馬思彥 王俊平 董麗娜 趙仲華

(1.山西醫(yī)科大學(xué)，太原 030012)(2.山西醫(yī)科大學(xué)附屬人民醫(yī)院消化內(nèi)科， 太原 030012)(3.山西醫(yī)科大學(xué)附屬人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，太原 030012)(4.山西大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院，太原 030012)

通常實(shí)驗(yàn)動物按照對微生物和寄生蟲控制程度分為無菌動物(GF)、悉生動物(GN)、無特定病原體動物(SPF)和普通級動物(CR)[1]。無菌動物是在其體內(nèi)檢測不出任何生命體，包括細(xì)菌、病毒、真菌、原生生物和寄生蟲等[2]。由于無菌動物體內(nèi)沒有任何微生物，因此可通過接種特定的一種或幾種微生物來控制動物體內(nèi)微生物群的存在。應(yīng)用無菌動物模型研究宿主腸道微生物，很大程度上避免了因宿主本身攜帶的微生物對實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成的影響,可提高實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確度、靈敏度和可重復(fù)性。

1 無菌動物種類

1.1 無菌斑馬魚

1942年，Baker等首次報道了無菌魚類的研究[3]。近年來，相對于小鼠模型遺傳操作和治療藥物規(guī)模篩選等繁瑣的方法，斑馬魚以其獨(dú)特的解剖生理特點(diǎn)成為生命科學(xué)研究的新對象。斑馬魚(zebrafish) 是一種雜食性淡水硬骨魚，廣泛用于發(fā)育生物學(xué)、生理學(xué)、遺傳學(xué)、毒理學(xué)以及生殖生物學(xué)的研究[4-6]。其體外受精、胚胎透明、胚胎發(fā)育同步且周期短、與哺乳動物腸道相似的組織和功能以及腸道易于取樣、測量等特點(diǎn)[7]，使其成為研究腸道微生物的理想動物模型。宿主與微生物相互作用的許多方面只能在整個生物體內(nèi)進(jìn)行研究，斑馬魚作為一種模式生物，在感染生物學(xué)和共生微生物與宿主相互作用的研究中起到了很大的作用[8]。

1.2 無菌鼠

小鼠在解剖、細(xì)胞生理及基因組同源性上與人類高度相似、且便于管理操作，因而被作為經(jīng)典的動物模型得到廣泛應(yīng)用[9]，并且人體腸道菌群一旦在無菌小鼠體內(nèi)成功定植, 就可以維持很長一段時間[10]。與小鼠相比，大鼠體型大、各項(xiàng)器官功能基本穩(wěn)定、生理學(xué)特征易于研究、且認(rèn)知行為等方面與人類更接近，是多種疾病的重要模式動物。

1.3 無菌雞

有研究表明，雞作為無菌動物模型，不僅其飼養(yǎng)過程簡單，進(jìn)化史及成長背景清楚，并且其在孵化之前就能判斷其父母代是否達(dá)無菌狀態(tài)[11]。

1.4 無菌豬

無菌豬在解剖、生理、生物化學(xué)、遺傳及營養(yǎng)代謝等方面與人類高度相似, 且相對于無菌小鼠可更加精確地用于腸道菌群與人類健康關(guān)系的研究[12]，因此，無菌豬模型被認(rèn)為是生物醫(yī)學(xué)研究與開發(fā)中的重要的轉(zhuǎn)化動物模型[13]。應(yīng)用無菌豬構(gòu)建動物模型，目前已在畜牧生產(chǎn)、生物學(xué)、免疫性疾病、食品營養(yǎng)、生物制劑[14-15]等方面顯示出廣泛的應(yīng)用前景。

2 無菌動物模型的構(gòu)建

無菌動物作為研究腸道菌群最適的動物模型，其建立需依賴完整的無菌培養(yǎng)系統(tǒng)，包括隔離器、傳遞窗、恒溫加熱裝置、照明燈、紫外殺菌燈和空氣過濾裝置等[9]。并且動物的飼養(yǎng)、實(shí)驗(yàn)等操作均需在嚴(yán)格無菌條件下進(jìn)行。

2.1 無菌斑馬魚

參照單穎等[9]的方法構(gòu)建無菌斑馬魚模型，取成年斑馬魚1～2對放入新鮮過濾水中，隔離雌、雄魚。次日更換新鮮過濾水，讓其自然產(chǎn)卵。立即收集魚卵并用一次性滅菌吸管將受精卵轉(zhuǎn)移至無菌培養(yǎng)皿中。經(jīng)無菌培養(yǎng)液清洗卵3次后加入適量無菌培養(yǎng)液，放入無菌培養(yǎng)隔離器，每12 h更換一次無菌液，直至標(biāo)本生長發(fā)育至實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，然后用一次性滅菌吸管采集斑馬魚周圍環(huán)境、斑馬魚體及胚胎培養(yǎng)液樣本，放入各種培養(yǎng)基中適宜溫度培養(yǎng)，涂片染色，檢測有無微生物的存在，明確是否符合無菌動物模型的要求。

