冷春旭 鄭福余 趙北平 劉海英 王玉杰

（黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所 黑龍江省作物與家畜分子育種重點實驗室，哈爾濱 150028）

近年來，隨著我國社會經(jīng)濟(jì)的飛速發(fā)展和工業(yè)化進(jìn)程不斷推進(jìn)，土壤鹽堿化程度逐漸加劇，嚴(yán)重制約了糧食生產(chǎn)。土壤鹽堿化是指在不利的氣候、水文、地形和土壤質(zhì)地等自然條件下，易溶性鹽類在土壤中重新分配、過量累積和擴(kuò)散形成的一種環(huán)境地質(zhì)現(xiàn)象，不但造成耕地退化、土地荒漠化，擾亂生態(tài)系統(tǒng)而且嚴(yán)重制約和影響了農(nóng)業(yè)生產(chǎn)及經(jīng)濟(jì)發(fā)展［1］。截至2019年根據(jù)聯(lián)合國教科文組織（UNESCO）和糧農(nóng)組織（FAO）不完全統(tǒng)計，我國鹽堿地面積為0.99億hm2，約占全世界鹽堿地面積（9.54億hm2）的10.3%［2］，主要分布在東北松嫩平原、黃淮海平原、西北干旱半干旱區(qū)和濱海等地。隨著人口不斷增加、氣候異常頻發(fā)、工業(yè)污染加劇、灌溉和施肥方式不當(dāng)?shù)纫蛩赜绊?，我國土壤鹽堿化程度不斷加重，農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展受到嚴(yán)重的威脅［3］。

水稻作為一種中等鹽敏感作物常用來改良鹽堿地，提高土地利用效率。鹽堿地種植水稻不但可以通過灌水使土壤表層的鹽分逐漸下沉，連續(xù)種植3年后可進(jìn)行水旱輪作進(jìn)一步改良土壤結(jié)構(gòu)［4］，而且水稻在地下的根系具有分泌有機(jī)酸和吸收環(huán)境中鹽分的作用，可以改善土壤板結(jié)情況［5］，使土壤結(jié)構(gòu)變得疏松，提高土壤蓄水能力，避免發(fā)生次生鹽堿化［6］，與其他作物相比具有無可比擬的優(yōu)越性。因此，研究鹽堿脅迫對水稻的危害機(jī)制，對開發(fā)和利用鹽堿地具有重要的意義。

鹽堿脅迫根據(jù)土壤中陰離子的不同分為鹽脅迫（以NaCl等中性鹽為主）和堿脅迫（以Na2CO3和NaHCO3為主），二者均能對作物造成滲透脅迫和離子毒害，從而影響水稻的正常生長發(fā)育，但堿脅迫由于具有較高pH值，使水稻遭受鹽分和高pH值雙重?fù)p傷，傷害作用比鹽脅迫更為嚴(yán)重和復(fù)雜，而且水稻應(yīng)對兩種脅迫的機(jī)制也存在差異。國內(nèi)外有關(guān)水稻耐鹽堿研究主要集中在鹽脅迫，對堿脅迫下水稻體內(nèi)反應(yīng)機(jī)理和調(diào)節(jié)機(jī)制的研究還很少［7-9］。因此，本文論述了堿脅迫對水稻生長發(fā)育和生理生化的影響、水稻耐堿機(jī)理及相關(guān)基因的研究，提出了水稻耐堿性的策略，以期為進(jìn)一步挖掘和利用耐堿相關(guān)基因，通過分子育種手段培育耐堿水稻新品種提供理論參考。

1 堿脅迫對水稻生長發(fā)育的影響

堿脅迫對植物的危害既有緩慢的滲透脅迫和離子毒害，又有更嚴(yán)重的高pH值脅迫，與鹽脅迫相比對植物造成的損傷更嚴(yán)重。堿脅迫對水稻最普遍的效應(yīng)就是抑制組織和器官的生長和分化，延緩發(fā)育進(jìn)程，最終影響產(chǎn)量［10］。

