孫嘉棟 孫曉鳳 李蘭 沈偉 程順?lè)?/p>

（青島農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，青島 266109）

我國(guó)是地方豬種質(zhì)資源最豐富的國(guó)家，1986版《中國(guó)豬品種志》中詳細(xì)介紹了48個(gè)中國(guó)地方豬種，并按自然地理分布將它們劃分為華北型、華中型、華南型、江海型、西南型和高原型［1］。隨著時(shí)間推移，我國(guó)發(fā)現(xiàn)的地方豬種數(shù)量不斷增加。2007年，聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織調(diào)查結(jié)果顯示，我國(guó)地方豬品種已達(dá)114個(gè)，占全球豬種資源的30%［2］。與國(guó)外高產(chǎn)豬種相比，我國(guó)地方豬種在粗飼料耐受、繁殖力、肉質(zhì)和適應(yīng)力等方面更加優(yōu)秀，但由于其出生體重小、精飼料轉(zhuǎn)化力差、瘦肉率和屠宰率低、飼養(yǎng)周期長(zhǎng)等特點(diǎn)，地方豬種在市場(chǎng)經(jīng)濟(jì)條件下極度缺乏生產(chǎn)效率和經(jīng)濟(jì)效益優(yōu)勢(shì)［3］。由于多年來(lái)片面追求高瘦肉率和生長(zhǎng)速度，我國(guó)大量引進(jìn)外來(lái)育成品種，對(duì)地方豬種進(jìn)行雜交改良，使種豬和商品豬的規(guī)模生產(chǎn)基本被外來(lái)豬種壟斷［4］，致使部分地方豬種瀕危或滅絕，如項(xiàng)城豬（Sus scrofadomesticus Xiangcheng）、深縣豬（Sus scrofadomesticus Shenxian）、豪桿嘴型內(nèi)江豬（Sus scrofadomesticus Neijiang）和大普吉豬（Sus scrofadomesticus Puji）已被證實(shí)徹底滅絕［5］。地方豬種遺傳資源多樣性正遭受嚴(yán)重破壞，各種優(yōu)質(zhì)基因不斷流失。遺傳資源丟失會(huì)使品種內(nèi)遺傳變異減少，對(duì)我國(guó)生豬生產(chǎn)的可持續(xù)性產(chǎn)生嚴(yán)重影響，目前地方豬種遺傳多樣性的保護(hù)已迫在眉睫［6］。現(xiàn)階段除原位保存、精液和胚胎冷凍保存、DNA文庫(kù)保種等方法外，體細(xì)胞庫(kù)保種也是保留種質(zhì)資源的有效手段［7］。目前，牛［8］、羊［9］和雞［10］等家畜家禽的體細(xì)胞庫(kù)已建立，但由于體細(xì)胞高度分化的特性及培養(yǎng)技術(shù)的限制，其目前只能通過(guò)體細(xì)胞核移植方式取得擴(kuò)群效果［11］。相較于體細(xì)胞，干細(xì)胞具有向各種細(xì)胞分化的潛能，其多能性更強(qiáng)［12］，不僅可提高核移植的效率，得到更多健康仔豬［13］，還可分化成生殖細(xì)胞樣細(xì)胞［14］，使未來(lái)有望通過(guò)有性生殖的方式擴(kuò)大瀕危豬種的種群數(shù)量。無(wú)論是從現(xiàn)有擴(kuò)群途徑還是未來(lái)發(fā)展前景看，干細(xì)胞都比體細(xì)胞更具優(yōu)勢(shì)。因此建立地方豬種干細(xì)胞庫(kù)可以更加全面、更加有效的保護(hù)我國(guó)的地方豬種質(zhì)資源。

