謝美娜 李 晶 楊利霞 王云澤 樊立濤 楊國峰 徐蘭舉

(河北愛能生物科技股份有限公司，石家莊 050092)

皮膚是人體最大最重要的屏障性器官，主要起到保護和維持機體內環(huán)境的作用[1]。深II度以下中小面積燒燙傷是最常見的皮膚創(chuàng)傷性疾病，早期削痂，及時封閉創(chuàng)面是減輕患者疼痛提高治療效果最關鍵、最有效的措施之一[2-4]。燒傷創(chuàng)面敷料封閉創(chuàng)面可抑制或減少創(chuàng)面微生物滋生引起的感染，維持創(chuàng)面濕潤環(huán)境，保護和促進創(chuàng)面肉芽組織生長。但傳統(tǒng)敷料因無法保持創(chuàng)面濕潤，容易感染，且與肉芽組織粘連會造成創(chuàng)面二次傷害等原因，在臨床應中逐漸被天然敷料、藥用敷料、組織工程類敷料等新型敷料取代[5-7]。

脫細胞生物敷料是近年來發(fā)展最為迅速的天然敷料之一，它源于動物真皮組織，在制備過程中已經除去了細胞成分等免疫原性物質，生物安全性好[8]；保留天然細胞外基質結構，膜片厚度適中，柔軟度和粘附性好，在燒燙傷治療中，可有效貼附于創(chuàng)面，即可以起到皮膚的部分屏障功能，透氣保濕，又形成相對密封的內環(huán)境，減少創(chuàng)面與外環(huán)境的接觸，降低或減少創(chuàng)面二次感染風險、從而最大限度地保護間生態(tài)組織及殘存的皮膚組織[6,9]；脫細胞生物膜主要成分為膠原蛋白，在體液中酶的作用下，可能會分解出氨基酸等營養(yǎng)物質，這可能在一定程度上促進創(chuàng)面修復細胞遷移、粘附、分化和增殖等，從而明顯加速創(chuàng)面愈合[4,10]。本文通過動物實驗，對比觀察脫細胞生物敷料和傳統(tǒng)敷料在治療深II度燙傷創(chuàng)面的愈合情況和病理進程，說明脫細胞生物敷料對促進皮膚損傷創(chuàng)面愈合作用的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、飼養(yǎng)環(huán)境

巴馬實驗用小型豬，普通級24只，雌雄不限，6月齡，體質量(15±3)kg，飼養(yǎng)環(huán)境為室溫，濕度40%～70%，正常晝夜[11-12]。飼養(yǎng)方式為單籠飼養(yǎng)，飼養(yǎng)籠具為鍍鋅鋼管籠。動物自由飲水，每頭每天分兩次供給其體質量5%的飼料。所有試驗動物由北京通和生泰比較醫(yī)學研究所提供，動物生產許可證號：SCXK(京)2015-0004。動物合格證號：NO.111017000000001

1.2 主要實驗儀器

Mettler-Toledo TCS-250型電子臺秤(梅特勒-托利多稱重設備系統(tǒng)有限公司，上海)；KD-2268型輪轉切片機(浙江省金華市科迪儀器設備公司，浙江)；KD-TS3D型生物組織脫水機(浙江省金華市科迪儀器設備公司，浙江)；KD-BMI石蠟包埋機(浙江省金華市科迪儀器設備公司，浙江)；KD-THIII型攤烤片機(浙江省金華市科迪儀器設備公司，浙江)；CX21型Olympus顯微鏡(奧林巴斯中國有限公司，北京);UV-5200PC型紫外分光光度計(上海元析儀器有限公司，上海)。

1.3 主要試劑耗材

規(guī)格5 cm×7 cm脫細胞生物敷料(河北愛能生物科技股份有限公司，河北)；脫脂棉紗布(曹縣華魯衛(wèi)生材料有限公司，山東)；戊巴比妥鈉(sigma，美國)；陸眠寧Ⅱ(吉林省華牧動物保健品有限公司，吉林)；蘇木素(北京索萊寶科技有限公司，北京)；伊紅染色液(北京索萊寶科技有限公司，北京)；氯胺T(天津博迪化工股份有限公司，天津)；L-羥脯氨酸對照品(中國藥品生物制品鑒定所，北京)。

1.4 實驗方法

1.4.1模型制備：24只巴馬實驗用小型豬，實驗前24 h禁食不禁水，3%戊巴比妥鈉(0.5 mL/kg體質量)劑量靜脈注射，進行誘導麻醉，3 min后靜脈注射陸眠寧Ⅱ(0.1 mL/kg)進行麻醉。麻醉后仰臥保定，機械去毛法去除背部豬毛，清潔后酒精消毒備皮。利用銅錠制備燙傷模型[13-15]，將4 cm×6 cm的銅錠在100 ℃的水浴鍋中預熱，待水浴鍋沸騰時，迅速將銅塊置于動物一側背部停留10 s，在小型豬背部中線兩側制作兩個深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面。

