王志宏，趙志剛，韓成云*

(1.宜春學(xué)院 化學(xué)與生物工程學(xué)院；2.宜春學(xué)院 生命科學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院，江西 宜春 336000)

硒(Se)作為人體必需的十四種微量元素之一，中國居民膳食營養(yǎng)素參考攝入量標(biāo)準(zhǔn)中，明確指出人體谷胱甘肽過氧化物酶等一系列蛋白肽鏈的一級結(jié)構(gòu)中具有含硒氨基酸，是人體抗氧化作用的重要功能部分。除此之外，近些年有關(guān)研究還發(fā)現(xiàn)硒對人體健康至關(guān)重要，硒最初被認(rèn)為是“有毒元素”，但后期研究發(fā)現(xiàn)硒在提高人體免疫力、預(yù)防心血管疾病、保護(hù)視力、抗衰老和抗腫瘤方面都有作用[1]。然而，在Navarro-Alarcon和Williams的調(diào)查中，報告了全世界不同程度缺硒人群達(dá)到5-10億，遍及40多個國家和地區(qū)[2，3]，我國更是有72%的地區(qū)屬于缺硒或者低硒地區(qū)，在這些地區(qū)居住著3/4的人口[4]，克山病、大骨節(jié)病、白內(nèi)障和胰腺病等重大疾病的一個重要誘發(fā)因素就是機(jī)體攝入硒不足[5-6]，硒在人體的作用不可替代，增加硒攝入量勢在必行。植物作為人體獲取硒的重要途徑，通過日常飲食提升人體硒攝入量是目前公認(rèn)最好的補(bǔ)硒途徑[7]，但硒具有“雙重性”，硒過量會導(dǎo)致機(jī)體中毒。Rayman等人研究發(fā)現(xiàn)硒的形態(tài)以及含量會影響其在人體內(nèi)的吸收代謝過程，決定其在體內(nèi)的生物活性[8]。

目前研究發(fā)現(xiàn)硒在自然界主要以Se2-、Se、Se4+和Se6+形式存在，植物體內(nèi)硒儲存形態(tài)以有機(jī)硒為主，其中含硒大分子化合物主要有硒蛋白、硒核酸和硒多糖等[9-10]，這些大分子參與了植物體的生長代謝；小分子硒化合物目前發(fā)現(xiàn)有十余種，其中硒蛋氨酸(SeMet)、硒胱氨酸(SeCys2)、硒代尿素(SeUr)、硒代半胱氨酸(SeCys)、甲基硒代半胱氨酸(MeSeCys)和硒代乙硫氨酸(SeEt)研究較多。硒蛋白是植物體重要組成部分，硒與植物蛋白以共價鍵結(jié)合形成硒胱氨酸和硒甲硫氨酸。前者是指SeCys作為第二十一種氨基酸，由硒蛋白RNA的UGA編碼直接參與蛋白質(zhì)合成，合成的這種含有SeCys的蛋白質(zhì)稱為硒蛋白；后者指作為S同族元素的Se，在蛋白質(zhì)合成時，取代含硫氨基酸蛋氨酸中的S元素，這種含有硒代蛋氨酸的蛋白質(zhì)稱為含硒蛋白[11]，植物中硒蛋白往往同時含有這兩種硒代氨基酸。相比于硒蛋白類，植物中硒多糖研究較少，植物體硒多糖分為兩種：單聚多糖和雜聚糖。Mao，G研究灰樹花硒多糖(Se-GP11)不僅具有抗腫瘤活性還具有改善體內(nèi)免疫的作用，2017年該課題組又發(fā)現(xiàn)Se-GP11與抗腫瘤藥氟尿嘧啶(5-FU)聯(lián)用可以增強(qiáng)其抗腫瘤作用，而且明顯降低其肝毒性[12]。植物中的硒核酸主要以Se-tRNA存在[13]。這些植物體內(nèi)的有機(jī)活性硒，生物利用度高，而且比無機(jī)硒更安全，研究發(fā)現(xiàn)，天然植物中的有機(jī)活性硒，具有多重生理學(xué)作用，例如抗腫瘤[14]、提高免疫力[15]、抗氧化[16]和抗重金屬[17]等。但是由于植物中硒含量相對較少、硒形態(tài)的多樣性以及各形態(tài)硒不穩(wěn)定，導(dǎo)致了植物體中各形態(tài)硒提取、分離純化和形態(tài)檢測相對較困難。

