李 晶 張紹軍 黃廷榮 徐繼勛

1.湖北省黃石市中醫(yī)醫(yī)院，湖北黃石 43500；2.湖北省孝感市孝南區(qū)朱湖衛(wèi)生院，湖北孝感 432100

《醫(yī)學實驗室質(zhì)量和能力認可準則》中明確表示，實驗室應為檢驗過程中，用于報告患者樣本被測量值的每個測量程序確定測量不確定度[1]。目前，測量不確定度只有“自上而下”和“自下而上”兩種評定方法，而“自上而下”的測量不確定度評定方法是公認較為簡便的唯一方法，但是該法也存在一定的局限性，本研究同時采用“自上而下”和“自下而上”兩者方法分別評定測量不確定度，探討兩者的優(yōu)異，以供臨床實驗室根據(jù)自身情況選擇不確定度的評定方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

德國羅氏全自動免疫電化學發(fā)光法分析儀E401；羅氏原裝試劑：甲胎蛋白（AFP，批號：13310803、17674703、21371600）、癌胚抗原（CEA，批號：24484800、16842403、20394901）、糖類抗原199（CA199，批號：16483403、19394103、23161200）、糖類抗原153（CA153，批號：16122803、19217101、20990000）、糖類抗原125（CA125，批號：16907902、117762、2561800）、總前列腺抗原（TPSA，批號：17063003、199422、2470450）。采用原裝配套2 水平質(zhì)控品；羅氏原裝配套校準液。

1.2 人員和環(huán)境

所有測量過程均由中國合格評定國家認可委員會（CNAS）免疫授權簽字人嚴格按照標準操作規(guī)程完成。實驗室環(huán)境溫濕度均在嚴格的監(jiān)控下。儀器設備每年校準2 次，定期保養(yǎng)維護。

1.3 數(shù)據(jù)來源及不確定度的測量方法

1.3.1 批內(nèi)精密度

將六項腫瘤標志物的室內(nèi)質(zhì)控物重復測定21 次，剔除第1 次數(shù)據(jù)和離群值，計算均值、標準差和變異系數(shù)。

1.3.2 批間精密度

收集黃石市中醫(yī)醫(yī)院醫(yī)學實驗室2017 年8～12 月（1 次/d）室內(nèi)質(zhì)控在控數(shù)據(jù)，共122 d，計算批間精密度。

1.3.3 衛(wèi)生部室間質(zhì)評數(shù)據(jù)（PT）計算不確定度

衛(wèi)生部臨檢中心能力驗證活動每年2 次數(shù)據(jù)質(zhì)控物由國家衛(wèi)計委臨檢中心提供，編號為：201521～201525、201611～201615、201621～201625、201711～201715、201721～201725、201811～201815。統(tǒng)計6 次室間質(zhì)評結(jié)果，根據(jù)以下公式計算：

urel（Rw）=，其中urel（Rw）為實驗室內(nèi)測量復現(xiàn)性引入的相對測量不確定度分量，RSD2R,i 為單次PT 的相對測量復現(xiàn)性，mi為單次PT 的實驗室數(shù)量，n 為PT 總數(shù)。

1.3.4 校準引入的不確定度

校準品量值溯源性也會引入測量不確定度，引用羅氏廠家提供的校準品不確定度參數(shù)。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0 統(tǒng)計學軟件對所得數(shù)據(jù)進行分析，計量資料符合正態(tài)分布以均數(shù)±標準差（）表示，采用配對樣本t 檢驗統(tǒng)計，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 “自上而下”方法評定腫瘤標志物測量不確定度

實驗室內(nèi)測量復現(xiàn)性引入的不確定度來源于批間和批內(nèi)精密度數(shù)據(jù)，采用A 類方法統(tǒng)計分析，偏移引入的不確定來源于PT 數(shù)據(jù)和校準品量值溯源數(shù)據(jù)，同時采用A 類和B 類方法統(tǒng)計分析。見表1。

2.2 “自下而上”的方法評定測量不確定度

2.2.1 儀器設備引入的測量不確定度

公開資料顯示，黃道龍曾任共青團揚州市委秘書，揚州市審計局副局長、局長，揚州市國資委主任等職，2012年退休。黃宇曾任揚州市財政局下屬二十四橋賓館副總經(jīng)理，2016年9月任揚州市資源交易中心政府采購科科長。

2.2.1.1 設備吸光度重復性引入的不確定度 用國家一級吸光度溶液標準物手工加入儀器比色杯中，確認無氣泡，將比色杯放回孵育池，執(zhí)行空白檢查，反復檢測20 次，統(tǒng)計扣除水空白后的吸光度值，計算其均值為4800，標準不確定度為6.72，相對標準不確定度為0.14%。

2.2.1.2 試劑艙溫度波動引入的不確定度 用經(jīng)過校準的精度為0.1℃的德國testo 735 溫度檢測儀探頭放入試劑倉中，待溫度穩(wěn)定后，每隔1 min 測定1 次溫度，檢測20 次，測得試劑艙溫度值在（20.0±3.0）℃，溫度波動＜2℃。將溫度波動認為均勻分布，則ɑ（置信區(qū)間半寬度）=1；包含因子，標準不確定度u=ɑ/=0.57℃，相對標準不確定度為2.85%。