1.1 堿脅迫對水稻種子萌發(fā)的影響

鹽堿脅迫均能抑制水稻種子萌發(fā)，離子毒害和滲透脅迫是主要影響因素［11］，堿脅迫由于具有較高pH值，對種子萌發(fā)的抑制程度大于鹽脅迫和滲透脅迫［12］。另外，堿脅迫與鹽脅迫相比，對種子芽的生長抑制更顯著［13］。

1.2 堿脅迫對水稻根系的影響

根系因與根際鹽溶液直接接觸成為受堿脅迫的主要器官。研究表明，水稻根系在堿性溶液中會變黃［14］。堿脅迫抑制水稻芽期根長的生長［15］，根系周圍的高pH會引起金屬離子和磷的積累沉淀，損壞根部組織結(jié)構(gòu)，降低根系活力，導(dǎo)致根系細(xì)胞死亡，進(jìn)而葉片萎蔫，不能進(jìn)行正常的光合作用，從而失去生理功能。同時，高pH還會導(dǎo)致土壤中的營養(yǎng)元素如鐵和磷凝結(jié)成塊，根系不能正常吸收營養(yǎng)，影響水稻的正常生長［16］。堿脅迫下水稻幼苗的根長、根表面積、根體積、平均根直徑和根尖數(shù)均產(chǎn)生不同程度的下降，導(dǎo)致根系的吸收功能也隨之下降［17］。

1.3 堿脅迫對水稻生長的影響

水稻幼苗期對堿脅迫的反應(yīng)較萌發(fā)期更為敏感［18］，葉片卷曲枯萎，株高降低，嚴(yán)重時會導(dǎo)致幼苗死亡［19］；較生殖期也更敏感，特別是2葉1心期是水稻苗期最敏感時期［20］。水稻的株高和生物量也隨堿脅迫濃度增加而大幅降低［21］，單株分蘗能力受到影響，整個生育進(jìn)程延后，抽穗期延遲［22］，返青期延長3-7 d，分蘗期延緩［23］。

1.4 堿脅迫對水稻產(chǎn)量的影響

堿脅迫嚴(yán)重影響水稻的生長發(fā)育，阻礙生育進(jìn)程，進(jìn)而影響水稻的產(chǎn)量構(gòu)成因素，使水稻減產(chǎn)。研究表明隨著鹽堿度的增加，總穎花數(shù)、千粒重和成穗率大幅下降［24］，穗粒數(shù)也隨之降低［25-26］，由一次、二次枝梗數(shù)和一次、二次枝梗粒數(shù)構(gòu)成的穗重也下降［27］。

堿脅迫不但影響稻米產(chǎn)量，也會影響稻米品質(zhì)。研究表明稻米的堊白粒率隨土壤鹽堿度程度的升高而增大，造成米質(zhì)下降［26］，蛋白質(zhì)含量升高，稻米評價值降低，從而導(dǎo)致食味品質(zhì)下降［28］。

2 堿脅迫對水稻生理生化的影響

2.1 堿脅迫對光合作用的影響

光合作用為植物的生長發(fā)育提供能量和物質(zhì)基礎(chǔ)，堿脅迫主要通過降低光合速率影響水稻光合作用，主要包括4個方面。第一，堿脅迫可引起氣孔關(guān)閉，降低蒸騰速率，減少CO2的攝入［29］；第二，堿脅迫可破壞葉肉的類囊體結(jié)構(gòu)，使類囊體膜膨脹，葉綠體基粒消失，損傷光系統(tǒng)I和光系統(tǒng)II的活性，削弱光合同化力［30-31］；第三，堿脅迫可不同程度抑制光合作用相關(guān)酶活性包括暗反應(yīng)過程和光合產(chǎn)物轉(zhuǎn)運過程中的相關(guān)酶［32］；第四，堿脅迫下造成離子毒害，損傷光合器官和光系統(tǒng)［33］。