文章通過對近幾年研究人員對植物中硒形態(tài)研究方法進(jìn)行綜述，從植物中各形態(tài)硒的分析的實(shí)驗(yàn)流程入手，進(jìn)行方法學(xué)總結(jié)，為后期硒研究提供參考。

1 植物硒化合物的提取

植物體硒大部分以生物活性大分子如蛋白質(zhì)、核酸和多糖結(jié)合形式存在，因此要實(shí)現(xiàn)硒形態(tài)分析的前提是要將這些硒化合物從植物體中有效提取出來。這些提取方式必須要在高效提取硒化合物的同時，有效保證這些易分解化合物的形態(tài)學(xué)穩(wěn)定，保持其原有形態(tài)不變，這就使得其前處理方式要比檢測硒含量總量時所用的前處理方式要求更高。

植物樣品根據(jù)分析目的的不同，往往采用不同的前處理方式。硒蛋白的提取就是把植物體中以各種形式存在的硒蛋白分離出來，使其成為合適的分析形式，目前硒蛋白常用的提取方法有超聲輔助提取法、微波輔助法、堿提法、酶提法和Osborne分級分離法等。李瑤佳利用Osborne分級分離法依次使用75%乙醇、0.5 mol/L NaCl、二次去離子水和0.1 mol/L NaOH對苦蕎的籽粒中的醇溶性、鹽溶性、水溶性和堿溶性硒蛋白進(jìn)行提取，期間對樣品與提取溶劑混合物在40℃超聲兩小時，使用同一溶劑連續(xù)提取兩次，將提取液合并后離心10 min(轉(zhuǎn)速4000 r/min)，上清液使用0.45 μm微孔濾膜濾過，濾過液加入硫酸銨至飽和，低溫析出蛋白后，二次離心取沉淀透析，透析液減壓濃縮后使用去離子水定容，會依次得到醇溶性、水溶性、鹽溶性和堿溶性硒蛋白待測液，測量其蛋白含量和硒含量，最后成功得出苦蕎籽粒中80%以上的硒轉(zhuǎn)化為蛋白結(jié)合形態(tài)[18]。秦沖等使用微波輔助酶法對富硒小麥中的有機(jī)硒進(jìn)行提取，使用美國CEM公司的MARS微波消解系統(tǒng)，加入蛋白酶XIV和超純水進(jìn)行微波萃取，萃取液離心后過水性濾膜，并使用HPLC-ICP-MS進(jìn)行了硒形態(tài)檢測，成功分離出富硒小麥中亞硒酸鹽(Se(Ⅳ))、硒酸鹽(Se(Ⅵ))、SeMet、SeCys2四種硒形態(tài)[19]。王欣等分別對比了使用蛋白酶K和蛋白酶XIV對富硒大米、富硒酵母、富硒茶葉和富硒靈芝孢子粉中硒形態(tài)提取的效率，發(fā)現(xiàn)使用蛋白酶XIV時，SeMet提取效果最佳，通過優(yōu)化蛋白酶XIV提取條件，摸索出37℃，7h最佳酶解條件，在富硒玉米中成功提取分離出Se(Ⅳ)、Se(Ⅵ)、SeMet、SeCys2、SeUr、SeEt六種硒形態(tài)[20]。

植物中硒多糖提取一般先要將植物體粉碎，然后使用有機(jī)溶劑如甲醇、石油醚等有機(jī)溶劑將已經(jīng)粉碎的樣品進(jìn)行脫脂脫酮干燥，再使用超聲、蛋白酶或者微波進(jìn)行樣品的二次輔助破碎，最后使用弱堿進(jìn)行硒多糖的粗提取，提取后使用Sevga法、三氟三氯乙烷法或三氯醋酸法進(jìn)行粗多糖純化，去除雜蛋白，再通過透析除去其它小分子雜質(zhì)。WANG L在2019年對中國貴州刺梨果實(shí)中的硒多糖RTFP-3進(jìn)行了提取，使用試劑盒得到粗提多糖5 mL，并依次用蒸餾水和NaCl洗脫，之后透析得到多糖混合物，使用Vc還原后再次透析，使用電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜(ICP-AES)檢測最終透析液，檢測沒有發(fā)現(xiàn)游離硒時，得到純化的RTFP-3硒多糖[21]。硒核酸在植物中含量少，分離純化難度大，一般提取方法是從植物樣品使用試劑盒粗提核糖核酸，使用氫化物原子熒光法檢測其中是否有硒，然后使用高效液相色譜(HPLC)等色譜技術(shù)進(jìn)一步純化分離。