2.2.1.3 孵育盤溫度波動引入的不確定度 用經(jīng)過校準的精度為0.1℃的溫度檢測儀探頭放入試劑倉中，待溫度穩(wěn)定后，每隔1 min 測定1 次溫度，檢測20 次，測得試劑艙溫度值在（37.0±0.3）℃，溫度波動＜2℃。將溫度波動認為均勻分布，則ɑ=0.1；包含因子，標準不確定度u=ɑ/k=0.=0.057℃，相對標準不確定度為0.15%。

表1 “自上而下”方法評定六項腫瘤標志物的測量不確定度

2.2.1.4 儀器加樣系統(tǒng)重復性和穩(wěn)定性引入的不確定度 加樣系統(tǒng)包括試劑針和樣本針裝置，利用羅氏免疫分析儀軟件將樣本針和試劑針的加樣準確性轉(zhuǎn)換為吸光度值，設其為三角分布，吸光度均值為135，標準差為2.8，則ɑ=1.4；包含因子，標準不確定度u=ɑ/k=1.4/=0.57，相對標準不確定度為0.42%。

2.2.1.5 攜帶污染率引入的不確定度 低值樣本測量5 次，后分別進行高值1 次檢測，低值1 次檢測，重復3 次，計算攜帶污染率值，公式：（3 次低值均值-5 次高值均值）/3 次iSAP（羅氏攜帶污染檢測試劑）均值。計算的均值為181 ppm，標準差為9 ppm，相對標準不確定度為0.32%。

2.2.2 其他因素引入的測量不確定度

2.2.2.2 離心機校準引入的測量不確定度 實驗室湖南長沙湘智離心機校準引用《JJF（浙）1117-2015 醫(yī)用離心機校準規(guī)范》[2]，引用離心機校準報告，得標準不確定度9.6 r/min，相對標準不確定度為0.32%。

2.2.2.3 不同批號試劑引入的測量不確定度 采用3個不同批號分別上機檢測，每個批號均采用同一濃度檢測10 次，采用貝賽爾公式計算標準偏差，標準不確定度等于1 倍標準差，公式：u=，其中u 為測量不確定度，xi為單個測量量,xˉ為平均值，n 為測量次數(shù)。

六項腫瘤標志物不同批號試劑引入的不確定度經(jīng)統(tǒng)計分析后為：AFP：（9.99±0.38）ng/mL（k=2），CEA：（5.18±0.21）ng/mL（k=2），CA125：（35.71±1.24）U/mL（k=2），CA153：（22.14±1.17）U/mL（k=2），CA199：（21.67±0.68）U/mL（k=2），TPSA：（4.29±0.18）ng/mL（k=2）；其相對測量不確定度為3.84%、3.86%、3.47%、5.29%、3.15%、4.19%。

2.2.2.4 校準品引入的測量不確定度 采用B 類評定方法直接引用校準品溯源性文件中不確定度數(shù)值。見表1。

2.2.2.5 人員引入的測量不確定度 從事免疫檢驗工作人員均是CNAS 授權簽字人，經(jīng)過嚴格的崗前培訓和豐富的專業(yè)知識，人員因素可忽略不計。

2.2.3 合成標準不確定度

除了試劑、校準品外，六項腫瘤標志物存在共同的不確定來源，包括設備吸光度重復性，試劑艙溫度波動，孵育盤溫度波動，加樣系統(tǒng)重復性和準確性，系統(tǒng)攜帶污染率，環(huán)境溫、濕度波動，離心機校準七大不確定來源分量，將其合成標準不確定度為14.8，相對合成標準不確定度6.6%。對六項腫瘤標志物的檢測過程進行全面、系統(tǒng)的分析后，識別出實驗室可能的不確定度來源（校準、試劑、儀器設備和環(huán)境溫度等）并加以評定。見表2。

2.3 兩種方法評定不確定度的統(tǒng)計學分析

“自下而上”方法評定六項腫瘤標志物的測量不確定度的結(jié)果與“自上而下”方法評定的結(jié)果比較，差異無統(tǒng)計學意義（t=1.500，P ＞0.05）。

3 討論

隨著人類對測量質(zhì)量的不斷探索，測量不確定度在20 世紀60 年代被引入[3]。經(jīng)過近60 年的發(fā)展，測量不確定度被應用于各個領域，在計量學領域中，不確定度被認為是測量結(jié)果本身的一部分[4]，而在臨床檢驗中，測量不確定度則被認為是測量系統(tǒng)檢驗結(jié)果的固有屬性[5-7]。

表2 “自下而上”方法評定六項腫瘤標志物的測量不確定度

目前，測量不確定度和總誤差的概念一直都是檢驗專業(yè)爭論的話題，二者均是對檢驗結(jié)果和真值出現(xiàn)概率的追求。但是，經(jīng)典的誤差理論并不完全適用于醫(yī)學檢驗的實際工作[8]。雖然嚴孝嶺等[9]認為不確定度與總誤差具有數(shù)據(jù)上的一致性，但測量不確定度具體應用于臨床，更能幫助測量值在醫(yī)療診斷和治療效果監(jiān)測方面體現(xiàn)出獨特的優(yōu)勢[10]，表現(xiàn)在同一患者前后結(jié)果的比較、醫(yī)學決定水平和生物參考區(qū)間的應用等方面[11]。

