比例呈正相關(guān)關(guān)系[23]。還有學(xué)者關(guān)注了某些酶的活性變化，如乙酰膽堿酯酶，它可以將神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿快速水解成膽堿和乙酸鹽，在膽堿能突觸的神經(jīng)傳遞中起著重要作用。Varo等[81]對比有機磷農(nóng)藥對2種鹵蟲(入侵種與本地種)不同發(fā)育階段乙酰膽堿脂酶的抑制作用，發(fā)現(xiàn)入侵種的敏感性低于本地種。由于三磷酸腺苷(ATP)酶活性變化可以用來衡量化合物的毒性效應(yīng)，因此，有學(xué)者以ATP酶活性作為研究指標分析防污涂料對鹵蟲ATP酶活性的影響[82]。

在毒理學(xué)實驗中，設(shè)置合適的實驗指標可以直接了解化合物的毒性效應(yīng)。但是在生態(tài)毒理學(xué)實驗中，實驗指標除了明確毒性效應(yīng)外，還要明確化合物對生態(tài)系統(tǒng)中生物或生態(tài)系統(tǒng)的影響，以預(yù)測生態(tài)風(fēng)險。根據(jù)研究目的劃分，鹵蟲在水生生態(tài)毒理學(xué)中研究大致可以分為3類：(1)直接危害研究，即關(guān)注環(huán)境化合物對生物的直接毒害，此類研究很多，如前文提到的生長抑制實驗[41]、趨光性抑制實驗[55]、組織切片觀察實驗[80]、乙酰膽堿脂酶活性變化實驗[81]和ATP酶活性變化實驗[82]等；(2)間接效應(yīng)研究，間接效應(yīng)主要是通過毒性效應(yīng)對某些技術(shù)或方法進行生態(tài)評價，目前相關(guān)研究主要集中于修復(fù)效果的生態(tài)評價，其中，利用生物組系暴露實驗評價某種修復(fù)技術(shù)的修復(fù)效果的研究最多；Edmilson Souza Freitas等[83]以鹵蟲急性毒性試驗、植物發(fā)芽率與生長抑制實驗等評估使用鋁鹽和植物凝集素降低水體的濁度和毒性的效果；Ambrosio等[84]研究光芬頓反應(yīng)(Phtoto-Fenton reaction)降解水體中的生物柴油，并利用鹵蟲的致死試驗評估水體的修復(fù)效果；(3)潛在風(fēng)險研究，即關(guān)注化合物的潛在風(fēng)險，學(xué)者們開展的急性暴露實驗中所關(guān)注的死亡率多以預(yù)測化合物的潛在風(fēng)險為目的，Koutsaftis和Aoyama[85]利用急性毒性試驗研究化合物對鹵蟲的LC20、LC50和LC80值，并基于這3個濃度進一步研究溫度和鹽度對鹵蟲死亡率的影響，從而更好地評估化合物的潛在生態(tài)風(fēng)險；Rotini等[32]和Sibila等[58]研究不同濃度梯度暴露對鹵蟲的LC50，其目的也是預(yù)測化合物的潛在毒性效應(yīng)；Niu等[86]利用微囊藻毒素對鹵蟲等水生生物的急性毒性數(shù)據(jù)構(gòu)建物種敏感性分布模型，從而預(yù)測海河上游微囊藻毒素的生態(tài)風(fēng)險；還有學(xué)者研究化合物與鹵蟲生物入侵的關(guān)系，Sanchez等[68]從急性致死率實驗結(jié)果推測出砷污染抑制了鹵蟲在西班牙南部的生物入侵現(xiàn)象。

5 存在問題與展望(Existing limitations and future prospects)

鹵蟲生命周期短且分布廣泛，其滯育卵可長期保存并在適宜條件下具有高孵化率，因此，鹵蟲在水生生態(tài)毒理學(xué)研究中得到較好的應(yīng)用。但是，就目前的研究進展而言，還存在一些問題。由于其種間差異、繁殖方式差異和原生生境差異等，目前缺乏統(tǒng)一的實驗標準將鹵蟲在生態(tài)毒理學(xué)的應(yīng)用推廣到更廣泛的領(lǐng)域。例如，Kos等[31]提出，目前還沒有統(tǒng)一的檢測方案可以就不同化合物危害鑒定結(jié)果進行比較。他們通過比較不同實驗室間鹵蟲暴露于納米銀顆粒后的毒性效應(yīng)找到了化合物危害鑒定結(jié)果無法統(tǒng)一的部分原因，包括孵化條件和納米材料的形態(tài)等。也有學(xué)者嘗試利用鹵蟲建立生物富集模型，他們利用線性回歸模型和分段回歸模型計算，發(fā)現(xiàn)水體和鹵蟲組織中硒濃度之間存在顯著正相關(guān)關(guān)系，但當(dāng)水體中硒濃度<10 mg·L-1，模型的預(yù)測能力非常弱[87]。