對小分子硒形態(tài)提取方法一般采用無機(jī)提取法和酶解法。無機(jī)提取是指依次使用去離子水、酸、和鹽對植物樣品中的硒酸根(SeO42-)、亞硒酸根(SeO32-)以及水溶性硒代氨基酸，對結(jié)合生物大分子的硒幾乎沒有提取效果，對于酸提取，目前已不常用，因?yàn)橛醒芯空甙l(fā)現(xiàn)酸提取會破壞植物中的硒形態(tài)[9]。酶解法是目前應(yīng)用最多的，常用于酶解的蛋白酶有蛋白酶XIV、蛋白酶K、蛋白酶E和胃蛋白酶等，這些蛋白酶會將硒蛋白中的蛋白質(zhì)肽鍵酶解，硒代氨基酸會被分離出來，相比于無機(jī)提取，酶反應(yīng)條件相對溫和，硒形態(tài)不易被破壞[22]。高俞希使用蛋白酶E在弱堿性條件下研究超聲時間對富硒酵母中硒代蛋白提取率的影響，并發(fā)現(xiàn)超聲半小時時，蛋白提取率最高[23]。Gergely使用蛋白酶XIV對杏鮑菇中硒蛋白進(jìn)行了酶解，得到硒代氨基酸，然后利用超聲濃縮輔助提取縮短提取時間，這種方法在后期得到了普遍應(yīng)用，將杏鮑菇中硒蛋白提取率由73.68%提升到了86.04%，該方法對時間上的優(yōu)化，不僅縮短了實(shí)驗(yàn)周期，最主要是避免了提取時間過長導(dǎo)致的硒形態(tài)改變[24]。

植物中有機(jī)硒的提取直接影響后期的檢測，提取方法的選擇、提取條件的優(yōu)化十分關(guān)鍵。植物的有機(jī)硒提取方法具有特異性，不同植物種類或不同的有機(jī)硒形態(tài)，往往使用不同的提取條件和提取方法，如提取溶劑pH、緩沖液、酶解蛋白等，但目前最普遍、最有效的植物硒化合物提取方法還是使用蛋白酶酶解后超聲縮短提取時間，然后進(jìn)行后續(xù)分析。總之，樣品前處理至關(guān)重要。

2 植物中硒化合物的分離與檢測

植物中硒形態(tài)定性和各形態(tài)定量的前提是通過實(shí)驗(yàn)手段有效將植物硒提取液進(jìn)行處理，使各組分實(shí)現(xiàn)時間和空間上的分離，再采用靈敏度高的檢測器進(jìn)行定性定量分析。目前常用的硒形態(tài)分離手段有排阻色譜(SEC)、毛細(xì)管電泳色譜(CE)、離子交換色譜(IEC)和氣相色譜(GC)。經(jīng)色譜分離后，需要進(jìn)一步進(jìn)行硒形態(tài)檢測，檢測技術(shù)往往選用元素專一性強(qiáng)、線性范圍寬、檢測限低的手段，如紫外-可見光分光光度計(UV)、質(zhì)譜(MS)、原子熒光光譜(AFS)等，這些技術(shù)可以有效的排除植物中結(jié)構(gòu)相似但不含硒的化合物。隨著分析領(lǐng)域儀器設(shè)備接口技術(shù)的提高，目前出現(xiàn)許多聯(lián)用技術(shù)，已經(jīng)不需要人工進(jìn)行硒形態(tài)分離后再檢測，而是直接將高選擇性的分離色譜技術(shù)和高靈敏度的光譜檢測技術(shù)連接，常用的聯(lián)用分析方法有高效液相—電感耦合等離子體質(zhì)譜(HPLC-ICP-MS)、毛細(xì)管電泳—電感耦合等離子體質(zhì)譜(CE-ICP-MS)、高效液相—?dú)浠锇l(fā)生—原子熒光光譜(HPLC-HG-AFS)、高效液相—電噴霧質(zhì)譜(HPLC-ESI-MS)、高效液相—電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜(HPLC-ICP-AES)和X射線衍射技術(shù)(XRD)等。