2.2 堿脅迫對水稻體內(nèi)離子含量的影響

堿脅迫可極大程度的破壞離子平衡、嚴(yán)重干擾植物對礦質(zhì)元素的吸收，造成營養(yǎng)元素比例失調(diào)和新陳代謝紊亂。植物的耐鹽堿能力與K+/Na+比相關(guān)，耐鹽堿品種通過自身調(diào)節(jié)，減少Na+積累，提高K+/Na+比從而提高了耐鹽堿性［34］。除此之外Zn2+、Mg2+和Ca2+的含量也高于野生型，較強(qiáng)的Zn2+對質(zhì)膜起到一定的保護(hù)作用，較高的Mg2+含量能有效維持正常的光合作用［35］，較高的Ca2+含量具有維持細(xì)胞膜完整性的作用，減少堿脅迫對細(xì)胞的傷害［36］。

2.3 堿脅迫對水稻細(xì)胞膜透性的影響

鹽堿脅迫下細(xì)胞質(zhì)膜滲透增加是堿害的重要特征之一。研究表明，鹽堿濃度升高，細(xì)胞膜透性增加，致使細(xì)胞內(nèi)大量的小分子有機(jī)物質(zhì)和電解質(zhì)滲透到細(xì)胞外，細(xì)胞內(nèi)分子結(jié)構(gòu)和功能均被破壞，內(nèi)環(huán)境代謝紊亂［6］。水稻不同生長發(fā)育階段對滲透調(diào)節(jié)的響應(yīng)不同，營養(yǎng)生長時期對鹽堿脅迫強(qiáng)度敏感，隨著濃度的增加，滲透調(diào)節(jié)響應(yīng)增強(qiáng)，進(jìn)入生殖生長期敏感性下降［30］。

3 水稻耐堿的機(jī)理

為抵御鹽堿脅迫，水稻形成了一些調(diào)節(jié)適應(yīng)機(jī)制，其中包括滲透調(diào)節(jié)、離子平衡、抗氧化保護(hù)和激素調(diào)節(jié)等。

3.1 滲透調(diào)節(jié)

滲透調(diào)節(jié)能力是作物耐鹽堿的基本特征之一。在堿脅迫條件下，水稻為了保持細(xì)胞質(zhì)、液泡及胞外環(huán)境的滲透勢平衡，必需在細(xì)胞質(zhì)中積累和合成一些對細(xì)胞沒有毒害作用的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，以平衡細(xì)胞質(zhì)與液泡的滲透勢［6］。參與滲透調(diào)節(jié)的物質(zhì)主要分兩類：一類是由外界環(huán)境進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)的無機(jī)離子如K+等［35］，另一類是細(xì)胞內(nèi)合成的有機(jī)溶質(zhì)，如多元醇（甘露糖、海藻糖）、含氮化合物（脯氨酸、甜菜堿）及有機(jī)酸（蘋果酸）等［37］。脯氨酸是水溶性最強(qiáng)的氨基酸，其功能包括細(xì)胞內(nèi)的滲透調(diào)節(jié)劑、還原劑、能量來源、羥基自由基清除劑、細(xì)胞內(nèi)酶的保護(hù)劑、N素儲藏物質(zhì)和調(diào)節(jié)氧化還原電勢等。水稻幼苗在受到堿脅迫時其葉片和根部的脯氨酸含量均顯著參與細(xì)胞的滲透調(diào)節(jié)［38］。

3.2 離子平衡

鹽堿脅迫能引起水稻細(xì)胞內(nèi)的離子紊亂，打破原有的Na+、Cl-離子平衡。耐堿水稻通過3種途徑實現(xiàn)離子平衡：第一種利用Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白從質(zhì)膜中排除Na+或減少Na+的進(jìn)入；第二種利用液泡膜上的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白將Na+置于液泡中進(jìn)行區(qū)隔化；第三種分泌Na+［39-40］。研究表明可采用分蘗期葉片Na+/K+來指示水稻對鹽堿脅迫的離子響應(yīng)［33］。