1 現(xiàn)有地方豬種種質(zhì)資源保護(hù)措施

原位保存法是以前最常用的活體保種法，即在地方豬種原產(chǎn)地建造良種基地，組建200頭以上且各代群體規(guī)?；疽恢碌谋７N群，每隔2.5年增加一代，以防止群體近交系數(shù)過(guò)大［15］。原位保存法以最直接的方式保留種質(zhì)資源，但由于所需的保種維持費(fèi)用較高導(dǎo)致無(wú)法在全國(guó)推廣實(shí)施。其次，該方法需占用較大場(chǎng)地、組織管理工作復(fù)雜、受自然環(huán)境影響較大、優(yōu)秀群體和個(gè)體生理利用年限短等缺點(diǎn)也是該保種方式受限的原因［16］。而DNA文庫(kù)保種、精液冷凍保存、胚胎冷凍保存和體細(xì)胞冷凍保存等非活體保種技術(shù)也有其各自不足之處［17］。DNA文庫(kù)保種是將畜禽細(xì)胞內(nèi)的DNA片段通過(guò)連接質(zhì)粒、轉(zhuǎn)化入菌的方法進(jìn)行擴(kuò)增保存。建立DNA文庫(kù)雖說(shuō)可以有目的地保存控制優(yōu)良性狀的DNA片段，長(zhǎng)久保存優(yōu)質(zhì)基因及遺傳資源，但卻無(wú)法復(fù)原原有動(dòng)物種群，僅能簡(jiǎn)單保存基因的DNA片段。其次，由于DNA保存過(guò)程中易降解的特性，動(dòng)物大片段DNA文庫(kù)保存技術(shù)還需不斷提升［18］。精液和胚胎冷凍保存是將精液和胚胎在冷凍保護(hù)劑保護(hù)下，以最適降溫速率凍到-196℃的液氮或-269℃的液氦中。如有需要，便可借助人工授精或胚胎移植技術(shù)快速擴(kuò)大種群，進(jìn)行種質(zhì)創(chuàng)新，加快育種進(jìn)度。然而，家豬的精液和胚胎冷凍保存與牛、馬等家畜相比一直存在技術(shù)差距。在精液冷凍方面，豬一次射精量大，約有200-300 mL，因此精液對(duì)外界溫度非常敏感，極其不耐凍。其次，豬是多胎動(dòng)物，需要20-50億精子才能滿足1次配種，大劑量的豬精液冷凍保存給這項(xiàng)技術(shù)增加了困難［19］。在胚胎冷凍方面，由于豬胚胎的脂質(zhì)含量較高，冷凍保存難度大，使其胚胎冷凍保存技術(shù)相較于牛、羊等發(fā)展較為緩慢。不同發(fā)育階段的胚胎需使用不同的玻璃化冷凍條件，如何界定胚胎狀態(tài)并選出最佳冷凍條件也是其難點(diǎn)之一，且冷凍液選擇和去脂操作都有待進(jìn)一步改善［20］。體細(xì)胞冷凍保存與精子胚胎冷凍技術(shù)相似，是將動(dòng)物體細(xì)胞冷凍保存后，再通過(guò)體細(xì)胞核移植技術(shù)生產(chǎn)后代，由于體細(xì)胞比精子和胚胎更易從數(shù)量稀少的瀕危物種上收集，因此體細(xì)胞冷凍保存被認(rèn)為是最有潛力保護(hù)瀕危物種的方法［21］。然而，目前生殖性克隆成功率低，尤其在豬上，只有1%-5%移植到代孕母豬的重構(gòu)胚胎能產(chǎn)生活的后代［22］，且大部分仔豬出生后表現(xiàn)異常［23］，使核移植效率進(jìn)一步降低，極大限制該技術(shù)在保護(hù)種質(zhì)資源中的實(shí)際應(yīng)用。

