謝憲 梁軍，2 張銘 胡瑞瑞 程元 張星耀，2

（1. 中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院森林生態(tài)環(huán)境與保護(hù)研究所 國(guó)家林業(yè)和草原局森林保護(hù)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100091；2. 昆崳山森林生態(tài)系統(tǒng)國(guó)家定位觀測(cè)研究站，煙臺(tái) 264100）

松枯梢病是世界范圍內(nèi)針葉樹上最常見(jiàn)和分布最廣的重要病害之一。該病的病原真菌為松球殼孢菌（Sphaeropsis sapinea），主要通過(guò)傷口侵染寄主，也可從針葉氣孔侵入或直接侵染嫩梢和嫩葉，越冬芽上潛伏的病菌可導(dǎo)致翌春芽腐和枯梢［1］。Stanosz等［2］對(duì)Pinus resinosz和Pinus banksiana的研究中首次發(fā)現(xiàn)無(wú)病斑的梢和葉上存在潛伏侵染。劉艷和葉建仁［3］對(duì)多個(gè)松屬樹種進(jìn)行套袋隔離的試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)表面無(wú)病斑的梢上存在松枯梢病菌進(jìn)行越冬，可造成來(lái)年春梢發(fā)病。

植物內(nèi)生微生物在其生活史的一定階段或全部階段定殖于植物的各種組織和器官內(nèi)部，并與植物建立共生關(guān)系，其中的某些類群可以產(chǎn)生各種化學(xué)物質(zhì)，并且能通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)或其他作用來(lái)抑制或殺死某些致病菌。經(jīng)Martinez-Klimova統(tǒng)計(jì)，在植物中共分離得到具有拮抗活性或可分泌抑菌性代謝物質(zhì)的內(nèi)生真菌36屬、內(nèi)生細(xì)菌10屬，其中內(nèi)生真菌包括Basidiomycota、Ascomycota等，內(nèi)生細(xì)菌包括放線菌門、擬桿菌門、厚壁菌門和變形菌門等［4］。

本研究選取無(wú)病斑與感染枯梢病的赤松（Pinus densifloraSieb. et Zucc.）針葉為研究對(duì)象，利用高通量測(cè)序技術(shù)研究不同枯梢病發(fā)病狀態(tài)下P. densiflora針葉的內(nèi)生真菌多樣性以及群落結(jié)構(gòu)的差異，為松枯梢病的微生物防控提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 村料

1.1.1 研 究 區(qū) 概 況 昆 崳 山（121°41'34''-121°48'04''N，37°11'50''-37°17'49''E） 地 處 山 東半島東部，屬暖溫帶季風(fēng)氣候，林區(qū)土壤屬森林棕壤，以沙質(zhì)壤土為主。昆崳山是我國(guó)和東北亞P. densiflora原生地和天然分布中心，P. densiflora在該區(qū)域與落葉闊葉林共同組成地帶性天然次生林植被。共選取3塊樣地，樣地地理坐標(biāo)及海 拔 為 121°43'35.0″N，37°17'30.9″E，184 m ；121°45'08.4″N，37°17'37.8″E，124 m ；121°43'19″N，37°17'30.2″E，290 m。樣地立地條件均為中坡位，坡度為17°-26°，林分結(jié)構(gòu)均為針闊混交林，由P.densiflora和麻櫟（Quercus acutissimaCarruth.）構(gòu)成。1.1.2 樣品采集 于2018年9月在3塊樣地內(nèi)進(jìn)行采樣，分別采集樣地內(nèi)無(wú)病斑P. densiflora上無(wú)病斑針葉ZK1與染病P. densiflora上無(wú)病斑針葉ZK2、染病較輕針葉ZK3（病斑長(zhǎng)度為針葉長(zhǎng)度1/2以下）、染病較重針葉ZK4（病斑長(zhǎng)度為針葉長(zhǎng)度1/2以上）針葉，共4類。采用五點(diǎn)采樣法采集樣本，沖洗晾干后用75%乙醇浸泡1 min，無(wú)菌水沖洗3次，0.5%次氯酸鈉溶液浸泡2 min后，再用無(wú)菌水沖洗3次，樣品-20℃保存［5］。將沖洗后的無(wú)菌水稀釋至MEA培養(yǎng)基上，以確保針葉外表無(wú)真菌殘留，結(jié)果部分不再贅述。