1.4.2實驗分組: 隨機分為兩組，每組12只。創(chuàng)面制備24 h后，削痂除去壞死表皮，試驗組使用脫細胞生物敷料覆蓋創(chuàng)面，空白對照組使用脫脂棉紗布覆蓋創(chuàng)面，分別再用無菌紗布固定包扎。分別于術后1、2、3、4周對各組進行觀察，每組每個時間點取材3只。

1.4.3觀察指標

1.4.3.1 臨床觀察：對試驗組和空白對照組進行創(chuàng)面修復情況的臨床觀察。包括創(chuàng)面色澤、滲出液、壞死組織、創(chuàng)面的結痂、被毛生長情況。

1.4.3.2 創(chuàng)面愈合率的測定： 參照Nagelschmidt法[16-17]計算創(chuàng)面愈合率：使用透明的稱量紙覆蓋在動物的背部創(chuàng)面，將創(chuàng)面邊緣和愈合創(chuàng)面邊緣描繪在透明的稱量紙上，剪去多余紙片，稱得原始創(chuàng)面紙片質量，剪下未愈合創(chuàng)面紙片，稱得未愈合紙片質量，計算創(chuàng)面愈合率。

創(chuàng)面愈合率(%)=(原始創(chuàng)面紙片質量-未愈合創(chuàng)面紙片質量)/原始創(chuàng)面紙片質量×100%。

1.4.3.3 組織病理學觀察：于術后1、2、3周和4周對試驗組和空白對照組的燙傷面進行病理組織學檢查。對所取得的創(chuàng)面組織用4%甲醛溶液固定，制成石蠟切片，HE染色，光鏡下觀察創(chuàng)面的修復情況，包括皮膚的修復、組織細胞的變化，并對創(chuàng)面的炎癥細胞浸潤情況進行半定量評價[18]。

表1 炎性細胞半定量組織學評價標準Table 1 Criteria for semi-quantitative histological evaluation of inflammatory cells

1.4.3.4 創(chuàng)面羥脯氨酸含量測定: 采用氯胺T法繪制羥脯氨酸標準曲線，并于術后1、2、3周和4周對試驗組和空白對照組的燙傷面進行羥脯氨酸含量測定[19-20]。

1.5 統(tǒng)計方法

2 結果

2.1 臨床觀察

整個手術觀察期間所有動物全部存活，且均無創(chuàng)面感染情況發(fā)生。試驗組術后創(chuàng)面干燥，2周后開始結痂，3周后開始脫痂，并且開始有被毛長出，4周后結痂與新生皮膚分離，被毛長出約2 mm；空白對照組術后1周創(chuàng)面表面局部有感染樣滲出，其余部位干燥，2周后創(chuàng)面開始結痂，4周后結痂與新生皮膚開始分離，逐漸有被毛長出。

2.2 創(chuàng)面愈合率

經觀察計算術后1周試驗組的創(chuàng)面愈合率為(23.67±1.03)%，而空白對照組為(22.50±1.04)%，兩組的創(chuàng)面愈合情況沒有顯著性差異(P>0.05)；術后2周、3周試驗組的創(chuàng)面愈合狀況明顯加快，且數(shù)值比較試驗組的創(chuàng)面愈合率顯著高于空白對照組(P<0.01)。術后4周 試驗組和空白對照組的創(chuàng)面恢復情況基本完成，兩組的創(chuàng)面愈合率數(shù)值比較無顯著性差異(P>0.05)。

表2 試驗組與空白對照組的創(chuàng)面愈合率比較Table 2 Comparison of wound healing rate between experimental group and blank control

經統(tǒng)計，試驗組的平均創(chuàng)面愈合時間為(20.83±0.75)d，空白對照組的平均愈合時間為(27.33±1.03)d，兩者比較具有顯著差異性(P<0.01)。試驗組的平均愈合時間比空白對照組約提前6 d。

2.3 組織病理學觀察

術后1周，試驗組燙傷部位局部表皮剝脫，其下真皮層凝固壞死，膠原纖維變性、腫脹、排列疏松，血管擴張淤血，大量炎癥細胞浸潤；空白對照組與試驗組病理組織學變化基本相同(圖1-1A，1B)。

術后2周，試驗組燙傷部位毛囊、汗腺上皮和成纖維細胞增生活躍，細胞肥大，汗腺管變實，發(fā)生痂下愈合，生成肉芽組織并向膠原纖維壞死處爬行，炎癥反應降低；而空白對照組毛囊和汗腺上皮已有增生，細胞、汗腺管變化與試驗組相同，且也已有痂下愈合(圖1-2A，2B)。