2.1 分光光度法

UV儀器穩(wěn)定，操作簡單，實(shí)驗(yàn)條件要求相對較低，分析速度快，成本低廉。但此檢測方法用于硒形態(tài)檢測需要顯色劑與硒結(jié)合，產(chǎn)物經(jīng)過分離濃縮后，使用該方法檢測。UV只用于無機(jī)硒含量測定，無法測定有機(jī)硒形態(tài)，因?yàn)樵谒嵝詶l件下可以無機(jī)硒離子Se(Ⅳ)與顯色劑結(jié)合，從而產(chǎn)生光吸收，常用的顯色劑有4-硝基鄰苯二銨、3，3-二氨基萘、結(jié)晶紫和羅丹明B等。葉林等使用UV測海產(chǎn)品中的硒，實(shí)驗(yàn)條件是4-硝基鄰苯二銨和Se(Ⅳ)絡(luò)合顯色，以甲酸調(diào)節(jié)pH，用有機(jī)溶劑甲苯萃取絡(luò)合產(chǎn)物，在349.5 nm處測定吸光度，乙二胺四乙酸(EDTA)消除Fe3+的影響，檢出限為0.6 g/mL[25]。李岱以3，3-二氨基萘絡(luò)合硒(Ⅳ)，甲苯萃取，在429 nm處有最大吸收，成功測定出香菇中的總硒含量，RSD小于3%，回收率在98%-101%[26]。陳戈等利用Se4+的氧化性，將I-氧化為I2再與過量I-形成I3-，與結(jié)晶紫絡(luò)合顯色，在表面活性劑阿拉伯膠輔助下，使用UV測量了礦泉水中硒含量[27]。羅丹明B做染色劑時，一般使用吐溫-100作為表面活性劑，這樣不但增加了絡(luò)合物的溶解度便于萃取，提高靈敏度，而且也減少了測量過程中絡(luò)合物沉淀導(dǎo)致的吸光度測定不準(zhǔn)確，受限于無法對有機(jī)硒形態(tài)定量定性，目前已較少使用。

2.2 氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用

GC應(yīng)用于揮發(fā)硒的分離，對于硒代氨基酸和其它有機(jī)硒等非揮發(fā)性化合物，必須先將其轉(zhuǎn)化為氣態(tài)才能進(jìn)行分離檢測，一般是用衍生法增加其揮發(fā)性，而揮發(fā)硒狀態(tài)如無機(jī)硒(Se(Ⅳ)、Se(Ⅵ))、二甲基硒(DMSe)、二甲基二硒(DMDSe)、二乙基硒(DESe)、二乙基二硒(DEDSe)適合用該方法分離，Gómez-Ariza對水沉積物使用GC-MS聯(lián)用成功檢測出無機(jī)硒Se、DMSe、DMDSe、DESe、DEDSe五種揮發(fā)硒形態(tài)[28]。