3.3 抗氧化保護(hù)

鹽堿脅迫能夠?qū)е滤倔w內(nèi)產(chǎn)生大量的活性氧發(fā)生氧化脅迫，而抗氧化保護(hù)是水稻抵御鹽堿傷害的主要手段之一。植物的抗氧化系統(tǒng)包括以超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）、抗壞血酸氧化物酶（APX）等為主的酶促系統(tǒng)和以谷胱甘肽、抗壞血酸等為主的非酶促防御系統(tǒng)［6］。研究表明，堿脅迫與鹽脅迫相比需增加體內(nèi)抗壞血酸的含量減輕更多的活性氧對水稻造成的氧化損傷［41］。

3.4 激素調(diào)節(jié)

脫落酸（ABA）作為植物的五大激素之一，在調(diào)控植物應(yīng)對各種逆境脅迫中發(fā)揮著重要的作用，其耐鹽堿機(jī)理為在高鹽堿環(huán)境下加速植物體內(nèi)ABA的積累，誘導(dǎo)ABA響應(yīng)元件基因表達(dá)使植物產(chǎn)生抗性［10］。研究表明，ABA可在鹽堿脅迫下促進(jìn)水稻葉片的生長，提高蒸騰效率和耐鹽堿性［42］。當(dāng)水稻幼苗受到堿脅迫時，以ABA對水稻幼苗進(jìn)行24 h浸根處理后顯著提高了水稻幼苗的成活率和生物量，其原因是ABA增加了相對含水量（Relative water content，RWC），降低了細(xì)胞膜損傷程度（Membrance injury，MI）和Na+/K+比值［10］。田間實驗顯示，ABA處理可提高蘇打鹽堿地水稻秧苗素質(zhì)，有效減緩水稻返青期秧苗受傷害程度，增強(qiáng)水稻根系的發(fā)根力、提高分蘗數(shù)，增加水稻產(chǎn)量等［43］。

4 水稻耐堿相關(guān)基因研究進(jìn)展

水稻耐堿研究經(jīng)歷了2個階段，早期集中在堿脅迫條件下水稻生理指標(biāo)的測定，現(xiàn)階段集中在耐堿基因的克隆和功能鑒定及QTL定位。

4.1 耐堿基因的克隆和功能鑒定

目前，相對水稻耐鹽作用機(jī)理及相關(guān)基因的研究報道而言，水稻耐堿性狀相關(guān)基因的研究鮮少報道。謝國生等［44］克隆了VB12不依賴型蛋氨酸合成酶基因（VB12-independent methionine synthase gene），該基因全長2 740 bp編碼765個氨基酸，當(dāng)水稻受到Na2CO3脅迫時，其轉(zhuǎn)錄活性明顯增強(qiáng)，與水稻的堿適應(yīng)性密切相關(guān)。Guo等［45］從水稻耐堿突變體alt1（alkaline tolerance 1）中克隆了一個位于細(xì)胞核中的OsALT1基因，該基因編碼Snf2家族染色質(zhì)重構(gòu)ATP酶的核心亞基，是水稻耐堿性的一個負(fù)調(diào)控基因，主要參與活性氧的產(chǎn)生、清除和DNA修復(fù)過程。alt1突變體通過增強(qiáng)抗氧化損傷的防御作用提高對堿脅迫的耐受性。Guan等［46］研究表明鋅指蛋白OsLOL5基因在堿脅迫條件下參與了氧化調(diào)控，通過激活活性氧的解毒途徑提高水稻的耐堿性。Wang等［47］利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)獲得無機(jī)焦磷酸酶OsPPa6基因突變體，突變體的無機(jī)磷、ATP、葉綠素、蔗糖和淀粉、凈光合速率、可溶性糖和脯氨酸顯著降低，而丙二醛、滲透勢和Na+/K+比顯著增加，說明OsPPa6基因是水稻重要的滲透調(diào)節(jié)因子。李寧等［48］對295個粳稻品種進(jìn)行苗期耐堿度的全基因組關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，1個新的耐堿基因LOC_Os03g26210（OsIRO3），該基因編碼bHLH型轉(zhuǎn)錄因子，是水稻缺鐵反應(yīng)負(fù)調(diào)控因子。