1.2 方法

1.2.1 內(nèi)生真菌多樣性測(cè)定 利用CTAB法對(duì)樣本DNA進(jìn)行抽提，完成基因組DNA抽提后，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)［6］。將DNA樣品在冰上融化后，離心并充分混勻，Nanodrop檢測(cè)樣品質(zhì)量，取30 ng進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系：DNA樣 品，1.0 μL ；Forward Primer（5.0 μmol/L），1.0 μL ；Reverse Primer（5.0 μmol/L），1.0 μL ；BSA（2.0 ng/μL），3.0 μL ；2 × Taq Plus Master Mix，12.5 μL ；ddH2O，6.5 μL。進(jìn)行 ITS擴(kuò)增。ITS1區(qū)擴(kuò)增引物序列為（5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3'）和（5'-TGCGTTCTTCATCGATGC-3'）。

PCR采用TransGen AP221-02：TransStart Fastpfu DNA Polymerase，將同一樣本的PCR產(chǎn)物混合后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，使用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒（AXYGEN公司）切膠回收PCR產(chǎn)物，Tris-HCl洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測(cè)。擴(kuò)增產(chǎn)物采用Illumina Miseq PE300平臺(tái)，并構(gòu)建Miseq文庫(kù)以及Miseq上機(jī)測(cè)序。

1.2.2 測(cè)序數(shù)據(jù)處理與分析 OTU（Operational taxonomic units）是在系統(tǒng)發(fā)生學(xué)或群體遺傳學(xué)研究中，為了便于進(jìn)行分析，人為給某一個(gè)分類單元（品系、屬、種、分組等）設(shè)置的同一標(biāo)志。用uclust（Version 1.2.22）按照97%相似性將全部序列聚類，去除singleton的OTU，并得到代表序列和OTU表［7］。用usearch按照97%相似性序列進(jìn)行OTU聚類（不含單序列），得到代表序列再將其全部序列按照97%相似度比對(duì)到OTU上形成OTU列表［8-9］。使用Mothur軟件計(jì)算豐富度指數(shù)Chao1和多樣性指數(shù)Shannon［10］。使用R軟件（v2.15.3）繪制PCA圖。

2 結(jié)果

2.1 微生物測(cè)序數(shù)據(jù)及稀釋曲線

通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)，在12個(gè)樣品中共獲得內(nèi)生真菌有效序列433 814條，共計(jì)1 196個(gè)OTU。各樣品OTU稀釋曲線趨于平坦（圖1），樣本的Coverage測(cè)序深度指數(shù)統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果見(jiàn)表1（內(nèi)生真菌），結(jié)果顯示采集針葉樣本中覆蓋率均大于99%，說(shuō)明各樣本中的微生物物種信息被充分檢測(cè)，結(jié)果能夠代表各類針葉中內(nèi)生真菌的真實(shí)水平。

圖1 赤松樣品內(nèi)生真菌OTU稀釋曲線

2.2 赤松針葉內(nèi)生真菌的多樣性及群落結(jié)構(gòu)分析

根據(jù)真菌OTU數(shù)目，對(duì)樣品中OTU組成進(jìn)行分析，構(gòu)建Venn圖（圖2）和群落結(jié)構(gòu)柱狀圖（圖3）。Venn圖顯示，針葉中共有相同的OTU 393個(gè)，占OTU總數(shù)的32.86%，4類針葉中特有的OTU數(shù)目分別為73、88、87、53個(gè)，以ZK2中特有OTU數(shù)目最多。無(wú)病斑針葉的可注釋特有OTU及對(duì)應(yīng)屬見(jiàn)表2。