2.3 高效液相—電感耦合等離子體質(zhì)譜

HPLC是近些年最廣泛使用的分離技術(shù)，也是硒形態(tài)分離檢測中最常用的手段。由于其操作簡單方便，柱效高，分離能力強(qiáng)，所需實(shí)驗(yàn)樣品量少，靈敏度高等一系列優(yōu)點(diǎn)，是目前植物硒形態(tài)分析最常用的方法。硒形態(tài)分離常用的HPLC方法有離子交換色譜(IEC-HPLC)、反相離子對色譜(RP-IPC-HPLC)、體積排阻色譜(SEC-HPLC)等。IEC-HPLC是通過離子交換分離機(jī)制將親水性的陰陽離子在流動相的淋洗作用下，進(jìn)行有序分離。Larsen等用IEC-HPLC-ICP-MS聯(lián)用，成功分離出12個標(biāo)準(zhǔn)硒樣品混合物，實(shí)驗(yàn)中流動相使用了pH=3的吡啶甲酸鹽，分離陽離子；陰離子交換時，更換流動相為pH=8.5的水楊酸-Tris，分離陰離子，并成功將此方法用于分析酵母和海藻[29]。張春林等使用RP-HPLC-ICP-MS對富硒酵母進(jìn)行分離檢測，實(shí)驗(yàn)條件是流動相pH=5.7的2.5%甲醇水溶液、NH4H2PO4和四丁基溴化銨混合溶液，流速1.5 mL/min，進(jìn)樣體積100 uL，成功分離并檢測出七種砷和硒的形態(tài)，其中硒形態(tài)有Se4+、SeMet和SeCys，回收率達(dá)到了81%[30]。李艷萍等使用RP-IPC-HPLC-ICP-MS，對比了分別用磷酸氫二鉀和檸檬酸為流動相時，分離出水體中硒形態(tài)的區(qū)別，結(jié)果表明檸檬酸為流動相時，650s內(nèi)完成了四種硒形態(tài)的分離，分別是SeO32-、SeO42-、SeCys2和SeMet，而磷酸二氫銨只能分離出三種硒形態(tài)，無法有效分離出SeO42-。后期實(shí)驗(yàn)中，該研究組以檸檬酸為流動相(pH=4，20 mmol/L)600s內(nèi)分離出SeO42-、SeO32-、SeCys、SeMet、SeUr和MeSeCys，但由于SeO32-和MeSeCys色譜峰出現(xiàn)重疊，無法有效分離[31]。體積排阻色譜又稱凝膠色譜，是分離植物中高分子化合物的常用方法，由于排阻色譜理論塔板少，分離能力弱，只能用于分離分子量相差較大的化合物，這導(dǎo)致它只用于植物硒形態(tài)分析中的初步篩分，要與其它選擇性更強(qiáng)的技術(shù)聯(lián)用。陸秋艷等采用RP-IPC-HPLC，使用(pH=4.4)檸檬酸+己烷磺酸鈉體系為流動相，流速1.0 mL/min，ICP-MS檢測分離結(jié)果，成功使用HPLC-ICP-MS在7.5 min內(nèi)完全分離水樣中Se(Ⅵ)、Se(Ⅳ)、SeMet、SeCys2、MeSeCys、SeEt、SeUr7種不同形態(tài)元素的分析方法，線性相關(guān)系數(shù)均大于0.9995，精密度均在10%以內(nèi)，加標(biāo)回收率為76.9%-106.2%[32]。季海冰等同樣利用HPLC-ICP-MS建立了測定環(huán)境水樣中5種形態(tài)硒(SeO42-、SeO32-、SeCys2、MeSeCys、SeMet)的方法。分析流程為：水樣過0.22 μm微孔濾膜，濾液注入色譜柱(C8柱)，以0.1%七氟丁酸+20 mmol/L磷酸二氫鉀+5%甲醇混合溶液為流動相，1.2 mL/min流速進(jìn)行等度洗脫，5種形態(tài)硒在10min內(nèi)可實(shí)現(xiàn)完全分離[33]。何巧使用RP-HPLC-ICP-MS建立了以蛋白酶XIV：富硒大米樣品=1:10比例酶解樣品后提取其中的有機(jī)硒，研究發(fā)現(xiàn)酶解最佳時長為10 h，以乙酸銨+甲醇+四正丁基氫氧化銨(TBAH)為流動相，19 min成功分離出SeCys、MeSeCys、SeMet、Se(Ⅳ)和Se(Ⅵ)5種硒形態(tài)，方法線性和精密度良好[34]。

2.4 毛細(xì)管電泳—電感耦合等離子體質(zhì)譜

毛細(xì)管電泳是一種高效分離技術(shù)，以雙電層為基礎(chǔ)，電場力為驅(qū)動力，理論塔板數(shù)每米可以達(dá)到幾十萬上百萬，分離速度快，柱效很高。分離條件溫和，分離效率高，抗干擾能力強(qiáng)，不存在固定相，因此可以完整保留待測物質(zhì)的形態(tài)，同一元素只要其結(jié)構(gòu)或者電荷有差別，均可將其分離開來。王澤邦將蝦肉樣品使用3:1甲醇水溶液微波輔助提取后，離心，然后氮?dú)獯蹈?，超純水稀釋后過0.22 μm濾膜，利用CE分離，采用ICP-MS對其形態(tài)分析，成功檢測出Se(Ⅵ)，SeCys2和SeMet三種硒形態(tài)[35]。Albert使用毛細(xì)管電泳技術(shù)成功分離Se(Ⅳ)、Se(Ⅵ)、SeCys、SeMet[36]。