2 干細(xì)胞技術(shù)概述

干細(xì)胞是一類具有自我更新、高度增殖和多向分化能力的細(xì)胞，它不僅能分化成不同類型的細(xì)胞，以構(gòu)成機(jī)體各種復(fù)雜的組織器官，還可通過(guò)細(xì)胞分裂維持自身群體穩(wěn)定。根據(jù)其發(fā)育階段可分為胚胎干細(xì)胞（Embryonic stem cells，ESCs）和成體干細(xì)胞（Adult stem cells，ASCs）［24］。1981年，Evans等 首次分離小鼠胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)（Inner cell mass，ICM），并通過(guò)體外培養(yǎng)獲得穩(wěn)定的胚胎干細(xì)胞系［25］。誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（Induced pluripotent stem cells，iPSCs）和胚胎干細(xì)胞有一定相似性，是由已分化的體細(xì)胞誘導(dǎo)重編程而來(lái)，具有多能性且能自我更新［26］。2006年，山 中 伸 彌 等 將OCT4、SOX2、KLF4和C-MYC（OSKM）4個(gè)轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)病毒載體轉(zhuǎn)到小鼠體細(xì)胞內(nèi)，首次得到類似胚胎干細(xì)胞的全新多能細(xì)胞［27］。2009年，周琪課題組和高紹榮課題組分別使用四倍體囊胚注射法獲得iPSCs來(lái)源小鼠，再次證明iPSCs具有與ESCs相似的多潛能特性［28-29］。此外，ASCs向生殖細(xì)胞分化也一直處于干細(xì)胞研究熱點(diǎn)中。ASCs在哺乳動(dòng)物體內(nèi)大量存在，多能性相對(duì)ESCs較低，但大量研究證明ASCs具有轉(zhuǎn)分化為生殖細(xì)胞的能力，如骨髓干細(xì)胞、脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞、皮膚干細(xì)胞和胰腺干細(xì)胞等均被證實(shí)可在體外轉(zhuǎn)分化為生殖細(xì)胞樣細(xì)胞［30］。

3 干細(xì)胞技術(shù)在地方豬種質(zhì)資源保護(hù)中的應(yīng)用前景及可行性

人和小鼠的干細(xì)胞在體外已得到廣泛研究。豬作為人類較早馴化的動(dòng)物之一，其主要臟器大小和生理結(jié)構(gòu)功能與人類非常相似［31］，所以豬干細(xì)胞研究一直是干細(xì)胞領(lǐng)域研究熱點(diǎn)，在小鼠干細(xì)胞大量前瞻性研究成果指引下，豬干細(xì)胞研究正逐步取得突破［32］。從大量已知報(bào)道中可知［33-36］，由于干細(xì)胞的全能性特質(zhì)，其在種質(zhì)資源保護(hù)中有廣泛的應(yīng)用前景。