樣本內(nèi)生真菌的Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù)統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果見(jiàn)表1，ZK4的Chao1最高，即測(cè)得OTU數(shù)最高，其次分別為ZK3（病斑長(zhǎng)度為針葉長(zhǎng)度二分之一以下的P. densiflora針葉）、ZK1（無(wú)病斑P.densiflora上的針葉）、ZK2（染病P. densiflora上的無(wú)病斑針葉），隨著病害的加重，內(nèi)生真菌豐富度呈現(xiàn)出上升的趨勢(shì)。ZK1與ZK2的內(nèi)生真菌多樣性指數(shù)均高于ZK3，而之后ZK4的多樣性指數(shù)升高。

表1 不同染病級(jí)別的赤松針葉內(nèi)生真菌豐度與多樣性

表2 無(wú)病斑針葉內(nèi)生真菌特有OTU及對(duì)應(yīng)屬

對(duì)1 196個(gè)OTU序列進(jìn)行門和綱水平上的歸類，可劃分分屬13個(gè)門以及40個(gè)綱。在門水平上（圖3-A），Ascomycota占比最高，分別達(dá)到 89.01%、90.90%、95.29%、95.55%， 其 次 為Basidiomycota，分別占比7.78%、4.82%、1.85%和1.29%，Ascomycota與Basidiomycota為針葉內(nèi)生真菌中的優(yōu)勢(shì)菌群，且在樣本中的相對(duì)豐度存在差異，Ascomycota相對(duì)豐度逐漸升高，而Basidiomycota相對(duì)豐度占比下降。

圖2 不同染病級(jí)別的赤松針葉內(nèi)生真菌OTU分類Venn圖

在綱水平上（圖3-B），內(nèi)生真菌均以座囊菌綱（Dothideomycetes）相對(duì)豐度最高（32.83%-43.12%），其次相對(duì)豐度較高的還有散囊菌綱（Eurotiomycetes）（8.23%-27.83%），以及豐度較高的unidentified菌類，錘舌菌綱（Leotiomycetes）、星裂菌綱（Arthoniomycetes）在無(wú)病斑與染病針葉中均占不同的比例。ZK1、ZK2、ZK3中的Dothideomycetes相對(duì)豐度相近，均高于ZK4中所占比例；ZK1中Eurotiomycetes占比最低，Eurotiomycetes相對(duì)豐度隨著病害的嚴(yán)重程度而逐漸升高；Leotiomycetes和Arthoniomycetes分別以ZK3、ZK4中占比最高，ZK1、ZK2中相對(duì)豐度相近且較低。銀耳綱（Tremellomycetes）和外囊菌綱（Taphrinomycetes）僅在ZK1、ZK2、ZK3中占比大于1%，在ZK4中相對(duì)豐度為0。

圖3 不同染病級(jí)別的赤松針葉內(nèi)生真菌優(yōu)勢(shì)真菌門（A）、綱（B）、屬（C）組成

在屬水平上（圖3-C），相對(duì)豐度最高的屬為L(zhǎng)apidomyces，其次為Selenophoma，兩個(gè)屬的相對(duì)豐度均隨著病害的加重而減小。在無(wú)病斑針葉ZK1、ZK2中，Rhizosphaera、Fusarium、Myriangium、Genolevuria的相對(duì)豐度均高于1%，在染病針葉中相對(duì)豐度為0。而染病針葉中特有的屬有Cenangium、Arthrocatena、Trichomerium、Cladosporium、Phaeothecoidea等，其中Phaeothecoidea僅在發(fā)病較重的ZK4中占比超過(guò)1%。

