李旭揚(yáng)，鄒佩琨，劉 輝，柯 瀟

（華東理工大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院，上海 200237）

納米孔電化學(xué)技術(shù)在1989年由David，George，Hagan在研究測(cè)定 DNA序列時(shí)首次被提出，1995年，首次申請(qǐng)納米孔電化學(xué)技術(shù)的專利。在2014年，MinlON作為一個(gè)利用納米孔技術(shù)測(cè)定DNA序列的儀器被公開，在2015年，該儀器被證實(shí)能夠完整地測(cè)出大腸桿菌基因組，準(zhǔn)確率達(dá)到98%以上。［1］

1 基本原理

納米孔電化學(xué)技術(shù)是以電解池為基礎(chǔ)，在一個(gè)電解池中放入正負(fù)兩個(gè)Ag／AgCl電極，在電解池中加入KCl溶液電解質(zhì)，在電壓的作用下，電解池中正負(fù)離子會(huì)分別往正負(fù)電極移動(dòng)。在充滿電解液的腔內(nèi)，納米級(jí)大小的小孔的絕緣防滲膜將整個(gè)電解池分成兩個(gè)區(qū)域，一側(cè)加入所要檢測(cè)的物質(zhì)，檢測(cè)的分子在電壓的作用下，會(huì)被納米孔道所捕獲，當(dāng)檢測(cè)的分子被納米孔道捕獲并通過孔道時(shí)，由于檢測(cè)的小分子的結(jié)構(gòu)、與其他離子不同，會(huì)瞬間改變孔道中的離子流，當(dāng)待測(cè)分子通過納米孔道之后，孔道中的離子流恢復(fù)成原先狀態(tài)，這時(shí)候一個(gè)完整的峰就會(huì)出現(xiàn)。

2 動(dòng)力學(xué)結(jié)合觀測(cè)反應(yīng)機(jī)理

2.1 二硫鍵與巰基的反應(yīng)

在2003年，Hagan Bayley課題組首次利用納米孔電化學(xué)檢測(cè)技術(shù)在單分子水平上在α-HL納米孔中實(shí)時(shí)觀測(cè)到了小分子與孔道之間的共價(jià)結(jié)合反應(yīng)［2］。通過含有α-HL納米孔的磷脂膜將DTT和DTNB2-分離并使它們擴(kuò)散到反應(yīng)區(qū)，在孔道中實(shí)時(shí)觀測(cè)到到兩種小分子中其中DTNB2-分子上的巰基與α-HL納米孔117位置上的Cys側(cè)鏈上的巰基結(jié)合形成二硫鍵，DTT上的巰基將DTNB2-與α-HL納米孔所形成的巰基打斷，自身與α-HL納米孔形成二硫鍵，之后DTT分子中另一個(gè)巰基將與α-HL納米孔所形成的二硫鍵打斷與自身形成二硫鍵這整個(gè)共價(jià)鍵結(jié)合與斷裂的過程，并且該反應(yīng)過程實(shí)現(xiàn)了多次循環(huán)，因此具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。并通過測(cè)量二硫蘇糖醇二硫化物還原過程中產(chǎn)生的短壽命中間產(chǎn)物（RSSCH2CH（OH）CH（OH）CH2SH，為硫代酯）的分解速率常數(shù)來證明該方法的實(shí)用性，在研究的過程中，將納米孔電化學(xué)檢測(cè)技術(shù)與動(dòng)力學(xué)理論相結(jié)合，通過納米孔電化學(xué)檢測(cè)技術(shù)成功捕捉到每個(gè)反應(yīng)步驟的電信號(hào)，再從動(dòng)力學(xué)的角度從每一步驟的反應(yīng)速率常數(shù)推導(dǎo)出每一個(gè)信號(hào)所代表的反應(yīng)過程中分子的結(jié)構(gòu)，兩者相結(jié)合，從而推導(dǎo)出整個(gè)反應(yīng)的反應(yīng)機(jī)理。在2012年。Hagan課題組在研究了巰基的連接與斷裂的基礎(chǔ)上利用α-HL納米孔，從單分子角度上觀測(cè)了RSNO類分子在α-HL孔內(nèi)，腔內(nèi)的巰基打斷了RSNO類分子中的硫氮鍵，使RSNO類分子中的硝基取代了腔內(nèi)的巰基上的氫原子，使硝基固定在了孔中，在此基礎(chǔ)上研究了硝酰二硫化物中間體RSN（O）SR-在反硝化過程中的壽命，研究了反硝化和S-亞硝基谷胱甘肽硫醇化之間的競爭，也研究了RSNO類分子與亞硝酸鹽之間的反應(yīng)［3］。

