丁萌楠，宋倫

軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院 軍事認知與腦科學(xué)研究所，北京 100850

晝夜節(jié)律是生命活動表現(xiàn)為以大致24 h 為周期的振蕩規(guī)律現(xiàn)象，涉及機體的呼吸、代謝、免疫、心血管、運動、生殖等多系統(tǒng)功能調(diào)控。晝夜節(jié)律產(chǎn)生和維持的遺傳學(xué)基礎(chǔ)依賴于中樞和外周生物鐘系統(tǒng)。在哺乳動物中，位于下丘腦的視交叉上核（suprachiasmatic nucleus，SCN）的中樞生物鐘作為晝夜節(jié)律主起搏器，通過接受光信號來啟動生物晝夜節(jié)律；外周生物鐘存在于全身大多數(shù)外周組織中，可接受中樞生物鐘控制，也可獨立于SCN 而自主運行，調(diào)控與各組織特異性功能相關(guān)的基因表達。本文將著重闡述晝夜節(jié)律及生物鐘系統(tǒng)對卵巢組織器官功能的影響及其在一些女性生殖相關(guān)疾病中的調(diào)控作用。

1 哺乳動物生物鐘基因的調(diào)控

晝夜節(jié)律的產(chǎn)生和維持受生物鐘基因調(diào)控。哺乳動物細胞中的生物鐘分子調(diào)控系統(tǒng)是由十多個生物鐘基因形成的負反饋轉(zhuǎn)錄翻譯環(huán)路，包括bmal1、clock、cry、per、rev-erbα、rorα、dbp、tef、hlf等。bmal1基因編碼一種具有堿性螺旋-環(huán)-螺旋/PAS 結(jié)構(gòu)域（bHLH/PAS）的轉(zhuǎn)錄因子家族蛋白質(zhì)，可以與CLOCK 蛋白結(jié)合形成BMAL1/CLOCK 異二聚體。在白天，轉(zhuǎn)錄因子BMAL1/CLOCK 異二聚體進入細胞核結(jié)合到生物鐘基因per（per1，per2和per3）和cry（cry1和cry2）上游啟動子的E-box 元件并激活其轉(zhuǎn)錄。per和cry被不斷地轉(zhuǎn)錄和翻譯，致使細胞質(zhì)中的PER 和CRY 蛋白不斷積累，并與酪蛋白激酶 I（CKIδ 和 CKIε）和AMP 活化蛋白激酶（AMPK）相互作用。在夜晚開始時，PER 和CRY 復(fù)合物轉(zhuǎn)移至細胞核，與bmal1和clock的啟動子區(qū)域的D-box 元件結(jié)合，發(fā)揮負性調(diào)節(jié)功能并抑制bmal1和clock的轉(zhuǎn)錄。而后隨著 PER 和 CRY 在 CKIδ和 CKIε催化作用下發(fā)生磷酸化和泛素化修飾反應(yīng)并被進一步降解，它們對bmal1和clock的轉(zhuǎn)錄抑制作用逐漸消失，BMAL1/CLOCK 異二聚體可以再次表達從而啟動新的轉(zhuǎn)錄 循環(huán)[1-2]。 同時 ，CLOCK 和 BMAL1 二 聚體 還能結(jié)合核受體基因Rev-erbα/β和RORα/β啟動子上的E-box 元件，促進其基因轉(zhuǎn)錄，來啟動生物鐘基因轉(zhuǎn)錄翻譯震蕩（transcriptional translational oscil?lator，TTO）機制的輔助環(huán)路。Rev-erbα/β和RORα/β轉(zhuǎn)錄翻譯的 REV-ERBα/β和 RORα/β蛋白競爭結(jié)合bmal1啟動子區(qū)的受體應(yīng)答元件（orphan re?ceptor response element，RORE）。其中 ROR 蛋白促進bmal1轉(zhuǎn)錄，而 REV-ERBα/β蛋白抑制bmal1轉(zhuǎn)錄，因而產(chǎn)生對生物鐘主環(huán)路的另一層次調(diào)控作用[3]。