2.3 赤松針葉內(nèi)生真菌Beta多樣性差異分析

基于PCA主成分分析樣品間的Beta多樣性差異評(píng)估不同染病級(jí)別的P. densiflora針葉內(nèi)生真菌的差異性，結(jié)果（圖4）表明，主成分PC1與主成分PC2的貢獻(xiàn)率分別為24.6%和20.17%，在3個(gè)樣地中，同一樣地內(nèi)的無(wú)病斑針葉距離較近，而染病后的樣本ZK4相聚較集中，說(shuō)明樣地內(nèi)P. densiflora針葉的內(nèi)生真菌存在差異，而在枯梢病的侵染下，內(nèi)生真菌的構(gòu)成趨于一致。

圖4 不同染病級(jí)別的赤松針葉內(nèi)生真菌主成分分析

3 討論

通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)，對(duì)針闊混交林內(nèi)的P.densiflora針葉內(nèi)生真菌多樣性與群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，結(jié)果表明，P. densiflora針葉內(nèi)生微生物多樣性豐富，無(wú)病斑針葉與染病針葉均為優(yōu)勢(shì)真菌為Ascomycota和Basidiomycota，無(wú)病斑針葉與染病針葉多樣性、群落結(jié)構(gòu)等方面均存在差異。

松枯梢病是針葉樹上最常見(jiàn)和分布最廣的重要病害之一。國(guó)內(nèi)對(duì)松枯梢病的研究不僅在病原發(fā)生、傳播、侵染、防治等方面［11-12］，而且在病原菌的多樣性、生物學(xué)特征等方面均有進(jìn)展［3，11，13］，此外，近年來(lái)通過(guò)拮抗菌對(duì)病害的控制也取得了較多的成果［14-16］，也證實(shí)了可通過(guò)對(duì)寄主植物的微生物調(diào)控，達(dá)到控制枯梢病爆發(fā)的目的。健康植物組織中的內(nèi)生真菌群落更加穩(wěn)定，從而抑制病原菌的發(fā)展。張麗娜等［17］通過(guò)PDA平板培養(yǎng)法對(duì)不同季節(jié)內(nèi)的無(wú)病斑山茶及感病山茶葉片內(nèi)生真菌群落的差異進(jìn)行了比較，對(duì)灰斑病與山茶葉部?jī)?nèi)生真菌多樣性的關(guān)系進(jìn)行了分析，結(jié)果表明：無(wú)病斑葉片的內(nèi)生真菌數(shù)量、多樣性、均勻度高于染病葉片，染病程度對(duì)葉片內(nèi)生真菌多樣性等指標(biāo)的影響顯著。還有研究表明兩個(gè)品種染病后的內(nèi)生真菌變化趨勢(shì)也不同，高抗品種內(nèi)生真菌多樣性逐漸減少，而高感品種多樣性呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)［18］。有研究對(duì)漆樹感染潰瘍病的枝干部?jī)?nèi)生真菌進(jìn)行培養(yǎng)，比對(duì)不同染病情況、不同部位的真菌多樣性，結(jié)果表明無(wú)病斑枝干的內(nèi)生真菌多樣性顯著高于受損傷組織，潰瘍病菌的侵染對(duì)內(nèi)生真菌群落結(jié)構(gòu)的影響顯著［19］。

本研究中，內(nèi)生真菌在無(wú)病斑針葉中表現(xiàn)為較高的多樣性，高于染病較輕的針葉，這與先前的研究結(jié)論一致，而在染病較重的針葉中多樣性指數(shù)再次升高，可能是因?yàn)獒樔~防御侵染的機(jī)制被破壞。在病原菌入侵植物組織時(shí)，寄主植物的防御機(jī)制被破壞，內(nèi)部平衡被打破，其它病原微生物以及腐生微生物更容易進(jìn)入植物組織內(nèi)，使得內(nèi)部的微生物多樣性升高。在無(wú)病斑棉花和黃萎病侵染后的棉花根部?jī)?nèi)生真菌的研究中，黃萎病侵染后的棉花根部?jī)?nèi)生真菌多樣性等指標(biāo)也均高于無(wú)病斑植株根部，說(shuō)明病原菌的侵染提高了棉花內(nèi)部微生物的多樣性，影響其群落結(jié)構(gòu)［20］。這可能是由于其它病原菌或腐生真菌對(duì)染病組織進(jìn)行了入侵［21］，或是由于觀察到的真菌群落中存在可引發(fā)潛伏侵染病原菌的模式［22］。