2.2 有機(jī)砷（III）化合物與硫醇的反應(yīng)

2003年Hagan Bayley課題組［4］利用突變的α-HLnm孔（一個(gè)突變的半胱氨酸殘基，取代了天然的蘇氨酸-117）在孔道內(nèi)實(shí)時(shí)觀測(cè)到了有機(jī)砷（iii）類化合物與硫醇的反應(yīng)。在實(shí)驗(yàn)中，有機(jī)砷化合物在溶液中在電壓的作用下被納米孔所捕獲，而硫醇則通過定點(diǎn)結(jié)合到溶血素蛋白孔的腔面上。通過納米孔檢測(cè)到了該反應(yīng)在單分子水平上的可逆共價(jià)鍵形成。從動(dòng)力學(xué)的角度去研究，推導(dǎo)出正逆向反應(yīng)的反應(yīng)速率常數(shù)，從而推導(dǎo)出了有機(jī)砷（iii）化合物與硫醇的反應(yīng)機(jī)理。2014年Hagan Bayley課題組［5］利用納米孔道技術(shù)，將砷的化合物與α-hemolysin孔腔中117位置半胱氨酸殘基上的巰基反應(yīng)，得到了兩個(gè)對(duì)映異構(gòu)體，再分別加入L-青霉胺與谷胱甘肽，揭示了他們會(huì)與異構(gòu)體發(fā)生取代反應(yīng)的過程以及過程中的手性轉(zhuǎn)化，在同時(shí)加入L-青霉胺與谷胱甘肽，研究通過得到的7種信號(hào)，在從動(dòng)力學(xué)角度，利用測(cè)得的正負(fù)反應(yīng)速率推出了7種信號(hào)所對(duì)應(yīng)的化合物，揭示了L-青霉胺與谷胱甘肽與異構(gòu)體發(fā)生反應(yīng)時(shí)的反應(yīng)過程以及手性轉(zhuǎn)化。在2015年的時(shí)候，Hagan課題組以有機(jī)砷（III）化合物與硫醇的反應(yīng)為基礎(chǔ)，將此反應(yīng)與動(dòng)力學(xué)相結(jié)合，應(yīng)用于分子機(jī)器領(lǐng)域，在α-HL孔道中構(gòu)建了一串由5個(gè)半胱氨酸殘基連接而成的立足點(diǎn)，由4-硫苯胂酸（SPAA）和2-（2-甲氧基乙氧基）乙硫醇（MEET）合成有機(jī)砷（III）分子SPAA-MEET2，在孔道中受到乙硫醇溶液的可逆性競爭配位時(shí)，可以在相鄰兩個(gè)立足點(diǎn)形成三元環(huán)狀態(tài)，并且配位解離過程是隨機(jī)的，故該分子可以在這一串立足點(diǎn)上隨機(jī)性的上下運(yùn)動(dòng)，有機(jī)砷（III）與可交換硫醇分子配體沿著5個(gè)立足點(diǎn)的軌跡的運(yùn)動(dòng)可以在一個(gè)蛋白質(zhì)納米反應(yīng)器中被連續(xù)監(jiān)測(cè)。［6］

3 總結(jié)

綜上所述，可以看出，在用納米孔電化學(xué)技術(shù)去觀測(cè)研究一個(gè)反應(yīng)的反應(yīng)機(jī)理時(shí)，在捕獲到反應(yīng)過程中的各個(gè)階段的信號(hào)后，需要從動(dòng)力學(xué)角度，從各個(gè)步驟的速率常數(shù)去推導(dǎo)整個(gè)反應(yīng)機(jī)理，在這幾十年來，納米孔電化學(xué)技術(shù)已經(jīng)逐步的從單純的檢測(cè)深入到去研究反應(yīng)機(jī)理，并再次基礎(chǔ)上將其應(yīng)用到研究手性轉(zhuǎn)化，分子機(jī)器與分子合成等領(lǐng)域。