新孵化的鹵蟲幼蟲被認為是多種實驗研究的優(yōu)良餌料[88-89]，有研究人員利用生物強化技術(shù)為養(yǎng)殖業(yè)的疾病治療和營養(yǎng)物質(zhì)強化提供支持[90-91]。在生態(tài)毒理學(xué)研究中，也有學(xué)者利用化合物浸染后的鹵蟲投喂捕食者，研究化合物在食物鏈中的傳遞[26-27]。但是，在同一環(huán)境下捕食者與被捕食者往往同時受到毒物威脅，之前的研究大多只關(guān)注捕食者進食后的毒性效應(yīng)，忽略了污染物對被捕食者的毒害作用及其對污染物的代謝。因此，要準確評估化合物的生態(tài)毒性應(yīng)該采用多營養(yǎng)級生物同時暴露的方法，并且深入分析不同營養(yǎng)級生物對化合物的代謝過程。

利用鹵蟲進行的毒性實驗中最多的是急性毒性實驗，多數(shù)急性暴露不以環(huán)境濃度為依據(jù)[56,58,73]，但是要更好地了解化合物對環(huán)境中生物的毒性效應(yīng)，必須基于環(huán)境濃度開展研究，同時，結(jié)合環(huán)境要素研究化合物的長期毒性效應(yīng)和遺傳毒性，從而對化合物的生態(tài)風(fēng)險進行全面的預(yù)測。另外，目前開展的實驗多以實驗室模擬為主，而自然環(huán)境復(fù)雜多變，原位暴露實驗的生態(tài)學(xué)意義更明顯。為了精準模擬環(huán)境要素或環(huán)境化合物對自然環(huán)境中生物的影響，今后在鹵蟲的生態(tài)毒理學(xué)實驗中應(yīng)加強不同生態(tài)位物種組合實驗，同時考慮環(huán)境因素與化合物對鹵蟲的聯(lián)合效應(yīng)。多物種組合暴露是當(dāng)前生態(tài)毒理學(xué)研究的主要趨勢，但是，生物組系中不同生物測試方法的敏感性存在差異，合理選擇生物測試方法有利于準確了解化合物的生態(tài)毒性。在生態(tài)毒性暴露實驗中，除生物組系暴露外，還有研究人員采用微生態(tài)系統(tǒng)暴露實驗分析化合物對復(fù)雜生態(tài)系統(tǒng)及生物多樣性的影響。微生態(tài)系統(tǒng)實驗是以多種生物共同組成的微生態(tài)系統(tǒng)為研究基礎(chǔ)，研究環(huán)境化合物對系統(tǒng)內(nèi)生物生理活動的影響[92]。其優(yōu)點是可以盡量還原自然環(huán)境中的生態(tài)毒性效應(yīng)和規(guī)律。之前有學(xué)者認為，大型水蚤是許多無脊椎動物中最敏感的一種，輪蟲最不敏感[93]。所以，目前的微生態(tài)系統(tǒng)研究中的浮游動物通常選擇這2種生物，選擇鹵蟲作為微生態(tài)系統(tǒng)組分進行生態(tài)毒理學(xué)研究的文獻很少。筆者認為，在研究以鹵蟲為代表性物種的水環(huán)境時，可以建立由鹵蟲和其他生物組成的微生態(tài)系統(tǒng)開展研究。

目前，大部分研究關(guān)注毒性效應(yīng)及其所反映的生態(tài)風(fēng)險，而就生物體而言，其中毒機制的研究有待深入。Nikinmaa和Rytkonen[94]在論述功能基因組學(xué)在水生毒理學(xué)中的應(yīng)用時，提出的“功能基因組研究對解決當(dāng)前環(huán)境問題具有重要意義”。關(guān)于鹵蟲在生態(tài)毒理學(xué)中的研究也應(yīng)該從基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)等研究方向出發(fā)，挖掘其耐受性及毒性效應(yīng)相關(guān)基因、蛋白和酶等，從而明確鹵蟲對外界干擾的調(diào)控機制。另外，隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，學(xué)者們已經(jīng)開始從事化合物對鹵蟲腸道微生物的干擾研究[95]，雖然，該研究方法尚未出現(xiàn)在鹵蟲相關(guān)的水生生態(tài)毒理學(xué)研究中，但未來可以將腸道微生物變化作為鹵蟲在水生生態(tài)毒性實驗中的一個指標。

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