除了以上核心生物鐘基因以外，還有一些鐘控基因（clock controlled genes，CCG）組成了另外一條潛在的轉(zhuǎn)錄調(diào)控環(huán)路，包括E4BP4（E4 pro?moter-binding protein 4）、DBP（albumin D-sitebinding protein）、HLF（hepatic leukemia factor）、TEF（thyrotroph embryonic factor）轉(zhuǎn)錄因子家族。其中，Dbp是BMAL1/CLOCK 異二聚體的直接靶基因，E4bp4是REV-ERBs 的直接靶基因，它們可通過 D-box 調(diào)控per基因的表達[5]。HLF 也表達出明顯的晝夜節(jié)律循環(huán)相關(guān)性，并且作為該過程的輸出調(diào)節(jié)劑，HLF 可以調(diào)節(jié)多方面保守的轉(zhuǎn)錄程序，其功能是抑制細胞死亡[6]。

2 生物鐘基因與卵巢功能調(diào)控

卵巢包括2 個基本功能：一是卵母細胞的發(fā)育以及排卵；二是分泌與卵巢功能相關(guān)的固醇類激素，并為之后受精和胚胎著床提供有利的生殖系統(tǒng)環(huán)境。

2.1 生物鐘參與卵泡發(fā)育

卵泡作為卵巢的基本結(jié)構(gòu)和功能單位，經(jīng)過一系列的發(fā)育過程（歷經(jīng)原始卵泡、初級卵泡、次級卵泡、有腔卵泡、排卵前卵泡），最后卵泡破裂，開始排卵。許多研究表明，生物鐘與卵泡發(fā)育之間存在相關(guān)性[7]。原始和初級卵泡中不存在生物鐘基因表達的節(jié)律，但是一旦卵泡開始發(fā)育到達早期階段，尤其是接近排卵前階段時，生物鐘基因表達的節(jié)律會變得穩(wěn)定[8]。隨著研究的逐步深入，有研究者在探討生物鐘蛋白在小鼠發(fā)情卵巢卵泡成熟過程中的作用時，發(fā)現(xiàn)了卵泡發(fā)育的4個階段（原始、初級、次級和黃體）在光照和黑夜周期條件下bmal1、clock、cry1、cry2、per1和per2等生物鐘基因的震蕩表達變化。隨著卵巢卵泡成熟，生物鐘蛋白的正反饋成分（BMAL1、CLOCK）和負反饋成分（CRY1、CRY2、PER1 和 PER2）均發(fā)生變化[9]。與此相對應(yīng)，哺乳動物卵巢功能受晝夜節(jié)律調(diào)控。例如生物鐘可調(diào)節(jié)成熟卵母細胞的募集和釋放。當卵泡被募集用于生長時，卵泡中的顆粒細胞和卵泡膜細胞等也經(jīng)歷一系列生物鐘基因轉(zhuǎn)錄和翻譯震蕩活動。其中生物鐘基因bmal1、clock、per1、cry1直到植入前胚胎時期都可在卵母細胞中穩(wěn)定表達[10]。per1、per2和bmal1基因在大鼠卵巢的卵泡內(nèi)顆粒細胞和卵泡膜細胞中節(jié)律性表達。在卵泡募集后生長中的卵泡（直徑 7～8 mm）顆粒細胞中，clockmRNA 表達增加，并且卵泡刺激素刺激了從小卵泡分離的顆粒細胞中clock基因的表達[11]。另外，clock和per2在人卵巢的有腔卵泡中表達，敲低這2 個生物鐘基因會抑制用卵泡刺激素處理后的顆粒細胞功能，包括細胞增殖、類固醇產(chǎn)生和促黃體生成素受體表達。而卵泡的發(fā)育離不開顆粒細胞的營養(yǎng)支持，顆粒細胞分泌的細胞因子和營養(yǎng)物質(zhì)可通過細胞之間的間隙鏈接來調(diào)控卵母細胞生長、發(fā)育及成熟，因此顆粒細胞的功能受到影響進而也會引起卵泡發(fā)育障礙[12]。此外，clock和per2還被證實分別與從募集到優(yōu)勢卵泡選擇階段和從選擇階段到排卵階段的卵泡發(fā)育有關(guān)[11]。

