采用半果接種法研究幾種殺菌劑對芒果炭疽病的防治效果

張俊有 蔣家珍

摘要：本試驗采用孢子萌發(fā)法進行室內毒力測定，研究咪鮮胺、異菌脲、抑霉唑、吡唑醚菌酯、鮮保A等5種殺菌劑在5個濃度下對芒果炭疽菌孢子萌發(fā)的抑制效果，計算出5種殺菌劑對芒果炭疽菌的EC50，并進行多重比較。結果表明咪鮮胺、異菌脲、抑霉唑、吡唑醚菌酯、鮮保A等對芒果炭疽菌的EC50分別為4.493、1.596、180.438、12.830、181.810 mg/L，異菌脲抑制芒果炭疽菌孢子萌發(fā)的效果最好;采用半果接種法進行活體試驗，研究咪鮮胺、異菌脲、抑霉唑、吡唑醚菌酯、鮮保A等5種殺菌劑在5個濃度下對芒果炭疽病的防治效果，并進行多重比較，結果表明異菌脲對芒果炭疽病的防治效果最好。

關鍵詞：芒果炭疽病;生物測定;孢子萌發(fā)法;半果接種法;殺菌劑

中圖分類號： S436.67+9 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2020）24-0102-06

芒果肉質細膩，味道鮮美，深受消費者的喜愛，是我國經濟價值很高的水果。芒果炭疽病是芒果儲藏期的一種重要病害，常造成巨大的經濟損失。芒果炭疽病的病原為膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides），果實在發(fā)病初期出現黑色斑點，之后病斑擴大，形成黑色的圓形、橢圓形或不規(guī)則病斑，病斑處常凹陷，在潮濕環(huán)境下病斑處常產生紅色的孢子堆，最后整個果實變黑腐爛。使用化學殺菌劑是防治植物儲藏期病害的主要方法之一[1]。本試驗利用發(fā)病芒果進行病原菌的采集[2-6]、分離[6]、培養(yǎng)、轉接，并通過采用孢子萌發(fā)法[7-12]進行室內毒力測定來研究咪鮮胺、異菌脲、抑霉唑、吡唑醚菌酯、鮮保A等5種殺菌劑在5個濃度下對芒果炭疽菌孢子萌發(fā)的抑制效果，通過半果接種法進行活體試驗來研究咪鮮胺、異菌脲、抑霉唑、吡唑醚菌酯和鮮保A等5種殺菌劑在5個濃度下對芒果炭疽病的防治效果。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株 從超市采購具有芒果炭疽病的病果，經過一段時間的保濕培養(yǎng)會產生紅色的孢子堆，從孢子堆上即可獲得芒果炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）。獲得的芒果炭疽菌一部分轉接到馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基斜面上，另一部分配制成孢子懸浮液進行后續(xù)試驗。

1.1.2 供試殺菌劑

試驗所用殺菌劑詳見表1，均來源于中國農業(yè)大學理學院應用化學系。

1.2 試驗方法

1.2.1 病原菌的培養(yǎng) 從超市中采購有芒果炭疽病癥狀的病果，將病果放入塑料盒中密閉保濕培養(yǎng)7 d左右，直到芒果表面產生紅色的孢子堆。

1.2.2 病原菌的采集

1.2.2.1 接種到PDA培養(yǎng)基斜面上 在滅菌后的超凈工作臺中，用接種針挑取病果上少量的紅色孢子堆，接種到PDA培養(yǎng)基斜面上，放入培養(yǎng)箱中保存。

1.2.2.2 配制孢子懸浮液 取出已經產孢的病果，用柔軟的毛刷輕刷病果上紅色的孢子堆來獲取孢子，在無菌水中使之懸浮并進行過濾，制成孢子懸浮液。在顯微鏡下鏡檢，觀察孢子形態(tài)以確認。用無菌水對孢子懸浮液進行稀釋，孢子懸浮液的濃度以在10×15倍顯微鏡下每個視野40～60個孢子為宜。

1.2.3 藥液的配制 將水溶性藥劑直接用無菌水溶解并用容量瓶定容，其他藥劑選用少量丙酮或二甲基亞砜（DMSO）等溶解，然后加入0.1%吐溫80，再用無菌水稀釋，有機溶劑最終含量不超過2%。