4.2 水稻堿脅迫下的QTL研究進(jìn)展

迄今為止，水稻耐堿基因的挖掘和利用明顯落后于鹽脅迫研究，且多數(shù)研究還停留在QTL定位階段。梁正偉等［49］在不同濃度堿脅迫下利用BC4F10群體檢測到7個QTL。程海濤等［50］利用DH-1群體檢測到與發(fā)芽勢和相對堿害率相關(guān)的10個主效QTL。祁棟靈等［51］在Na2CO3脅迫下，以高產(chǎn)106/長白9號雜交組合的200個F2：3株系進(jìn)行QTL定位檢測，獲得與發(fā)芽率相關(guān)的QTL 7個，與發(fā)芽率相對堿害率相關(guān)的QTL 6個。Qi等［52］利用F2：3群體定位耐堿相關(guān)QTL 19個。鄒德堂等［53］以F2：3代180個家系為作圖群體進(jìn)行耐堿性QTL檢測，共檢測到16個QTL。李寧等［54］以堿敏感的母本與強(qiáng)耐堿的父本雜交衍生的F2：3群體進(jìn)行苗期耐堿性QTL定位，共檢測到分布在第5、7和11號染色體的3個QTL。

5 提高水稻耐堿的途徑

5.1 采取合適的栽培措施

幼苗期采用低鹽堿鍛煉提高種子和秧苗的耐堿能力［55］，插秧后本田調(diào)酸，減低鹽堿度，同時施用有機(jī)肥提高水稻體外的K+含量，增加K+/Na+比，緩解滲透脅迫的壓力［56］，另外適當(dāng)增施Ca、P、S和Si等肥料，可提高水稻的耐鹽堿能力［57-59］。建立標(biāo)準(zhǔn)化田間工程，采用淹灌或者間歇灌溉方式壓鹽洗堿改良鹽堿稻田［60］，利用明渠或暗管排水脫鹽，改善土壤通透性，增強(qiáng)水稻根系活力［61］。研究表明，水稻苗期施用土壤改良劑，土壤中的全鹽、Cl-、pH值顯著下降，緩解水稻秧苗受到的鹽堿危害，稻田施用土壤改良劑，提高了保苗率，水稻分蘗能力增強(qiáng)，干物質(zhì)積累增加，后期產(chǎn)量高［62］。研究表明施用鹽堿土壤改良劑可以提高水稻分蘗能力、植株長勢，增加抗赤枯病的能力，提高單穗粒和單穗重，從而提高水稻單產(chǎn)水平［63］。

5.2 選育耐鹽堿品種

耐鹽堿水稻品種的來源主要通過常規(guī)育種和分子育種兩種途徑獲得。目前在水稻耐鹽堿品種選育中仍以常規(guī)育種為主，廣東湛江的陳日勝于1986年11月發(fā)現(xiàn)了1株野生水稻，經(jīng)過多年繁殖、篩選，育成“海稻86”，具有較好的耐鹽堿性［64］。遼寧鹽堿地利用研究所自1984年開展耐鹽堿水稻研究以來，先后育成鹽81-210、抗鹽100號、鹽粳228等多個耐鹽堿品種（組合）［65］。江蘇沿海地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所、廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所、江蘇省農(nóng)科院等多個國內(nèi)研究機(jī)構(gòu)先后利用常規(guī)育種技術(shù)育成長白10號、鹽城156、廣鹽1號等多個耐鹽堿水稻品種［66］。

