基于液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)的環(huán)二核苷酸cGAMP定量檢測(cè)方法的建立與評(píng)估

郭增林，韓秋影，毛劼，王娜，周濤，陳媛

國(guó)家生物醫(yī)學(xué)分析中心，北京 100850

病毒感染是人類面臨的重大健康威脅之一。近年來(lái)重大疫情的產(chǎn)生多與病毒感染相關(guān)，如SARS 病毒、寨卡病毒、諾如病毒等。目前，對(duì)大多數(shù)病毒的感染，仍缺乏有效治療手段，難以應(yīng)對(duì)病毒感染所導(dǎo)致的嚴(yán)重后果。因此，從病毒感染的共性機(jī)制入手，尋找有效的抗病毒策略，將可能為預(yù)防病毒感染、治療相關(guān)疾病提供新的思路。

病毒感染細(xì)胞后，在胞內(nèi)釋放其核酸物質(zhì)（DNA 或RNA）。正常生理?xiàng)l件下，機(jī)體可以快速識(shí)別并清除這些外來(lái)核酸物質(zhì)。研究表明，環(huán)鳥(niǎo)苷酸-腺苷酸（cyclic GMP-AMP，cGAMP）合成酶（cGAMP synthase，cGAS）是細(xì)胞質(zhì)內(nèi)核酸物質(zhì)DNA 的感受器。cGAS 與胞質(zhì)中的DNA 結(jié)合后，催化腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）和鳥(niǎo)嘌呤核苷三磷酸（GTP）合成環(huán)二核苷酸 cGAMP[1-2]，cGAMP 作為第二信使結(jié)合接頭蛋白質(zhì)STING 后[3-4]，磷酸化TBK1 和 IRF3[5-6]，促進(jìn)β干擾素（IFN-β）產(chǎn)生，并激活NF-κB 信號(hào)通路，從而發(fā)揮清除病毒感染、維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)的作用[7-8]。cGAMP 作為cGAS 的直接產(chǎn)物，其表達(dá)量可以指征cGAS 的激活情況。目前，仍缺乏行之有效的檢測(cè)細(xì)胞中cGAMP 的手段，因此需要建立快速準(zhǔn)確的定量檢測(cè)方法。

液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)近年來(lái)進(jìn)展較大。該技術(shù)是高效液相色譜和質(zhì)譜技術(shù)的結(jié)合，具有選擇性強(qiáng)、靈敏度高、準(zhǔn)確性好等特點(diǎn)[9-10]，是目前公認(rèn)最好的復(fù)雜樣品分析技術(shù)之一，已廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)藥、食品安全、環(huán)境科學(xué)、臨床等眾多領(lǐng)域[11-12]，成為現(xiàn)代分析方法中必不可少的組成成分。

本研究基于液相色譜-質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(cè)技術(shù)（liquid chromatography-mass spectrometry/multiple reaction monitoring，LC-MS/MRM），建立了 cGAMP的定量分析方法，為進(jìn)一步探討cGAS 的功能調(diào)控機(jī)制提供有力的技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

組織細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞U937 來(lái)自本實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞庫(kù)；RPMI1640 培養(yǎng)基（邁晨公司）；optiMEM 培養(yǎng)基（Gibco 公司）；鯡魚(yú)精DNA（HT-DNA）、佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯（PMA）（Sigma 公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa 公司）；IRF3、p-IRF3、βactin 單克隆抗體（Abcam 公司）；轉(zhuǎn)染試劑 Li?po2000（Invitrogen 公司）；SYBR Green 熒光定量試劑盒（ABI 公司）；TRIzol Reagent、乙腈（Thermo?Fisher 公司）；Qtrap6500 三重四極桿質(zhì)譜儀；Ther?mo Ultimate 3000 雙三元液相色譜儀。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

U937 細(xì)胞系在含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，恒溫培養(yǎng)箱設(shè)定參數(shù)為37℃、5%CO2。根據(jù)細(xì)胞狀態(tài)和密度，進(jìn)行細(xì)胞傳代或其他實(shí)驗(yàn)。

1.3 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，設(shè)定對(duì)照組（僅轉(zhuǎn)染試劑）和HT-DNA 刺激組（轉(zhuǎn)染試劑和HT-DNA），按3×105/孔的密度接種于 24 孔板，加 PMA 后于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h 使細(xì)胞分化。分化后，根據(jù)轉(zhuǎn)染試劑使用說(shuō)明書(shū)推薦的體系進(jìn)行HT-DNA 轉(zhuǎn)染，刺激6 h 后收樣。