術后3周，試驗組燙傷部位肉芽組織可見新生毛細血管生成，殘存皮膚附件上皮細胞長出新生上皮，開始為上皮島，而后擴大，融合而使燙傷面愈合；空白對照組出現(xiàn)上皮再生，上皮島已產生(圖1-3A，3B)。

術后4周，試驗組燙傷部位的皮膚各層結構清晰，表皮透明層、顆粒細胞層、棘細胞層、基底層生長良好且表皮連續(xù)覆蓋于膠原纖維生成致密乳頭層上；空白對照組表皮細胞層已生長，但結構界線不夠清晰(圖1-4A，4B)。

同時本研究對各組燙傷創(chuàng)面不同時間點的病理學切片按照表1中炎性細胞半定量組織學評價標準[18]對其燙傷創(chuàng)面部位的炎癥細胞浸潤情況進行觀察統(tǒng)計，結果詳見表3。術后1、2和3周炎癥細胞浸潤情況試驗組的明顯輕于空白對照組，兩者比較具有顯著差異性(P<0.01)。術后4周炎癥細胞浸潤情況兩組無明顯差異(P>0.05)。

表3 燙傷創(chuàng)面的炎癥細胞浸潤情況統(tǒng)計(n=6)Table 3 Statistics of inflammatory cell infiltration in scalded wounds(n=6)

2.4 創(chuàng)面羥脯氨酸含量變化

創(chuàng)面愈合的一個主要表現(xiàn)是膠原蛋白的沉積和修復，膠原蛋白的主要成分是羥脯氨酸，其在膠原蛋白含量恒定，測定創(chuàng)面羥脯氨酸含量可以反映其膠原蛋白含量[21-22]。各組燙傷創(chuàng)面不同時間點的羥脯氨酸含量變化顯示，術后1周、2周實驗組羥脯氨酸含量顯著高于空白對照組，說明術后前兩周實驗組創(chuàng)面膠原蛋白合成顯著高于空白對照組；術后3周、4周實驗組羥脯氨酸含量趨于穩(wěn)定，說明創(chuàng)面已經完成修復；空白對照組術后4周羥脯氨酸含量與實驗組無顯著差異，兩組創(chuàng)面均已完成修復。綜上所述脫細胞生物敷料可以加快膠原蛋白合成促進創(chuàng)面愈合。

表4 創(chuàng)面羥脯氨酸含量變化Table 4 Hydroxyproline contents of

3 討論

中小面積Ⅱ度燒燙傷是臨床常見皮膚外科損傷，傷口常累及真皮深層，滲出液多，易發(fā)生感染，患者疼痛面積大時間長。臨床上Ⅱ度燒燙傷多采用納米銀+磺胺嘧啶銀霜覆蓋治療，治療過程中需要反復換藥，增加患者痛苦，易造成二次創(chuàng)傷，治療費用高、愈合時間長[23]。早期臨床醫(yī)生發(fā)現(xiàn)移植自體真皮組織可以抑制肉芽組織生長和疤痕生成，但自體皮膚來源有限，不適用于大面積皮膚燒傷患者[24]。Heck等[25]發(fā)現(xiàn)異體真皮和自體表皮復合移植于燒傷患者的切痂創(chuàng)面，可以減少自體皮膚用量，且移植效果比單純的皮片移植效果好，但是異體皮具有一定免疫原性，可導致免疫排斥反應。隨后，Wainwright[26]將異體皮膚經過脫細胞處理，降低免疫原性并成功用于燒傷創(chuàng)面并取得較好的效果。但是異體皮供體來源有限而且有傳播人類疾病的可能性，所以有研究者開始探索異種脫細胞材料在燒燙傷治療中的應用。齊順貞等[27]研究異種與異體脫細胞真皮基質與自體刃厚皮復合移植和自體中厚皮移植3種移植方式比較發(fā)現(xiàn)臨床上自體皮成活率、收縮率和瘢痕情況等效果相似，均可用于嚴重燒燙傷患者皮膚重建。楊紅明等[28]研究發(fā)現(xiàn)深Ⅱ度燒傷創(chuàng)面早期利用選擇性去細胞豬皮包扎可有效保護創(chuàng)面并促進創(chuàng)面愈合，其效果明顯優(yōu)于常規(guī)換藥療法。