2.2 無菌鼠

1959年成功培育出第一只無菌小鼠[2]。按照Al-Asmakh等[16]的方法，構(gòu)建無菌小鼠模型需保證小鼠胎兒期在母體內(nèi)即是無菌的。無菌剖腹摘除小鼠子宮囊，消毒后放置于無菌隔離器中，然后將囊內(nèi)的幼體轉(zhuǎn)移至無菌鼠體內(nèi)，之后在無菌隔離器內(nèi)生長，經(jīng)數(shù)代繁殖之后才可培育出無菌小鼠。無菌大鼠的培育主要由無菌剖腹產(chǎn)獲得，首先建立SD大鼠群，使其交配產(chǎn)生子代，子代由無菌剖宮取出至無菌隔離器中飼養(yǎng)，飼料、水一律要求嚴(yán)格無菌，特制灌胃器的使用有助于無菌大鼠哺乳成功[17]，最終檢測其生長環(huán)境及大鼠是否達(dá)到無菌動物的標(biāo)準(zhǔn)。

2.3 無菌雞

選取SPF(無特定病原體)雞蛋，無菌操作放入無菌孵化器中孵化，孵化的子代在無菌隔離器中飼養(yǎng)，飼料均經(jīng)高壓蒸汽消毒后經(jīng)隔離器傳遞倉對接送入。待動物生長到實(shí)驗(yàn)要求的月齡數(shù)，檢查腸道(糞便)內(nèi)有無細(xì)菌存在，無病原微生物即無菌動物模型建立成功。

2.4 無菌豬

1895年柏林大學(xué)培育出世界上第一批無菌豬，這些無菌豬僅存活了13 d[16]。1960年Landy等[18]在無菌隔離裝置基礎(chǔ)上構(gòu)建了無菌實(shí)驗(yàn)室,通過子宮切除術(shù)獲得無菌豬。

3 GF動物在腸道菌群中的研究應(yīng)用

3.1 腸道菌群對機(jī)體生長發(fā)育的影響

動物腸道的生長發(fā)育直接影響宿主的生長和健康狀況，腸道微生物菌群的建立顯示了腸道菌群可能參與宿主腸道的發(fā)育[19]。在斑馬魚模型中，腸道微生物會影響機(jī)體的生長發(fā)育以及上皮再生和腸細(xì)胞形態(tài)[20]，若缺乏腸道微生物，幼魚腸的分化會停滯在某特定階段，同時引起其功能的改變，但此時引入微生物群落后，該現(xiàn)象可被逆轉(zhuǎn)[21-22]。Yossa 等[4]通過在魚飲食中添加抗生素抑制腸道微生物的生長來建立模型，發(fā)現(xiàn)斑馬魚出現(xiàn)生長減慢，死亡率升高等現(xiàn)象。腸道菌群還可影響腸道黏膜形態(tài)，Awad 等[23]通過實(shí)驗(yàn)對比，在飼糧中添加益生菌，可顯著增加35日齡肉雞空腸和回腸的絨毛高度。此外，無菌鼠和普通鼠相比，肝、腎組織的蛋白表達(dá)水平均有顯著變化，免疫系統(tǒng)也存在一定差異[16,24]。根據(jù)腸-腦軸學(xué)說，微生物還被證明可以調(diào)節(jié)大腦的功能和發(fā)育。如，在無菌小鼠的大腦中觀察到前額葉皮層神經(jīng)元的髓鞘增生及無菌小鼠杏仁核和海馬神經(jīng)元的樹突在形態(tài)學(xué)上不同于對照組等[25]，無菌小鼠的大腦表達(dá)有缺陷的小膠質(zhì)細(xì)胞，在微生物群落恢復(fù)到控制水平后，小膠質(zhì)細(xì)胞被部分拯救[26]。最近的一項(xiàng)研究中發(fā)現(xiàn)，無菌小鼠體內(nèi)接種與生長相關(guān)的嬰兒微生物群可影響神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細(xì)胞的發(fā)育[27]。

3.2 對器官功能的影響

微生物菌群的存在可能影響器官的發(fā)育，進(jìn)而改善功能。相比普通級小鼠，無菌鼠的肝臟體積和腸道總質(zhì)量更小，腸道固有層和結(jié)腸壁更薄，更為突出的是無菌鼠有巨大的盲腸[16]。酒精過量攝入可誘發(fā)無菌小鼠更加嚴(yán)重的肝臟損傷和更加明顯的肝脂肪變性[28]。Semova 等[29]研究發(fā)現(xiàn)，正常斑馬魚較無菌斑馬魚脂肪酸的吸收更多，且無菌動物腸道黏膜細(xì)胞具有較低的代謝更新率，而微生物群落可維持消化道的功能[20,22]。