近年來，隨著分子生物學(xué)和各種組學(xué)以及測序技術(shù)的迅猛發(fā)展，特別是耐堿相關(guān)QTL和基因的廣泛發(fā)掘，形成了一批分子育種新技術(shù)，包括分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)、轉(zhuǎn)基因、全基因組選擇、細(xì)胞工程育種等［67］。海南大學(xué)與湖南省水稻研究所合作，以高耐鹽野生蘆葦DNA作物基因供體，應(yīng)用花粉管通道技術(shù)導(dǎo)入普通水稻中，培育出具有強(qiáng)耐鹽堿特性的水稻新種質(zhì)。江蘇省農(nóng)科院等團(tuán)隊通過分子標(biāo)記輔助選擇與常規(guī)育種技術(shù)相結(jié)合，將耐鹽堿、抗病、優(yōu)質(zhì)和高產(chǎn)基因聚合到優(yōu)良水稻品種中，育成南粳9108、鹽稻12號、遼粳1305和京寧29等耐鹽堿品種［66］。袁隆平團(tuán)隊利用遺傳工程技術(shù)，選育出可供產(chǎn)業(yè)化推廣、鹽度不低于1%，海水灌溉條件下，能正常生長且產(chǎn)量能達(dá)到200-300 kg/畝的水稻品種。2019年，該耐鹽堿稻品種在國內(nèi)外主要鹽堿地進(jìn)行了百畝至千畝示范種植成功［68］。堿基因?qū)雰?yōu)良品種，培育高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)耐堿水稻新品種，對合理開發(fā)現(xiàn)有堿土資源，具有重要的學(xué)術(shù)價值和應(yīng)用前景。

6 展望

我國鹽堿地資源豐富，約80%的鹽堿地可開發(fā)為耕地，綜合利用潛力巨大。水稻作為鹽堿地改良的首選糧食作物，發(fā)展鹽堿地水稻生產(chǎn)是保障我國糧食安全生產(chǎn)的重要舉措之一。目前研究者關(guān)注的重點是水稻耐鹽資源的鑒定、基因克隆與功能研究，對水稻耐堿方面的研究較少。因此，開展水稻耐堿研究，對發(fā)揮水稻品種的生產(chǎn)潛力，進(jìn)一步擴(kuò)大水稻種植面積，提高人民生活水平以及改善生態(tài)環(huán)境具有十分重要的意義。

水稻耐堿性是多種生理性狀的綜合表現(xiàn)，是由多基因控制的數(shù)量性狀，雖然水稻的耐堿能力與滲透脅迫、離子毒害和高pH值脅迫密切相關(guān)，但其具體遺傳調(diào)節(jié)機(jī)制還不清楚。如在堿脅迫條件下，參與滲透調(diào)節(jié)的因子有哪些？具體信號傳遞過程是怎樣的？多個耐堿基因是如何協(xié)作調(diào)控整個網(wǎng)絡(luò)的？這些問題都是需要進(jìn)一步研究去解決的。利用突變體來分離目的基因已成為水稻新基因挖掘的有效途徑之一，缺乏耐堿突變體是目前耐堿相關(guān)基因研究較少的原因之一。因此，有必要加強(qiáng)水稻耐堿突變體的篩選鑒定，建立水稻耐堿突變體庫，進(jìn)行基因的克隆和功能分析。此外，隨著測序技術(shù)的發(fā)展，特別是全基因組關(guān)聯(lián)分析（Genome-wide aassociation study，GWAS）技術(shù)廣泛地應(yīng)用于水稻復(fù)雜性狀的解析，可對水稻不同生長發(fā)育時期的耐堿性進(jìn)行GWAS分析，以鑒定同時控制多個生長階段耐堿性的優(yōu)異基因用于水稻耐堿新品種培育。

綜上所述，充分利用現(xiàn)代分子生物技術(shù)，深入開展水稻耐堿生理和分子機(jī)制研究，加強(qiáng)耐堿種質(zhì)資源的鑒定篩選和基因的發(fā)掘，通過多種手段將耐