松類樹種的針葉內(nèi)生微生物分析大都通過(guò)純培養(yǎng)法進(jìn)行，對(duì)樟子松、紅松、興安落葉松等樹種的內(nèi)生真菌或內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行分離培養(yǎng)，初步證實(shí)了松針葉內(nèi)生微生物的多樣性及其中對(duì)內(nèi)生微生物多樣性的影響因素，如針葉葉齡［23-24］。在P. densiflora的內(nèi)生真菌研究中［25-26］，分離獲得了Lophodermium complex、Sydowia polyspora、Hymenulasp.、Sistotrema brinkmannii、Septoria pini-thunbergii、Earliellasp. 和Lophodermiumspp.等多株優(yōu)勢(shì)菌株。隨著對(duì)內(nèi)生微生物認(rèn)識(shí)的不斷提高以及研究水平的提升，第二代測(cè)序技術(shù)已經(jīng)常用于微生物多樣性的研究中。Bullington和Larkin［6］對(duì)針葉樹種內(nèi)生真菌多樣性進(jìn)行了研究，對(duì)山白松Pinus monticola針葉進(jìn)行接種，并通過(guò)新一代高通量測(cè)序手段對(duì)其中的內(nèi)生真菌多樣性和群落結(jié)構(gòu)的變化進(jìn)行測(cè)定，研究?jī)?nèi)生真菌相互間的種間競(jìng)爭(zhēng)、共生模式等，證實(shí)了接種真菌與潛在病原菌的相互競(jìng)爭(zhēng)。

本研究結(jié)果得到內(nèi)生真菌的優(yōu)勢(shì)菌為Ascomycota和 Basidiomycota。Ascomycota和 Basidiomycota均為常見(jiàn)植物內(nèi)生真菌［27-28］，與先前P. densiflora純培養(yǎng)內(nèi)生真菌研究［25］結(jié)論一致。Rhizosphaera、Fusarium和Myriangium曾在茅蒼術(shù)莖、葉中分離發(fā)現(xiàn)，是常見(jiàn)的內(nèi)生真菌［30］。Fusarium不僅是內(nèi)生真菌，可分泌多種具有研究?jī)r(jià)值的次生代謝物質(zhì)［30］，還是多種植物病害的病原菌［31-32］。因此，對(duì)于Fusarium需要進(jìn)一步研究。在染病較重的針葉中特有的數(shù)個(gè)屬中，Cenangium為常見(jiàn)的松類病害病原菌，該屬被證實(shí)與枯梢病病原菌的侵染具有緊密的聯(lián)系［33］。

4 結(jié)論

在針闊混交林中，P. densiflora葉部?jī)?nèi)生真菌的多樣性及群落結(jié)構(gòu)組成受到枯梢病侵染的影響，染病前期程度較輕時(shí)微生物多樣性降低，在染病后期多樣性指數(shù)上升。無(wú)病斑針葉中內(nèi)生真菌的優(yōu)勢(shì)菌為L(zhǎng)apidomyces和Selenophoma，在枯梢病菌的侵染后兩種優(yōu)勢(shì)菌相對(duì)豐度均下降，內(nèi)生真菌群落結(jié)構(gòu)組成趨于一致。本研究明確了枯梢病不同發(fā)病程度P.densiflora針葉內(nèi)生微生物的多樣性及群落結(jié)構(gòu)組成，為松枯梢病的真菌群落結(jié)構(gòu)調(diào)控提供了基礎(chǔ)。