3.1 胚胎干細(xì)胞及誘導(dǎo)多能干細(xì)胞技術(shù)的應(yīng)用

分化培養(yǎng)ESCs并獲得后代一直被全球科學(xué)家們所熱衷，在小鼠上已重復(fù)大量實(shí)驗(yàn)，技術(shù)手段不斷完善。2012年，日本九州大學(xué)Hayashi等［37］成功將小鼠ESCs誘導(dǎo)成原始生殖細(xì)胞，而后將這些原始生殖細(xì)胞移植入成年小鼠體內(nèi)獲得正常卵母細(xì)胞。2016年，Hayashi等完全在體外實(shí)現(xiàn)ESCs分化為卵細(xì)胞，分化的卵細(xì)胞受精后可產(chǎn)生正常后代，這樣就擺脫需要成年個(gè)體的限制，且整個(gè)技術(shù)流程極為精 簡(jiǎn)［38］。豬ESCs系 始 建 于1990年，Evans等［39］以豬植入前胚胎作為原始材料，發(fā)現(xiàn)當(dāng)胚胎在小鼠成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層上生長(zhǎng)時(shí)，可以無(wú)限期地保持在未分化狀態(tài)，并在達(dá)到高密度時(shí)自發(fā)分化成上皮、肌肉和神經(jīng)等各類細(xì)胞，他們依據(jù)這些現(xiàn)象初步描述了豬ESCs的特征。2016年，劉忠華課題組成功從體外培養(yǎng)5.5 d的囊胚中取出豬ESCs［40］。兩年內(nèi)，該細(xì)胞被傳代超過(guò)75次，克隆團(tuán)的形態(tài)與人胚胎干細(xì)胞極為相似，且表達(dá)OCT4、SOX2和NANOG等經(jīng)典多能標(biāo)志物。2019年，該課題組又通過(guò)KOLF培養(yǎng)體系獲得可在體外穩(wěn)定培養(yǎng)40代以上且具有扁平形態(tài)和正常核型的豬ESCs，這些細(xì)胞不僅表達(dá)堿性磷酸酶活性，還表達(dá)OCT4、SOX2和NANOG等多能性標(biāo)志物，并可在體內(nèi)形成含有三胚層的畸胎瘤，說(shuō)明該細(xì)胞在體外和體內(nèi)都具有分化能力［41］。目前體外培養(yǎng)的豬ESCs和小鼠ESCs初始態(tài)（Na?ve）不同，傳代能力和多能性狀態(tài)不理想，更接近小鼠ESCs的始發(fā)態(tài)（Primed），且其仍無(wú)法嵌合到生殖系，只能被稱為“豬類胚胎干細(xì)胞”［42］。因此，豬ESCs的研究暫時(shí)告一段落，隨著iPSCs技術(shù)出現(xiàn)，豬iPSCs又繼續(xù)向前發(fā)展。

2009年，由iPSCs培養(yǎng)產(chǎn)生的成年小鼠在Boland實(shí)驗(yàn)室中產(chǎn)生［43］。這讓研究者們看到這項(xiàng)技術(shù)的光明前景，iPSCs技術(shù)從此受到廣泛關(guān)注，并在幾年內(nèi)迅速發(fā)展［44］。在保護(hù)瀕危野生動(dòng)物方面，由于取材方便、數(shù)量多且易于保存等優(yōu)點(diǎn)，iPSCs技術(shù)已被動(dòng)物保護(hù)學(xué)家視為最有前景的技術(shù)［36］。自2009年起，科學(xué)家根據(jù)小鼠和人iPSCs的誘導(dǎo)系統(tǒng)及培養(yǎng)體系，開始嘗試建立豬iPSCs系。2009年，Ezashi等［45］使用慢病毒載體向胎豬成纖維細(xì)胞中導(dǎo)入hOCT4、hSOX2、hKLF4和hC-MYC四個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，在小鼠胚胎成纖維細(xì)胞上培養(yǎng)22 d后得到豬iPSCs，該iPSCs具有正常核型，表達(dá)豬OCT4、NANOG和SOX2等多能標(biāo)志物，有較高端粒酶活性，且在體內(nèi)外均有分化成三胚層的能力。2010年，West等［46］將6種 人 轉(zhuǎn) 錄 因 子（POU5F1、SOX2、NANOG、KLF4、LIN28和C-MYC）導(dǎo)入豬間充質(zhì)細(xì)胞中，使其重編程為iPSCs。利用該iPSCs得到的嵌合體豬，80%都能嵌合到3個(gè)胚層的多種組織類型，嵌合率高。2012年，F(xiàn)ujishiro等［13］同樣將4個(gè)轉(zhuǎn)錄因子（OSKM）導(dǎo)入豬胚胎成纖維細(xì)胞中，通過(guò)在培養(yǎng)基中加入pLIF和forskolin兩種細(xì)胞因子，第一次培養(yǎng)出類似于小鼠ESCs初始態(tài)的豬iPSCs。2013年，賴良學(xué)課題組［47］通過(guò)讓豬iPSCs自發(fā)分化和加入組蛋白去乙?；敢种苿┑姆椒?，提高豬iPSCs作為供體細(xì)胞的核移植發(fā)育到囊胚的概率，且將這些iPSCs重構(gòu)胚胎移植到代孕母豬中，成功獲得健康克隆豬。2017年，韓建永課題組發(fā)現(xiàn)豬iPSCs向生殖細(xì)胞樣細(xì)胞誘導(dǎo)分化的方法，所得到的細(xì)胞不僅表達(dá)DAZL和VASA等生殖細(xì)胞標(biāo)志基因，還可繼續(xù)分化成精原干細(xì)胞樣細(xì)胞［14］?，F(xiàn)階段，豬iPSCs的研究水平和深度已遠(yuǎn)超豬ESCs，且豬成體細(xì)胞不像ESCs那樣稀少，取材更加便利，因此豬iPSCs比豬ESCs更適合應(yīng)用到地方豬種質(zhì)資源的保護(hù)中。利用瀕危地方豬種成體細(xì)胞誘導(dǎo)出的iPSCs可分化成配子，放入地方豬種配子庫(kù)中繼續(xù)保存，又可結(jié)合核移植技術(shù)獲得新生仔豬，擴(kuò)大瀕危地方豬種的種群數(shù)量。相比于其他保種方法，誘導(dǎo)多能干細(xì)胞技術(shù)在地方豬種質(zhì)資源保護(hù)方面可發(fā)揮更大用處。