2.5 高效液相—?dú)浠锇l(fā)生—原子熒光光譜

HG-AFS是目前最常用的硒元素總量測定方法，操作簡單，線性范圍寬，精密度和靈敏度高，可以滿足植物體硒分析測定的要求。李哲利用高效液相分離，紫外在線消解，HG-AFS檢測，以蛋白酶E作為提取酶，成功提取分離和檢測了外源硒處理后的小麥和小白菜中的五種硒形態(tài)SeCys2、MeSeCys、Se4+、SeMet和Se6+，證明了小麥比小白菜具有更好的富硒和轉(zhuǎn)化無機(jī)硒為有機(jī)硒的能力[37]。艾春月使用胃蛋白酶模擬消化茶葉，利用透析袋分離了有機(jī)硒和無機(jī)硒，Osborne分級分離提取，并且建立了HG-AFS測量蛋白液中的有機(jī)硒和無機(jī)硒含量，得到了茶葉中四種有機(jī)硒蛋白分布規(guī)律：堿蛋白>鹽蛋白>醇溶蛋白>水溶蛋白，而且還對華東、華南、華中、西北和西南五個地區(qū)的19個茶葉樣品進(jìn)行了對比，得到了總硒和有機(jī)硒在茶葉中分布以華東地區(qū)最高，華南地區(qū)最低，但生物利用度并無明顯差異[38]。龔如雨等利用AFS對江西典型長壽區(qū)宜春市溫湯大米為研究對象，使用胃蛋白酶輔助提取，發(fā)現(xiàn)該地區(qū)大米總硒含量并不高，但谷蛋白硒SeMet的比例相對于其它學(xué)者研究的較高，達(dá)到了65.63%[39]。胡文彬等采用HPLC-HG-AFS測定富硒大米中的SeMet、SeCys2、硒甲基硒代半胱氨酸(SeMeSeCys)、SeO42-、SeO32-，利用蛋白酶E對富硒大米樣品水解超聲，磷酸氫二銨+四丁基溴化銨+甲醇作為流動相，甲酸調(diào)節(jié)pH至5.8-6.0，用HPLC分離后使用HG-AFS測定，成功定量[40]。

2.6 高效液相—電噴霧質(zhì)譜

鐘洪祿利用HPLC-ESI-MS法，通過液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對富硒花生中的硒形態(tài)進(jìn)行研究，分析出不同施硒濃度下，花生中有機(jī)硒和無機(jī)硒的分布規(guī)律，探討了花生富硒對花生中各硒形態(tài)占總硒的相對質(zhì)量的影響，并分離測定了富硒花生中的SeCys2、Na2SeO4、SeMeSeCys、Na2SeO3和SeMet，結(jié)果表明富硒花生中各硒形態(tài)含量關(guān)系為：SeMeSeCys> SeMet > SeCys2> Na2SeO4> Na2SeO3[41]。胡園園采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜HPLC-MS法，以乙腈為流動相，濾液通過HPLC分離后，通過ESI噴霧離子源正離子化后，通過MS檢測，準(zhǔn)確檢出并且定量了SeMet[42]。吳鈺瀅以葉面施硒的方式成功培養(yǎng)出富硒葡萄，通過ICP-MS測定了富硒葡萄中硒總量和可溶態(tài)硒含量，并采用HPLC-ESI-MS測定富硒葡萄中硒代氨基酸的形態(tài)及含量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：施硒量與葡萄含硒量在一定范圍內(nèi)成正相關(guān)，施硒梯度為160 mg/kg時，葡萄中三種SeMet、SeCys2、SeMeSeCys達(dá)到最大含量[43]。不同于前者的是，王婷婷以土壤富硒的形式培養(yǎng)得到富硒葡萄，使用微波密封消解后，采用HG-AFS對其中的硒形態(tài)分析，成功檢測出SeSys2，SeMet，SeMeSeCys，葡萄內(nèi)沒檢測出無機(jī)硒，這說明葡萄將土壤中的無機(jī)硒通過自身代謝轉(zhuǎn)化為了有機(jī)硒，這種對果實(shí)富硒的方法安全可靠[44]。