脫細胞生物敷料經過漫長的發(fā)展過程，現(xiàn)在上市的脫細胞產品主要有異體皮脫細胞基質、豬源脫細胞基質、牛源脫細胞基質等[29]。LifeCell公司的Alloderm以及北京清源偉業(yè)生物組織工程科技有限公司的脫細胞異體真皮基質軟組織補片均是由新鮮人尸體皮制備的脫細胞基質，該類產品存在來源有限、保存條件苛刻、傳播人類疾病的可能性、價格昂貴的缺點，現(xiàn)在很少用于燒燙傷敷料多用于腹腔補片等[30-31]。牛源脫細胞基質上市主要有PriMatrixTM和SurgiMend?，其原材料為胎牛皮，該類產品原材料市場容量小、價格昂貴、具有海綿狀腦病毒感染風險[29]。本實驗中的敷料由河北愛能生物科技股份有限公司提供，是由豬真皮基質經過脫細胞和滅菌處理制備而成，主要成分是天然膠原蛋白，因不含細胞成分，所以生物相容性，免疫原性低[31-33]。該敷料原材料為豬皮，豬生長周期短、市場存欄量高，我公司按照相關法律法規(guī)從原材料源頭及生產每一個步驟進行控制，保障產品無病毒/傳染性病原體和極低的免疫原性[34]。

脫細胞生物敷料柔軟而富有彈性，可與創(chuàng)面緊密貼服，減少創(chuàng)面滲出。敷料的天然三維結構使其具有良好的透氣保濕功能，為創(chuàng)面修復提供適宜的微環(huán)境，在治療過程中，一般無需揭去創(chuàng)面基質敷料，不會對新生肉芽組織造成二次創(chuàng)傷，理論上，脫細胞敷料治療燒燙傷創(chuàng)面的效率要比傳統(tǒng)治療方法效率高。實際動物實驗也證明使用脫細胞生物敷料治療能夠有效地促進創(chuàng)面上皮化，比傳統(tǒng)的紗布處理方式的愈合時間至少縮短6 d，且在愈合過程不會出現(xiàn)排斥、壞死、滲血、感染等現(xiàn)象，炎癥細胞浸潤明顯輕于傳統(tǒng)的紗布處理方式。與用大鼠制備燙傷模型并以護創(chuàng)膜覆蓋治療為創(chuàng)面提供濕潤環(huán)境加速創(chuàng)面愈合提高創(chuàng)面愈合質量的研究結果一致[35]。同時與臨床上馮祥生等使用豬脫細胞真皮基質治療深Ⅱ度燒傷的結果一致，均證明了脫細胞生物敷料有助于保護剩余的真皮組織，促進上皮化，抑制疤痕的生成，加速創(chuàng)面愈合[36]。

脫細胞生物敷料治療燙傷創(chuàng)面主要分為3個階段，即炎癥階段、增生階段和重建階段[37-39]。術后創(chuàng)面處于炎癥階段，炎癥細胞主要包括中性粒細胞、巨噬細胞和淋巴細胞等。術后創(chuàng)面血小板聚集并促進趨化因子、生長因子、促凝因子等細胞因子。細胞因子和炎癥細胞按照一定規(guī)律協(xié)作促進創(chuàng)面愈合。術后1周時實驗組創(chuàng)面主要處于該階段，有大量炎癥細胞浸潤，創(chuàng)面開始愈合。創(chuàng)面愈合第二階段是增生階段，主要是修復細胞增殖、分化和肉芽組織形成。肉芽組織內積聚了大量的內皮細胞、成纖維細胞、生長因子等，是上皮化的支架。成纖維細胞產生足夠的膠原和細胞外基質成分使傷口逐漸縮小創(chuàng)面，血管內皮細胞和新生的毛細血管也不斷增殖遷移、融合并促進表皮再生。術后2到3周實驗組創(chuàng)面主要處于該階段，主要表現(xiàn)為成纖維細胞和毛細血管快速增殖、肉芽組織形成、創(chuàng)面上皮化，創(chuàng)面羥脯氨酸含量增高也說明創(chuàng)面膠原含量增高形成細胞外基質促進創(chuàng)面愈合。創(chuàng)面愈合第三階段為重建階段，主要是細胞外基質蛋白的沉積及重新分配與調整。皮膚中一些大分子，如膠原蛋白、纖維粘連蛋白、透明質酸等進行沉積形成骨架結構，便于其他細胞的遷移。脫細胞生物敷料治療燙傷創(chuàng)面的各個階段不是孤立的，而是相互重疊，相互交錯，在機體的調控下有序、完整地進行著。

脫細胞生物敷料生物相容性好，避免了多次換藥，能最大限度 地保護挽救間生態(tài)組織，可以降低超高代謝、應激反應、炎癥反應綜合征和燒傷感染的威脅, 使病程全過程穩(wěn)定，在燙傷創(chuàng)面修復過程中能夠有效促進創(chuàng)面的愈合過程、縮短愈合時間，且在治療過程中未觀察到炎癥加深、細菌感染、出血、動物死亡等不良反應，一定程度上說明該脫細胞生物敷料安全性和有效性良好，為燒傷提供一種較為理想的皮膚修復方式，也為進一步臨床試驗提供了理論支持和試驗依據(jù)。