2.2 生物鐘參與排卵

卵巢生物鐘與卵巢對促性腺激素的反應(yīng)性和排卵存在一定關(guān)系。通常，SCN 區(qū)的中樞生物鐘會驅(qū)動促性腺激素釋放激素（gonadotropinre?leasing hormone，GnRH）的節(jié)律釋放，GnRH 會刺激垂體前葉釋放的卵泡刺激素（follile-stimulating hormone，F(xiàn)SH），F(xiàn)SH 刺激卵泡的生長和成熟，并且GnRH 的節(jié)律釋放還刺激了發(fā)情前的促黃體生成素（luteinizing hormone，LH）分泌，而LH 排卵前激增可導(dǎo)致卵泡破裂及排卵。因此，卵巢對LH的敏感性也呈現(xiàn)24 h 的周期變化。早先有研究認為，卵巢中的生物鐘和排卵時間之間的聯(lián)系可能涉及前列腺素信號的參與。其中，顆粒細胞對LH 反應(yīng)的重要步驟之一是前列腺素水平的升高，包括前列腺素 E2（prostaglandin E2，PGE2）和前列腺素 F2α（prostaglandin F2α，PGF2α）。環(huán)氧化酶 2（cyclooxygenase-2，COX2）為前列腺素合成的限速酶，由于其基因ptgs2啟動子區(qū)存在E-box結(jié)合位點，因此COX2 的表達受BMAL1/CLOCK 復(fù)合物調(diào)控，這是生物鐘基因表達改變可能影響到卵巢排卵過程的潛在機制[13]。生物鐘影響嚙齒動物排卵所需的LH 激增還表現(xiàn)在排卵會在每個動情周期的同一時間發(fā)生[14]。另外，類固醇激素（例如LH、FSH）也會對核心生物鐘基因的表達產(chǎn)生影響，比如LH 誘導(dǎo)顆粒細胞中生物鐘基因bmal1、clock及per2的震蕩表達，LH 和 FSH 均激活未成熟的大鼠顆粒細胞中per2的振蕩表達[15-16]。此外還有研究表明，在雌性哺乳動物中，排卵的時間取決于由成熟卵母細胞產(chǎn)生的高循環(huán)雌二醇和位于視交叉上核中的生物鐘提供的每日信號所導(dǎo)致的短暫LH 激增，并且已有實驗檢測到下丘腦和垂體生物鐘基因表達的節(jié)律；也就是說，卵巢生物鐘和SCN 及下丘腦-垂體-卵巢（hy?pothalamo pituitary ovary axis，HPO）軸上各生物鐘同步協(xié)調(diào)才能保證正常排卵[17]。Kisspeptin（Kiss1）是下丘腦調(diào)節(jié)GnRH 分泌的重要神經(jīng)內(nèi)分泌多肽，是生殖功能的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。前腹側(cè)室旁核AVPV Kiss1 神經(jīng)元具有控制LH 峰出現(xiàn)的功能。研究發(fā)現(xiàn)，前腹側(cè)室旁核AVPV 中生物鐘基因per1、bmal1的表達具有節(jié)律震蕩特征，因此推測前腹側(cè)室旁核AVPV 可能存在節(jié)律震蕩器感受SCN 信號，并控制Kiss1 的釋放時間[18]。Kiss1還被證實在人類和嚙齒動物的不同卵巢區(qū)室中表達，并且受促性腺激素的控制，卵巢Kiss1 和Kiss1 受體在大鼠的排卵和動情周期的調(diào)節(jié)中發(fā)揮關(guān)鍵作用[19]。上述證據(jù)表明，下丘腦、垂體和卵巢一起形成晝夜節(jié)律振蕩生殖軸，并形成了卵巢各種生殖功能維持的重要機制。