3.2 多能干細(xì)胞作供體細(xì)胞的核移植技術(shù)的應(yīng)用

豬體細(xì)胞核移植（Somatic cell nuclear transfer，SCNT）已被廣泛應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因豬生產(chǎn)中，但該方法效率仍然很低。2009年，Oback等［48］發(fā)現(xiàn)利用早期細(xì)胞會(huì)導(dǎo)致SCNT后胚胎發(fā)育率增加，因此推測(cè)，多能干細(xì)胞可能會(huì)增加SCNT的效率。2012年，劉忠華課題組分別利用小鼠ESCs和胚胎成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)而來(lái)的iPSCs作為供核細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)供核細(xì)胞的細(xì)胞周期對(duì)核移植后胚胎發(fā)育過(guò)程有重要影響，把供核細(xì)胞阻滯在M期能大幅提高克隆胚胎發(fā)育率，最終得到克隆小鼠并能產(chǎn)生后代［49］。此類實(shí)驗(yàn)在豬上也有涉及。2017年，Secher等［50］發(fā)現(xiàn)用豬多能干細(xì)胞代替體細(xì)胞進(jìn)行核移植，胚胎發(fā)育到囊胚的個(gè)數(shù)增加，更有利于提高核移植效率，最終得到克隆豬的數(shù)量和質(zhì)量都有所增加。由此可見，將干細(xì)胞作為核移植的供體細(xì)胞，會(huì)比普通體細(xì)胞核移植產(chǎn)生更好的效果，因?yàn)楦杉?xì)胞比體細(xì)胞更接近囊胚中的表觀遺傳狀態(tài)，所需的重編程更少［50］。干細(xì)胞作為供體細(xì)胞的核移植有望成為拯救瀕危地方豬種最有效的方法，利用該技術(shù)可以得到更多優(yōu)質(zhì)仔豬，使地方豬種種群數(shù)量進(jìn)一步擴(kuò)大，遺傳資源得到保存。