1.2.4 孢子萌發(fā)試驗

1.2.4.1 藥劑處理與孢子萌發(fā)培養(yǎng) 吸取1 mL孢子懸浮液注入指形管中，再加入各濃度的1 mL殺菌劑并混合均勻，配成的孢子與藥劑混合液中藥劑的濃度分別為500.00、50.00、5.00、0.50、0.05 mg/L。吸取孢子與藥劑混合液，滴在凹玻片上，每個處理重復3次，以不加藥劑的孢子懸浮液作對照。在裝有淺層水的培養(yǎng)皿中保濕培養(yǎng)，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24 h 后調查孢子萌發(fā)情況。把芽管長度達到孢子短徑長度1倍的視作萌發(fā)。

1.2.4.2 鏡檢時間 當對照組孢子萌發(fā)率達到90% 及以上時，檢查各個處理的孢子萌發(fā)情況。每個處理隨機觀察3個及以上視野，調查孢子總數200個以上，分別記錄孢子萌發(fā)數和孢子總數。計算半最大效應濃度（EC50）并進行多重比較。

1.2.4.3 記錄與計算方法

孢子萌發(fā)率=萌發(fā)孢子數檢驗孢子數×100%;

校正萌發(fā)率=處理萌發(fā)率對照萌發(fā)率×100%;

抑制率=100%-校正萌發(fā)率。

1.2.5 半果接種試驗

1.2.5.1 病原菌的轉接 用記號筆標記出芒果的正反兩面。無菌對照芒果正面噴施無菌水，接菌對照芒果正面噴施孢子懸浮液，藥液處理芒果正面先噴施孢子懸浮液，之后在正面噴施藥液，每個處理重復4次。將接種的果實放入保濕桶中，或直接放入保鮮袋中，在溫度為25 ℃條件下培養(yǎng);保濕18 h后，解除保濕環(huán)境，將果實晾干，然后再次放入保鮮袋中培養(yǎng)。

1.2.5.2 病情指數與防治效果的計算 觀察發(fā)病后的病斑，測量估算各果實的病斑面積與果實總面積。當加菌液且未進行藥劑處理的對照組發(fā)病率達到80%左右時，調查所有藥劑處理組的發(fā)病率與病情指數，進而計算防治效果。發(fā)病情況分級如下：0級為無病;1級為病斑面積占果實面積的5%以下;3級為病斑面積占果實面積的6%～15%;5級為病斑面積占果實面積的16%～25%;7級為病斑面積占果實面積的26%～50%;9級為病斑面積占果實面積的51%及以上。

病情指數按公式（1）進行計算，計算結果保留2位小數。

病情指數=∑（各級病果數×對應級數值）調查總果數×9×100。

防治效果按公式（2）進行計算。

式中：CK0為空白對照不噴藥液的病情指數;CK1為空白對照噴藥液的病情指數;PT0為處理組不噴藥液的病情指數;PT1為處理組噴藥處理的病情指數。

1.3 數據分析

采用SPSS 21.0軟件對數據進行分析。

2 結果與分析

2.1 離體試驗

5種殺菌劑對芒果炭疽菌孢子萌發(fā)的抑制效果見表2，咪鮮胺、異菌脲、抑霉唑、吡唑醚菌酯、鮮保A等對芒果炭疽菌的毒力回歸方程分別為Y=1.823X-8.464、Y=1.494X-7.267、Y=2.395X-9.720、Y=1.546X-6.623、Y=2.598X-10.732，相關系數均表現為極顯著相關。咪鮮胺、異菌脲、抑霉唑、吡唑醚菌酯、鮮保A等對芒果炭疽菌的EC50分別為4.493、1.596、180.438、12.830、181.810 mg/L，可見咪鮮胺、異菌脲、吡唑醚菌酯抑制芒果炭疽菌孢子萌發(fā)的效果較好，抑霉唑、鮮保A抑制芒果炭疽菌孢子萌發(fā)的效果較差。

從表3可以看出，5 mg/L濃度下咪鮮胺、異菌脲、抑霉唑、吡唑醚菌酯、鮮保A等對芒果炭疽菌孢子萌發(fā)的抑制率分別為52.20%、68.83%、30.25%、43.43%、31.75%。5 mg/L濃度下異菌脲對芒果炭疽菌的孢子萌發(fā)抑制率最高，抑霉唑對芒果炭疽菌的孢子萌發(fā)抑制率最低。