2.3 生物鐘參與類固醇激素生成

雌二醇（estrogen，E2）和FSH 是顆粒細胞增殖和分化的協(xié)同刺激激素，F(xiàn)SH 可通過誘導(dǎo)細胞色素 P450 芳 香 酶（cytochrome P450 aromatase，cyp19）mRNA 表達誘導(dǎo)產(chǎn)生 E2。而孕酮（proges?terone，PG）和PGE 是排卵和黃體化的必需激素，COX2、細胞色素 P450 家族 scc（cytochrome P450 scc11，CYP11A)、固 醇合成 急性調(diào) 節(jié)蛋 白（ste?roidogenie acute regulatory protein，STAR）和 3-β羥類固醇脫氫酶（3β-hydroxysteroid dehydroge?nase deficiency，3β-HSD）都是 PGE 和 PG 合成所需的關(guān)鍵酶，LH 可顯著增加關(guān)鍵酶相關(guān)基因表達[20]。研究發(fā)現(xiàn)，小鼠的bmal1基因敲除會出現(xiàn)STAR 功能障礙，繼而類固醇激素合成減少，導(dǎo)致雌雄鼠的不孕不育[13]。雌鼠bmal1表達的下調(diào)會影響卵巢黃體細胞中與PG、PGE 合成相關(guān)的基因表達，并且卵巢顆粒細胞中bmal1的缺失破壞了PG 的產(chǎn)生，并隨后導(dǎo)致雌性小鼠的植入失敗[21]。因此有研究者認為，卵巢bmal1基因調(diào)控類固醇激素和前列腺素的合成，因此懷孕的bmal1敲除小鼠具有比野生型小鼠更低的孕酮血清水平以及胚胎生存率，受損的類固醇生成似乎成為生物鐘基因突變體中的常見問題[22]。同時研究表明，生物鐘基因per2和clock參與顆粒細胞中類固醇產(chǎn)生，clock與顆粒細胞中 E2 產(chǎn)生和lhrmRNA 和cyp19a1mRNA 表達的誘導(dǎo)有關(guān)。2 個生物鐘基因per1和per2及其基因產(chǎn)物在大鼠卵巢的顆粒細胞和卵泡膜細胞中表達，并且顯示出24 h 的節(jié)律性。per2且與雌性動物的生殖過程和動情周期相關(guān)，可通過抑制CLOCK/BMAL1 異二聚體來抑制STAR 表達進而抑制黃體酮產(chǎn)生[23]。CRY 在卵巢中也可能發(fā)揮重要生理功能，可通過調(diào)節(jié)類固醇激素的合成或通過轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)控制發(fā)情周期[24]。人卵巢顆粒細胞中生物鐘基因調(diào)控與人卵巢類固醇生成的相關(guān)性也有報道[15]。有研究證明，人類顆粒細胞中所有已知生物鐘的存在，隨著年齡的增長，晝夜節(jié)律的逐漸破壞可能會導(dǎo)致人卵巢黃體中類固醇生成的失調(diào)[25]。以上研究結(jié)果說明卵巢生物鐘系統(tǒng)與類固醇激素的生成存在關(guān)聯(lián)性，生物鐘基因的擾動或敲除可影響類固醇的生成及相關(guān)基因的表達。

3 卵巢生物鐘與女性生殖系統(tǒng)疾病

3.1 繁殖力下降及流產(chǎn)率增加

眾所周知，卵巢鐘的慢性破壞可對嚙齒動物模型和輪班工作的女性生殖功能和生育能力產(chǎn)生負面影響。生物鐘基因單個基因的缺失或突變不僅導(dǎo)致晝夜節(jié)律性中斷，而且還導(dǎo)致雌性生殖功能受損。bmal1 null小鼠雖有發(fā)情周期，但往往是不規(guī)則的，且卵巢小于野生型小鼠，會出現(xiàn)胚胎植入失敗。另外，早在2010 年就有研究表明生物鐘基因bmal1中的多態(tài)性會增加流產(chǎn)的百分比，并且卵巢顆粒細胞或卵泡膜細胞中bmal1基因的條件性敲除會導(dǎo)致排卵和植入失敗[26]；per1和per2基因突變小鼠可懷孕，但與野生型小鼠相比，成功分娩和斷奶的幼仔數(shù)量減少[14]；clock突變小鼠很少懷孕，它們具有高的胎兒重吸收率和嚴重的難產(chǎn)，胎兒表現(xiàn)出形態(tài)異常，并且有研究者用小發(fā)夾RNA（shRNA）方案在體外和體內(nèi)特異性敲低clock基因表達，發(fā)現(xiàn)會導(dǎo)致細胞凋亡以及繁殖能力下降，從而增加流產(chǎn)風險[27]。