3.3 成體干細(xì)胞誘導(dǎo)分化技術(shù)的應(yīng)用

ASCs中，骨髓干細(xì)胞、皮膚干細(xì)胞、胰腺干細(xì)胞以及人的羊水干細(xì)胞都已被證實(shí)可向配子分化［51］。由于皮膚干細(xì)胞數(shù)量豐富，取材便利，因此皮膚干細(xì)胞向配子分化的研究備受關(guān)注。2001年，Toma等［52］將小鼠皮膚分離培養(yǎng)后得到一種具有多向分化能力的ASCs，其在體外條件下能向神經(jīng)細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞等分化。2004年，Dyce等［53］第一次從胎豬上分離出皮膚來(lái)源干細(xì)胞，該細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)祖細(xì)胞標(biāo)記基因Nestin，以及多能性相關(guān)基因OCT4和STAT3，并能誘導(dǎo)分化成神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和脂肪細(xì)胞樣細(xì)胞，2006年，Dyce等［54］又使用豬卵泡液成功誘導(dǎo)胎豬皮膚干細(xì)胞分化為具有透明帶樣結(jié)構(gòu)的卵母細(xì)胞，誘導(dǎo)形成的卵母細(xì)胞表達(dá)DAZL和VASA等生殖細(xì)胞標(biāo)記基因，且能分泌卵巢類固醇激素，并可孤雌激活形成囊胚。2011年，沈偉與Dyce分析由胎豬皮膚干細(xì)胞分化的卵母細(xì)胞樣細(xì)胞時(shí)發(fā)現(xiàn)，一部分細(xì)胞處于減數(shù)分裂I期，且在H19基因5'端的DMR1區(qū)域與體內(nèi)卵母細(xì)胞有相似的甲基化模式［55］。同年，Song等［56］從胎豬皮膚和脂肪中分離出ASCs，并用豬卵泡液誘導(dǎo)其分化成卵母細(xì)胞樣細(xì)胞，該細(xì)胞在形態(tài)、堿性磷酸酶活性、細(xì)胞周期狀態(tài)和各種細(xì)胞表面標(biāo)記物的表達(dá)方面均與體內(nèi)卵母細(xì)胞有相似的特征。由以上研究看出，豬皮膚來(lái)源干細(xì)胞向原始生殖細(xì)胞和卵母細(xì)胞分化是可行的。精原干細(xì)胞（Spermatogonia stem cells，SSCs）作為雄性體內(nèi)唯一可將遺傳物質(zhì)傳遞給后代的細(xì)胞，也是一種ASCs［57］。2011年，Sato等［58］將小鼠SSCs在離體的培養(yǎng)條件下分化為可育精子。2018年，盧克煥課題組在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入敲除血清替代品（Knockout serum replacement，KSR）和誘導(dǎo)因子，將豬SSCs在體外條件下培養(yǎng)至減數(shù)分裂后期，并表達(dá)STRA8和SCP3等減數(shù)分裂標(biāo)志物，距離得到成熟精子僅一步之遙［59］。在地方豬種干細(xì)胞庫(kù)中，如能收集瀕危地方豬種的ASCs，即可通過(guò)分化獲得大量配子，進(jìn)而達(dá)到拯救瀕危地方豬種的目的。同時(shí)，配子發(fā)生過(guò)程中的減數(shù)分裂遺傳重組可豐富物種進(jìn)化過(guò)程中的遺傳多樣性，相較于體細(xì)胞核移植產(chǎn)生的單一基因型后代，由配子受精產(chǎn)生的仔豬更有利于瀕危種群的繁衍。

4 總結(jié)與展望

豬ESCs、iPSCs和ASCs向配子分化技術(shù)及核移植技術(shù)已處于可應(yīng)用階段，我國(guó)學(xué)者已證實(shí)，通過(guò)干細(xì)胞與核移植技術(shù)相結(jié)合得到健康仔豬。雖然目前豬干細(xì)胞分化得到的配子樣細(xì)胞還不具備受精發(fā)育成新個(gè)體的能力，但干細(xì)胞技術(shù)作為地方豬種質(zhì)資源保護(hù)的新手段，為更好地保留我國(guó)瀕臨滅絕的地方豬種的優(yōu)質(zhì)生物資源提供了新思路?，F(xiàn)階段，須加快建立地方豬種質(zhì)資源干細(xì)胞庫(kù)，豐富對(duì)地方豬種遺傳資源的保護(hù)手段。干細(xì)胞庫(kù)可與配子庫(kù)、胚胎庫(kù)、基因庫(kù)等一起，形成多層次、多角度，全方位的遺傳資源保存體系。