從表4可以看出，方差齊次性檢驗的顯著性值為0.180，方差齊次，數據可進行F測驗。

從表5可以看出，F為18.526，P<0.01，濃度為5 mg/L時5種殺菌劑在抑制芒果炭疽菌孢子萌發(fā)方面有著極顯著性差異。

多重比較結果（表6）顯示，第1列有抑霉唑、鮮保A對應的孢子萌發(fā)抑制率，第2列有吡唑醚菌酯、咪鮮胺對應的孢子萌發(fā)抑制率，第3列有異菌脲對應的孢子萌發(fā)抑制率。因此，當顯著性水平為0.05時，在5 mg/L濃度下，在抑制芒果炭疽菌孢子萌發(fā)的效果方面，抑霉唑與鮮保A之間無顯著性差異，抑霉唑與吡唑醚菌酯、咪鮮胺、異菌脲之間有顯著性差異，鮮保A與吡唑醚菌酯、咪鮮胺、異菌脲之間有顯著性差異，吡唑醚菌酯與咪鮮胺之間無顯著性差異，吡唑醚菌酯與異菌脲之間有顯著性差異，咪鮮胺與異菌脲之間有顯著性差異。異菌脲抑制芒果炭疽菌孢子萌發(fā)的效果最好。

由多重比較結果（表7）可知，第1列有抑霉唑、鮮保A、吡唑醚菌酯對應的孢子萌發(fā)抑制率，第2列有吡唑醚菌酯、咪鮮胺對應的孢子萌發(fā)抑制率，第3列有異菌脲對應的孢子萌發(fā)抑制率。因此，當顯著性水平為0.01時，在5 mg/L濃度下，在抑制芒果炭疽菌孢子萌發(fā)的效果方面，抑霉唑與鮮保A、吡唑醚菌酯之間無極顯著性差異，抑霉唑與咪鮮胺、異菌脲之間有極顯著性差異，鮮保A與吡唑醚菌酯之間無極顯著性差異，鮮保A與咪鮮胺、異菌脲之間有極顯著性差異，吡唑醚菌酯與咪鮮胺之間無極顯著性差異，吡唑醚菌酯與異菌脲之間有極顯著性差異，咪鮮胺與異菌脲之間有極顯著性差異。異菌脲抑制芒果炭疽菌孢子萌發(fā)的效果最好。

2.2 芒果活體試驗

5種殺菌劑對芒果炭疽病的防治效果見表8。500.00 mg/L濃度下，咪鮮胺、異菌脲、抑霉唑、吡唑醚菌酯、鮮保A等對芒果炭疽病的防治效果分別為84.4%、89.5%、54.8%、82.5%、47.4%;50.00 mg/L濃度下，咪鮮胺、異菌脲、抑霉唑、吡唑醚菌酯、鮮保A等對芒果炭疽病的防治效果分別為75.5%、84.9%、41.8%、72.5%、44.8%;5.00 mg/L濃度下，咪鮮胺、異菌脲、抑霉唑、吡唑醚菌酯、鮮保A等對芒果炭疽病的防治效果分別為52.3%、64.3%、27.2%、42.6%、28.1%;0.50 mg/L濃度下，咪鮮胺、異菌脲、抑霉唑、吡唑醚菌酯、鮮保A等對芒果炭疽病的防治效果分別為32.9%、25.2%、25.5%、16.8%、25.5%;0.05 mg/L濃度下，咪鮮胺、異菌脲、抑霉唑、吡唑醚菌酯、鮮保A等對芒果炭疽病的防治效果分別為14.1%、17.7%、10.4%、6.5%、7.6%。

從表9可以看出，在5 mg/L濃度下，咪鮮胺、異菌脲、抑霉唑、吡唑醚菌酯、鮮保A等對芒果炭疽病的防治效果分別為52.34%、64.31%、27.16%、42.56%、28.08%。5 mg/L濃度下異菌脲對芒果炭疽病的防治效果最好，抑霉唑對芒果炭疽病的防治效果最差。

從表10可以看出，方差齊次性檢驗的顯著性值為0.392，方差齊次，數據可進行F測驗。

從方差分析結果（表11）可知，F為18.303，P<0.01，5 mg/L濃度時，5種殺菌劑在對芒果炭疽病防治效果方面有著極顯著性差異。

由多重比較結果（表12）可知，第1列有抑霉唑、鮮保A對應的防治效果，第2列有吡唑醚菌酯、咪鮮胺對應的防治效果，第3列有異菌脲對應的防治效果。因此，當顯著性水平為0.05時，在5 mg/L濃度下，在芒果炭疽病防治效果方面，抑霉唑與鮮保A之間無顯著性差異，抑霉唑與吡唑醚菌酯、咪鮮胺、異菌脲之間有顯著性差異，鮮保A與吡唑醚菌酯、咪鮮胺、異菌脲之間有顯著性差異，吡唑醚菌酯與咪鮮胺之間無顯著性差異，吡唑醚菌酯與異菌脲之間有顯著性差異，咪鮮胺與異菌脲之間有顯著性差異。異菌脲對芒果炭疽病的防治效果最好。