1.4 RNA提取及熒光實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)

TRIzol 法提取細(xì)胞總RNA，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。將熒光實(shí)時(shí)定量PCR（qRT-PCR）反應(yīng)體系在96 孔板中混勻，每個(gè)樣本和待測(cè)目的基因設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，800 r/min 離心5 min，于熒光實(shí)時(shí)定量PCR 儀中反應(yīng)（反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性 5 min，95℃變性 15 s，60℃退火30 s，72℃延伸 1 min，共 40 個(gè)循環(huán)）。2-ΔΔCt表示目的基因在對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組中表達(dá)的倍比關(guān)系。引物信息見(jiàn)表1。

1.5 蛋白質(zhì)提取及蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)

吸去24 孔板中的培養(yǎng)基，用PBS 緩沖液洗滌2 次，加入細(xì)胞裂解液后，4℃混旋 30 min，4℃、15 000 r/min 離心20 min，收集上清，加入上樣緩沖液，沸水煮樣后進(jìn)行SDS-PAGE，采用濕轉(zhuǎn)方式進(jìn)行轉(zhuǎn)印，室溫封閉1 h，在4℃條件下用一抗（1∶1000）孵育過(guò)夜，次日從4℃條件下取出膜，TBST緩沖液洗膜3 次，每次5 min，室溫孵育二抗（1∶5000）1 h，再 用 TBST 緩沖液 洗 膜 3 次 ，每 次 5 min，顯影。β-actin 作為內(nèi)參。

表1 定量PCR引物信息

1.6 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)檢測(cè)cGAMP含量

吸去24 孔板中的培養(yǎng)基，PBS 緩沖液洗滌2次，加入萃取液（甲醇∶乙腈∶水按體積比4∶4∶2配制），用細(xì)胞刮刀輕輕將黏附在孔板上的細(xì)胞刮下來(lái)，收集至1.5 mL 離心管中，做好標(biāo)記，并于-20℃條件下靜置 30 min，4℃、15 000 r/min 離心20 min，收集上清液，于真空干燥儀中干燥。用終濃度為10 mmol/L 的醋酸銨溶液稀釋商品化的cGAMP，作為標(biāo)準(zhǔn)樣品；用同樣濃度的醋酸銨溶解干燥的樣品，4℃、15 000 r/min 離心 10 min，收集上清，通過(guò)液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)進(jìn)行定量分析。

色譜儀為T(mén)hermo Ultimate 3000；色譜柱為EC 150/2.0 NUCLEODUR C18 Pyramid（3 μm）；流動(dòng)相A 相為0.2%甲酸-水溶液，B 相為乙腈；流速0.4 mL/min，柱溫35℃，進(jìn)樣量5 μL。在該流動(dòng)相條件下，每個(gè)樣品在8 min 內(nèi)分析完成。

質(zhì)譜離子源為電噴霧離子源（ESI），檢測(cè)方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM），離子化方式為正離子掃描。離子源參數(shù)：氣簾氣20 psi，噴霧電壓5500 V，霧化溫度 550℃，霧化氣 65 psi，輔助氣 65 psi，去簇電壓90 V，攝入電壓7 V，定量離子對(duì)母離子/子離子為675/524，定性離子對(duì)母離子/子離子為675/506、675/136。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS16.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，2組間數(shù)據(jù)的比較采用Studentt檢驗(yàn)，當(dāng)P＜0.05 時(shí)認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 cGAMP定量標(biāo)準(zhǔn)曲線方程的建立

首先，我們對(duì)商品化的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行定量檢測(cè)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。用終濃度為10 mmol/L的醋酸銨溶液稀釋商品化的cGAMP 后上機(jī)檢測(cè)。如圖1 所示，橫軸為cGAMP 保留時(shí)間，縱軸表示離子強(qiáng)度（counts per seconds，cps），標(biāo)準(zhǔn)品cGAMP 濃度分別為 1、5、10、25、50、100 ppb（part per billion），1 ppb=1 μg/L。圖中 cGAMP 標(biāo)準(zhǔn)品滯留時(shí)間為4 min 且無(wú)明顯雜峰干擾，表明該方法可以對(duì)1～100 ppb 的cGAMP 進(jìn)行定量檢測(cè)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度、譜峰面積等數(shù)據(jù)，計(jì)算得到標(biāo)準(zhǔn)曲線y=2977.9x-1050.9，相關(guān)系數(shù)為1（圖2）。