3.3 單菌的功能

Neely等[30]使用不同的鏈球菌感染斑馬魚，包括化膿鏈球菌與海豚鏈球菌，獲得了細(xì)菌半數(shù)致死量和斑馬魚存活曲線等數(shù)據(jù)。Davis等[31]建立了海豚分枝桿菌感染斑馬魚的方法，造成肉芽腫病灶模型，并發(fā)現(xiàn)斑馬魚因感染途徑和接種劑量的不同引發(fā)了不同程度的病變。有報道[32]無菌小鼠體內(nèi)接種多形擬桿菌及史氏甲烷短桿菌時，果聚糖的發(fā)酵增加，桿菌的代謝產(chǎn)物增多，從而改善宿主的腸道功能。

3.4 與疾病的關(guān)系

Lee等[33]比較了無菌條件下飼養(yǎng)的小鼠與常規(guī)條件下飼養(yǎng)的小鼠后發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)明顯減弱。許多研究表明帕金森病的微生物群發(fā)生了改變[34-36]。Yano等[37]發(fā)現(xiàn)一個由20種產(chǎn)芽孢細(xì)菌組成的微生物組可以增加無菌小鼠機(jī)體血清素的產(chǎn)生水平,而這種外周血清素的水平和多種疾病的發(fā)生有關(guān),如腸易激綜合征、心血管疾病等。最近一項(xiàng)針對首發(fā)精神疾病的研究，其中發(fā)現(xiàn)乳酸菌和雙歧桿菌的流行率與健康年齡匹配的對照組相比有所降低[38]。同時，動物模型也提示了腸道微生物在焦慮和創(chuàng)傷相關(guān)疾病中的作用[39]。

3.5 影響菌群的因素

Zeng等[40]以無菌小鼠為基礎(chǔ)構(gòu)建人源菌群(HFA) 動物模型，發(fā)現(xiàn)腸道雙歧桿菌計數(shù)隨年齡增長而增加，而乳酸桿菌計數(shù)隨年齡增長而減少，表明年齡和應(yīng)變影響HFA小鼠模型中的腸道微生物區(qū)系。

3.6 研究趨勢

斑馬魚作為一種重要的脊椎動物模型，在藥物篩選與遺傳研究方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢。用無菌小鼠研究約氏乳桿菌、長雙歧桿菌及大腸桿菌的動態(tài)變化及相互作用，結(jié)果提示細(xì)菌間的相互作用系統(tǒng)可能為研究復(fù)雜微生態(tài)系統(tǒng)基本規(guī)律提供基本法則[41]。Suárez等[42]研究發(fā)現(xiàn)，無菌小鼠機(jī)體中存在高水平的特定細(xì)胞因子,而抑制這種特殊信號或許會損傷抗生素誘導(dǎo)的皮下脂肪褐變過程、抑制腸道菌群剔除小鼠的葡萄糖表型,有助于開發(fā)治療肥胖等疾病的新型療法。與小鼠和人相比，小型豬具有豐富的上皮內(nèi)γδT細(xì)胞，較高數(shù)量的γδT細(xì)胞受體能夠建立有效模型用于研究這些細(xì)胞如何快速地作用于腸道細(xì)菌抗原[13]。腸道菌群相關(guān)的健康研究以及潛在的器官移植供體仍是無菌豬作為模型動物的發(fā)展趨勢和研究方向，從而為動物和人類健康提供認(rèn)識和治療疾病的基礎(chǔ)。

3.7 目前存在的問題

就現(xiàn)有的研究成果看，鼠模型中仍存一些問題：①小鼠獨(dú)特的生理、解剖結(jié)構(gòu)和行為(如吞咽)難免會影響微生物群落。②在人體中沒有發(fā)現(xiàn)幾種在小鼠腸道中定居的細(xì)菌[9]。③無菌小鼠屬于嚙齒類動物, 與人體還存在非常大的差異, 用無菌小鼠模型模擬人體腸道菌群受到質(zhì)疑[12]，因此在應(yīng)用于人類時可能受限。在構(gòu)建無菌大鼠的模型中，動物的喂養(yǎng)、食物的成分等也是造模的關(guān)鍵及面臨的問題。相對于小鼠模型，斑馬魚仍存在與人類親疏關(guān)系較遠(yuǎn)，技術(shù)手段相對積累少等問題。由于品種不同，豬的大小和特征可能存在很大差異，同時，飼養(yǎng)時間、條件、食物的選擇都是無菌豬、無菌雞需考慮的問題。

4 小結(jié)

沒有任何一種動物可以恰當(dāng)?shù)胤先梭w所有的參數(shù)，只有熟悉可用的多種動物模型，才能根據(jù)其解剖學(xué)、生理學(xué)、代謝反應(yīng)、遺傳免疫等來選擇符合特定研究的模式動物[13]。

通過無菌動物研究腸道微生物作用，更深入地了解常見腸道菌群對宿主生長發(fā)育、調(diào)節(jié)免疫、新陳代謝、生理遺傳、疾病、行為等的影響，促進(jìn)對疾病的認(rèn)識，進(jìn)而為人類健康提供新的依據(jù)和思路。