2.7 高效液相—電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜

ICP-AES是元素痕量、超痕量分析的技術(shù)，激發(fā)光源為電感耦合等離子炬的光譜分析技術(shù)，靈敏度高，檢出限低，準(zhǔn)確度和精密度高。葉麗用高壓密閉微波消解，以硝酸和過氧化氫為消解液，使用SEC-HPLC分離微量元素，以ICP-ACE為檢測器，等離子氣體流速為1.5 L/min，輔助氣體流速為1.5 L/min，霧化器流速為0.55 L/min，準(zhǔn)確從雞蛋粉中分離出Ca、Fe、I、Mn、Cu、Se、Co等多種微量元素，其中硒元素總量為0.000238 mg/g，檢出限0.0792 ng/mL[45]。趙宇建立了利用ICP-AES分析測定苔蘚植物中微量元素的方法，不同于前者的是，苔蘚樣品沒有選用常用的微波消解液硝酸和過氧化氫，而是選用了H2SO4和HClO4處理消解，大大提高了消解速率，但H2SO4對霧化效率降低的影響，實(shí)驗(yàn)中沒有做出研究[46]。

2.8 X射線衍射技術(shù)

XRD是利用晶體物質(zhì)中X射線會發(fā)生衍射的效應(yīng)，對物質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行檢測的技術(shù)。高能量X射線照射試樣時，試樣中的物質(zhì)被激發(fā)，會產(chǎn)生二次X射線熒光衍射，而這些衍射遵循布拉格晶體衍射定律，可以根據(jù)衍射峰位對物質(zhì)進(jìn)行定性，測定譜線強(qiáng)度的積分以進(jìn)行定量。該檢測方法不損傷和消耗樣品、快捷、穿透力強(qiáng)、精確度高，不但可以通過掃描對植物體硒進(jìn)行三維立體定位，而且也可以用于硒形態(tài)的特征分析。張澤洲采用同步輻射X射線微區(qū)分析方法對取自湖北恩施硒礦區(qū)的微生物進(jìn)行了原位分析，成功得到了硒形態(tài)空間分布圖和形態(tài)數(shù)據(jù)，分析出傳統(tǒng)間接化學(xué)提取法無法檢測的Se0，并且得到其含量占到微生物總硒含量的10.63%[47]。

3 展望

硒元素作為痕量元素廣泛存在于自然界的動植物體中，存在形態(tài)多樣，而且各形態(tài)穩(wěn)定性差，以及植物本身成分的復(fù)雜性等因素，這些都增加了植物中硒形態(tài)提取、分離純化和檢測的難度。文章對前人研究硒形態(tài)的方法進(jìn)行了綜述，就植物中的硒形態(tài)做了重點(diǎn)介紹，可以得出植物中的硒形態(tài)分析，樣品前處理是關(guān)鍵，高效簡潔的前處理方式可以有效避免硒形態(tài)在檢測過程中的轉(zhuǎn)化，同時也是整個后期實(shí)驗(yàn)結(jié)果是否準(zhǔn)確的決定性因素。因此，根據(jù)待測植物樣品種類的不同，對植物樣品前處理方式的優(yōu)化和探索，選擇合適的提取方法、pH調(diào)節(jié)劑、蛋白酶種類、提取溶劑等，尤為重要。

色譜分離技術(shù)高效實(shí)用，光譜分析技術(shù)靈敏度高，這兩項(xiàng)技術(shù)的聯(lián)用，使得硒形態(tài)分析越來越向著高效精準(zhǔn)方向邁進(jìn)，有機(jī)硒以其高效的生物學(xué)優(yōu)勢，成為檢測分析重點(diǎn)，是一種必然趨勢，但目前所進(jìn)行的工作均是將與大分子結(jié)合的硒通過酶水解后，對其純化分離以及檢測，急需尋找有效的技術(shù)手段，可以對硒蛋白等大分子可以進(jìn)行準(zhǔn)確的純化和定量，這對后期單一有機(jī)硒生物學(xué)功能的確定，以及植物體內(nèi)各種硒形態(tài)轉(zhuǎn)化具有重要意義。植物的硒形態(tài)檢測，可以幫助富硒食品和富硒農(nóng)作物的開發(fā)，這對我國作為中度缺硒國家，具有深遠(yuǎn)影響，形態(tài)分析方法仍有待改善。