2.2 細(xì)胞中cGAMP的定量檢測(cè)

cGAMP 是細(xì)胞應(yīng)對(duì)外源DNA 入侵時(shí)由cGAS合成的小分子。正常生理?xiàng)l件下，細(xì)胞內(nèi)不會(huì)產(chǎn)生cGAMP。因此，檢測(cè)活細(xì)胞產(chǎn)生的cGAMP，首先需要通過(guò)轉(zhuǎn)染外源DNA（HT-DNA）激活cGAS；再通過(guò)甲醇-乙腈萃取法，提取細(xì)胞中的cGAMP分子；將樣品干燥后，用終濃度為10 mmol/L 的醋酸銨溶液溶解樣品，上機(jī)檢測(cè)。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，HT-DNA 處理組出現(xiàn)cGAMP 譜峰（圖3），根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線定量計(jì)算，得到cGAMP 的含量為400 pg/3×105細(xì)胞，即0.0013 pg/細(xì)胞（圖4）。

2.3 生物學(xué)效應(yīng)評(píng)估

為進(jìn)一步評(píng)價(jià)該化學(xué)檢測(cè)方法的可靠性，我們對(duì)細(xì)胞中cGAMP 產(chǎn)生后的常規(guī)生物學(xué)效應(yīng)指標(biāo)進(jìn)行了檢測(cè)。干擾素調(diào)節(jié)因子3（IRF3）的磷酸化和IFN-β 的表達(dá)是cGAMP 產(chǎn)生后的下游事件。通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，將HT-DNA 轉(zhuǎn)入U(xiǎn)937 細(xì)胞，分別采用Western 印跡和實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測(cè)IRF3 的磷酸化和IFN-β1 mRNA的表達(dá)。結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染試劑對(duì)照組相比，HTDNA 誘導(dǎo)了 IRF3 的大量磷酸化（p-IRF3）；同時(shí)HT-DNA 刺激組 IFN-β1 的 mRNA 表達(dá)水平明顯升高（P＜0.0001）（圖5），這表明在 HT-DNA 刺激條件下，細(xì)胞內(nèi)合成了大量cGAMP 分子。

以上結(jié)果表明，上述化學(xué)檢測(cè)方法可以有效地對(duì)細(xì)胞內(nèi)合成的cGAMP 進(jìn)行快速、準(zhǔn)確定量，并且通過(guò)檢測(cè)下游生物學(xué)效應(yīng)，進(jìn)一步驗(yàn)證了該方法的可靠性。

3 討論

液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)在混合物分析上具有較高的靈敏度和選擇性及廣泛的適用性，并且應(yīng)用此技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)cGAMP 的含量時(shí)，前期樣品的提取、純化和濃縮等過(guò)程較為簡(jiǎn)便，便于掌握實(shí)驗(yàn)操作。同時(shí)我們?cè)诮⒃擉w系方法時(shí)，不斷優(yōu)化各項(xiàng)條件參數(shù)[12]，比如采取合適的樣品處理方法，優(yōu)化實(shí)驗(yàn)參數(shù)得到最佳色譜分析條件和質(zhì)譜分析條件，盡可能消除基質(zhì)效應(yīng)對(duì)樣品定量測(cè)定的影響；選擇多反應(yīng)檢測(cè)模式，提高信噪比，即使復(fù)雜的樣品仍可達(dá)到很高的靈敏度。由此，不僅得到了可靠性高的結(jié)果，而且檢測(cè)時(shí)間也較短，每個(gè)樣品的分析時(shí)間可以控制在8 min 以內(nèi)，快速簡(jiǎn)便。在建立檢測(cè)方法的同時(shí)，我們也對(duì)細(xì)胞中cGAMP 產(chǎn)生后的常規(guī)生物學(xué)效應(yīng)指標(biāo)進(jìn)行了檢測(cè)，如IRF3 的磷酸化、β干擾素的產(chǎn)生等，利用生物學(xué)效應(yīng)與化學(xué)檢測(cè)方法相互驗(yàn)證，證明了該方法的可靠性。cGAMP 的表達(dá)量可以特異性指征cGAS 的活性，因此基于液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對(duì)cGAMP 進(jìn)行定量檢測(cè)方法的建立，為后續(xù)深入研究cGAS 活性調(diào)控機(jī)制提供了重要手段。

圖1 cGAMP 標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)譜峰圖

圖2 cGAMP 定量標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖3 cGAMP 質(zhì)譜鑒定峰圖

圖4 cGAMP 定量計(jì)算（****P＜0.0001）

圖5 IRF3 磷酸化與IFN-β1 mRNA 的表達(dá)（****P＜0.0001）

目前，針對(duì)cGAMP 的作用和功能的研究還非常有限，尚有許多問(wèn)題亟待解決。比如cGAMP 除參與天然免疫信號(hào)通路外是否在其他通路發(fā)揮作用？細(xì)菌中的第二信使c-di-GMP 和c-di-AMP是否在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中具有相似的作用？該技術(shù)方法可實(shí)現(xiàn)更加快速、靈敏和可靠的cGAMP 檢測(cè)，為科學(xué)研究和實(shí)際應(yīng)用提供更多依據(jù)。