國內(nèi)外公認的測量不確定度表示指南（GUM）[12]中的“模式辦法”經(jīng)過不斷的改進形成目前的“自下而上”法，是不確定度評定的金標準。由于“模式方法”計算繁瑣、過程復雜，國際實驗室推出Nordtest 準則，采用實驗室數(shù)據(jù)進行評定。楊振華[13]建議采用“經(jīng)驗辦法”即“自上而下”的方法進行測量過程中的不確定度評定，之后張曉紅等[14]采用Nordtest 準則，利用“室內(nèi)質(zhì)控數(shù)據(jù)和室間質(zhì)評數(shù)據(jù)”評定了21 項生化項目的測量不確定度，并認為Nordtest 準則適合目前臨床實驗室常規(guī)檢測項目的不確定度評估。同年，Magnusson等[15]也依據(jù)Nordtest 準則采用室內(nèi)質(zhì)控和室間質(zhì)評數(shù)據(jù)完成不確定度評定。目前，有文章采用質(zhì)控數(shù)據(jù)、PT數(shù)據(jù)和質(zhì)控品數(shù)據(jù)對血清腫瘤標志物進行測量不確定度評定[16-17]，也有報道[18-19]采用GUM 方法進行白細胞計數(shù)參考方法和分類計數(shù)的不確定度評估，而未見采用分析各不確定度分量來源的“自下而上”方法對全自動生化免疫檢測系統(tǒng)中腫瘤標志物進行不確定度評定的報道。本研究對腫瘤標志物同時進行兩種方法的不確定度評定，兩個方法中均同時采用A 類和B 類數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析方法。本研究結(jié)果提示，采用“自下而上”的方法比“自上而下”的方法所得不確定度數(shù)據(jù)一致性偏小，這與楊振華[13]的觀念一致，采用模式辦法所得不確定度往往較小，由于存在忽視某些重要不確定度來源分量的可能。但是將兩個方法所得不確定度進行統(tǒng)計學分析比較發(fā)現(xiàn)兩者之間差異無統(tǒng)計學意義（P >0.05）。

本研究數(shù)據(jù)可知，采用“自上而下”方法評定測量不確定度時，批間精密度引入的復現(xiàn)性分量和PT 數(shù)據(jù)引入的偏移不確定度分量是主要的不確定度來源，校準和批內(nèi)精密度的影響作用較小，但不可忽略不計。實驗室可通過降低批間精密度對合成不確定度的影響，進而改進相對不確定度。采用“自下而上”的方法，不同來源的不確定度分量對合成標準不確定度的影響作用由大到小依次為：系統(tǒng)攜帶污染率、批間試劑的差異、環(huán)境溫濕度的波動、試劑艙溫度波動、校準品、加樣的重復性和準確性、離心機的校準、儀器吸光度的波動。可見，檢測項目的不確定度主要來源于檢測系統(tǒng)和環(huán)境的波動，其次才是試劑批間的差異。實驗室可以通過嚴格監(jiān)控儀器設備的校準和提高環(huán)境穩(wěn)定性進而降低測量不確定度，提高檢測質(zhì)量。

專家[12-13]認為采用“自下而上”對檢測過程進行全面分析，識別每個可能的不確定度來源并加以評定的方法費事費力。本研究僅引用ISO15189 認可準備階段所完成的儀器校準報告、校準品溯源性報告、實驗室離心機校準報告、溫濕度校準報告以及不同批號試劑的檢測數(shù)據(jù)進行了“自下而上”方法的評定。并且將其結(jié)果與被大眾所接受的Nordtest 準則評定的不確定度結(jié)果比較，得到了理想的結(jié)果，證明其可行性。此外，由于采用“自上而下”的方法需要6 次PT 數(shù)據(jù)才能完成偏移引入的不確定度評定[20-22]，對于每年衛(wèi)生部組織的能力驗證只有5 個樣本的項目，要完成檢測項目的不確定度評定需要1 年以上的PT 數(shù)據(jù)，不適用于急需進行不確定度評定的實驗室。本研究中的“自下而上”的方法利用現(xiàn)有數(shù)據(jù)和部分實驗數(shù)據(jù)即可完成評定工作，在一定程度上具有實驗室的適用性。

對影響檢驗結(jié)果的各分量進行數(shù)學合成并不是僅僅為了得到一個合成不確定度[23]，而是為了查找影響檢測結(jié)果的主要因素，進而提高檢驗質(zhì)量，達到持續(xù)改進的目的，以滿足臨床的需求。本研究則以測量結(jié)果和組成測量過程的各因素為兩個切入點分別進行的不確定度分量來源的分析，明確檢驗質(zhì)量提高的方向。因此，本研究中采用的“自上而下”和“自下而上”兩個方法進行不確定度評估均存在可行性和適用性。