3.2 多囊卵巢綜合征

多囊卵巢綜合征（polycystic ovarian syndrome，PCOS）是生育年齡婦女最常見的內(nèi)分泌疾病。最近的一項研究強調(diào)了生物鐘基因在PCOS 發(fā)展中的重要作用，并且研究表明PCOS 組女性顆粒細胞BMAL1 表達水平低于無PCOS 組。高雄激素血癥是PCOS 的一個標志性特征，并且與該疾病的發(fā)生密切相關(guān)。高雄激素血癥可影響晝夜節(jié)律基因per2表達，以及影響類固醇生成相關(guān)基因star的表達，從而導(dǎo)致顆粒細胞中類固醇激素生成的紊亂，導(dǎo)致PCOS 的發(fā)展[28-29]。

3.3 卵巢癌

晝夜節(jié)律同樣影響細胞周期及細胞分裂，并在腫瘤的惡性轉(zhuǎn)化中具有重要的調(diào)控作用[30]。卵巢癌是女性第四大常見惡性腫瘤，并且是婦科惡性腫瘤死亡的主要原因。與正常卵巢細胞相比，卵巢癌細胞中的生物鐘基因發(fā)生明顯改變，例如PER1、PER2、CRY2 和 CLOCK 的表達顯著降低。與此同時，通過操控生物鐘基因的表達也可以影響腫瘤治療效果。大量研究表明，bmal1的過表達抑制卵巢癌細胞生長并增強其對化療藥物順鉑的反應(yīng)敏感性；而抑制clock基因表達會影響抗藥蛋白表達來達到逆轉(zhuǎn)卵巢癌細胞系的順鉑耐藥性的目的[31]。

3.4 感染性疾病

革蘭陰性菌會引起女性生殖道上行感染，進而導(dǎo)致女性盆腔炎（pelvic inflammatory disease，PID）的發(fā)生。脂多糖（LPS）是革蘭陰性細菌外膜的主要成分，可以干擾正常的卵巢功能，而且LPS也會擾亂生物鐘節(jié)律，進而影響卵巢功能變化。通過腹膜內(nèi)注射LPS 可導(dǎo)致血液中炎性細胞因子如白細胞介素（IL-6）和腫瘤壞死因子α（TNF-α）表達水平升高，其中Rev-erbα調(diào)節(jié)IL-6 的表達，并且TNF-α的表達可表現(xiàn)出由生物鐘基因（bmal1、clock）調(diào)控的晝夜節(jié)律振蕩性[32]，而TNF-α和IL-6會抑制體外培養(yǎng)的顆粒細胞中CYP19A1 和LHR的表達，說明LPS 可能通過影響顆粒細胞或卵泡膜細胞的功能來誘導(dǎo)卵巢功能障礙。此外研究還發(fā)現(xiàn)了LPS 通過抑制小鼠卵巢中per2的表達進而抑制CYP19A1 和LHR 表達并干擾正常的卵巢功能[33]。這些研究結(jié)果有助于了解生物鐘在調(diào)節(jié)哺乳動物卵巢病理生理功能中的貢獻。

4 結(jié)語

哺乳動物卵巢生物鐘在雌性生殖系統(tǒng)功能正常發(fā)揮過程中具有重要作用。卵巢生物鐘作為外周生物鐘，受到SCN 區(qū)中樞生物鐘的控制，并且需要HPO 軸上各生物鐘的協(xié)調(diào)同步運行，才能保證正常的生殖功能。通過近十年的研究，對哺乳動物生物鐘在促性腺激素分泌、卵泡成熟、卵巢類固醇激素產(chǎn)生、排卵、子宮植入和分娩、哺乳過程等的貢獻有了初步了解，并形成了指導(dǎo)臨床生殖系統(tǒng)疾病治療的新思路。目前，從時間生物學(xué)角度來調(diào)節(jié)HPO 軸的生物鐘功能被認為是治療常見生育障礙的新途徑，特別是那些由慢性晝夜節(jié)律破壞引起的生育障礙。未來，將生物鐘作為提高生育率或改善復(fù)雜生育障礙的可行性手段仍有巨大的開發(fā)潛力。