張冬璇，王家龍，瞿晶田

（1.中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九八三醫(yī)院，天津 300142；2.中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院，北京 100053；3.天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，天津 300193）

杜仲是一味具有降壓作用的傳統(tǒng)中藥材，其發(fā)揮降壓作用的有效成分主要包括木質(zhì)素類、苯丙素類、環(huán)烯醚萜類和黃酮類化學(xué)成分[1-4]。所涉及的作用機(jī)制主要包括調(diào)節(jié)激素水平，改善內(nèi)皮功能，調(diào)節(jié)鈣離子通道開放等[5]。以往的研究證實，杜仲水提物和醇提物均具有舒張離體大鼠胸主動脈血管的作用，作用機(jī)制可能與促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞一氧化氮的產(chǎn)生與釋放相關(guān)[6]。桃葉珊瑚苷是一種存在于杜仲中的環(huán)烯醚萜類成分，具有舒張大鼠胸主動脈血管的作用[7]。本研究以大鼠胸主動脈環(huán)和心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞為研究對象，探討桃葉珊瑚苷舒張血管的作用及可能的作用機(jī)制。

1 藥品、試劑與儀器

桃葉珊瑚苷購于中國藥品生物制品檢定所；L-NAME、NaCl、KCl、CaCl2、KH2PO4、MgSO4、NaHCO3、α-D-Glucose 購于索萊寶生物科技有限公司；去甲腎上腺素、乙酰膽堿購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；胎牛血清、DMEM/F12 購于gibco 公司；MTT 增殖毒性試劑盒購于南京建成生物工程研究所；大鼠eNOS ELISA 檢測試劑盒購于上海康朗生物科技有限公司。Maclab AID 生物記錄軟件（澳大利亞Powerlab 公司），Radnoti 組織器官灌流系統(tǒng)（美國Powerlab 公司）。

2 研究方法

2.1 大鼠胸主動脈環(huán)實驗 將SD 大鼠（250～300 g）斷頭處死，迅速開胸，分離出胸主動脈，除去胸主動脈的周圍結(jié)締組織及脂肪組織，剪成4 mm 的血管環(huán)。用鉤子將各血管環(huán)懸掛于含有Krebs 試液（PH=7.4，37 ℃，持續(xù)充入5% CO2和95% O2）的組織器官灌流浴槽內(nèi)。應(yīng)用NE（10-6mol/L）刺激收縮各血管環(huán)，而后加入累積濃度的桃葉珊瑚苷（0.5，5，20 μmol/L），應(yīng)用Maclab AID生物記錄軟件對血管張力變化進(jìn)行檢測。Krebs 試液的組成：KCl 4.7 mmol/L，NaCl 118 mmol/L，KH2PO41.2 mmol/L，MgSO41.2 mmol/L，NaHCO325 mmol/L，D-Glucose 10 mmol/L；CaCl21.3 mmol/L。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將3～4 周齡SD 大鼠斷頸處死，用75%的乙醇浸泡大鼠5 min 后，移至超凈工作臺，打開胸腔，取出大鼠心臟。采用膠原酶-中性蛋白酶混合消化法分離大鼠心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞。細(xì)胞經(jīng)CD31/vWF 免疫熒光鑒定，純度可達(dá)90%以上。細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)用含體積分?jǐn)?shù)為1%青鏈霉素和10%的胎牛血清的DMEM/F12 培養(yǎng)基。

2.3 MTT 法檢測細(xì)胞活力 含有不同濃度桃葉珊瑚苷（0～20 μmol/L）DMEM/F12培養(yǎng)基作用細(xì)胞24 h，加入MTT 孵育2 h。吸去培養(yǎng)基，每孔加入150 μL DMSO，震蕩10 min，使得結(jié)晶物完全溶解，在590 nm下測定吸光度。

2.4 ELISA 法檢測eNOS 蛋白 含有不同濃度桃葉珊瑚苷（0.5，5，20 μmol/L）DMEM/F12培養(yǎng)基作用細(xì)胞24 h，ELISA 法對各孔細(xì)胞eNOS 蛋白進(jìn)行檢測。檢測按試劑盒說明書操作進(jìn)行，在450 nm 下測定吸光度。

3 結(jié)果

3.1 桃葉珊瑚苷血管舒張作用 與對照組相比，桃葉珊瑚苷（0.5，5，20 μmol/L）具有舒張內(nèi)皮完整（+E）大鼠離體胸主動脈血管的作用（P＜0.01）。去內(nèi)皮（-E）和L-NAME（100 μmol/L）均能夠使桃葉珊瑚苷（0.5，5，20 μmol/L）舒張血管的作用減弱（P＜0.01），（見圖1）。

圖1 桃葉珊瑚苷血管舒張作用研究

3.2 桃葉珊瑚苷對大鼠心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞活力的影響 不同終濃度的桃葉珊瑚苷（0～20 μmol/L）孵育大鼠心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞24 h。與對照組相比，桃葉珊瑚苷對其細(xì)胞活力沒有顯著影響。

3.3 桃葉珊瑚苷對大鼠心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞eNOS 蛋白表達(dá)的影響 桃葉珊瑚苷（20 μmol/L，孵育24 h）具有促進(jìn)大鼠心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞eNOS 蛋白表達(dá)的作用（P＜0.01），見圖2。

圖2 桃葉珊瑚苷對大鼠心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞eNOS 蛋白表達(dá)的影響

4 討論

藥物發(fā)揮對血管舒縮功能的直接調(diào)控作用主要涉及快速效應(yīng)和緩慢作用。快速效應(yīng)方面，藥物可以直接作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，通過調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞釋放舒縮因子（如NO，PGI2 等），發(fā)揮對血管舒縮功能的調(diào)控作用[8-11]。藥物還可以直接作用于血管平滑肌細(xì)胞，通過影響平滑肌細(xì)胞相關(guān)離體通道（如鈣離子通道，鉀離子通道等）的開放，發(fā)揮對血管舒縮功能的調(diào)控作用[12-15]。緩慢作用方面，藥物可以通過調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞舒縮因子的表達(dá)，以及平滑肌細(xì)胞相關(guān)離子通道的表達(dá)，發(fā)揮對血管舒縮功能的調(diào)控作用[16-17]。除此之外，病理狀態(tài)下，內(nèi)皮細(xì)胞與平滑肌細(xì)胞相關(guān)信號通路的改變亦與血管舒縮功能密切相關(guān)[18-19]。本研究發(fā)現(xiàn)桃葉珊瑚苷能夠快速地舒張大鼠離體胸主動脈血管，去除血管內(nèi)皮或加入一氧化氮合酶抑制劑L-NAME 均能夠抑制桃葉珊瑚苷舒張離體血管的作用；與對照組相比，桃葉珊瑚苷對去內(nèi)皮血管則未見明顯的舒張作用。除此之外，孵育大鼠心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞24 h，桃葉珊瑚苷具有促進(jìn)eNOS 蛋白表達(dá)的作用。

綜上所述，桃葉珊瑚苷對血管收縮舒張功能的調(diào)控具有快速作用及緩慢作用?？焖僮饔冒l(fā)面，桃葉珊瑚苷能夠通過內(nèi)皮依賴的NO 途徑發(fā)揮對血管的快速舒張作用；緩慢作用方面，桃葉珊瑚苷具有促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞eNOS 蛋白表達(dá)的作用。文獻(xiàn)報道，桃葉珊瑚苷可激活雌激素受體，其是否可通過雌激素受體發(fā)揮對血管舒縮功能的調(diào)控作用，需要更加深入的研究[20]。