由多重比較結果（表13）可知，第1列有抑霉唑、鮮保A、吡唑醚菌酯對應的防治效果，第2列有吡唑醚菌酯、咪鮮胺對應的防治效果，第3列有咪鮮胺、異菌脲對應的防治效果。因此，當顯著性水平為0.01時，在5 mg/L濃度下，在芒果炭疽病防治效果方面，抑霉唑與鮮保A、吡唑醚菌酯之間無極顯著性差異，抑霉唑與咪鮮胺、異菌脲之間有極顯著性差異，鮮保A與吡唑醚菌酯之間無極顯著性差異，鮮保A與咪鮮胺、異菌脲之間有極顯著性差異，吡唑醚菌酯與咪鮮胺之間無極顯著性差異，吡唑醚菌酯與異菌脲之間有極顯著性差異，咪鮮胺與異菌脲之間無極顯著性差異。異菌脲對芒果炭疽病的防治效果最好。

3 結論與討論

咪鮮胺、異菌脲、抑霉唑、吡唑醚菌酯、鮮保A等對芒果炭疽菌的EC50分別為4.493、1.596、180.438、12.830、181.810 mg/L。咪鮮胺、異菌脲、吡唑醚菌酯等抑制芒果炭疽菌孢子萌發(fā)的效果較好，抑霉唑、鮮保A等抑制芒果炭疽菌孢子萌發(fā)的效果較差。

當顯著性水平為0.05時，在5 mg/L濃度下，在抑制芒果炭疽菌孢子萌發(fā)的效果方面，抑霉唑與鮮保A之間無顯著性差異，抑霉唑與吡唑醚菌酯、咪鮮胺、異菌脲之間有顯著性差異，鮮保A與吡唑醚菌酯、咪鮮胺、異菌脲之間有顯著性差異，吡唑醚菌酯與咪鮮胺之間無顯著性差異，吡唑醚菌酯與異菌脲之間有顯著性差異，咪鮮胺與異菌脲之間有顯著性差異;當顯著性水平為0.01時，在5 mg/L濃度下，在抑制芒果炭疽菌孢子萌發(fā)的效果方面，抑霉唑與鮮保A、吡唑醚菌酯之間無極顯著性差異，抑霉唑與咪鮮胺、異菌脲之間有極顯著性差異，鮮保A與吡唑醚菌酯之間無極顯著性差異，鮮保A與咪鮮胺、異菌脲之間有極顯著性差異，吡唑醚菌酯與咪鮮胺之間無極顯著性差異，吡唑醚菌酯與異菌脲之間有極顯著性差異，咪鮮胺與異菌脲之間有極顯著性差異。異菌脲抑制芒果炭疽菌孢子萌發(fā)的效果最好。

在半果接種法試驗中，當顯著性水平為0.05時，在5 mg/L濃度下，在芒果炭疽病防治效果方面，抑霉唑與鮮保A之間無顯著性差異，抑霉唑與吡唑醚菌酯、咪鮮胺、異菌脲之間有顯著性差異，鮮保A與吡唑醚菌酯、咪鮮胺、異菌脲之間有顯著性差異，吡唑醚菌酯與咪鮮胺之間無顯著性差異，吡唑醚菌酯與異菌脲之間有顯著性差異，咪鮮胺與異菌脲之間有顯著性差異;當顯著性水平為0.01時，在 5 mg/L 濃度下，在芒果炭疽病防治效果方面，抑霉唑與鮮保A、吡唑醚菌酯之間無極顯著性差異，抑霉唑與咪鮮胺、異菌脲之間有極顯著性差異，鮮保A與吡唑醚菌酯之間無極顯著性差異，鮮保A與咪鮮胺、異菌脲之間有極顯著性差異，吡唑醚菌酯與咪鮮胺之間無極顯著性差異，吡唑醚菌酯與異菌脲之間有極顯著性差異，咪鮮胺與異菌脲之間無極顯著性差異。異菌脲對芒果炭疽病的防治效果最好。

防治芒果炭疽病推薦使用異菌脲，一方面異菌脲對芒果炭疽病的防治效果較好，另一方面異菌脲在水中的分散性好，水溶液較為均勻穩(wěn)定。

室內毒力測定試驗結果表明，異菌脲、咪鮮胺抑制芒果炭疽菌孢子萌發(fā)效果較好，半果法活體試驗結果表明，異菌脲、咪鮮胺對芒果炭疽病防治效果較好。異菌脲、咪鮮胺等對芒果炭疽病防治效果較好的原因之一可能是能有效抑制芒果炭疽菌孢子的萌發(fā)。后續(xù)試驗中，可以進一步測定咪鮮胺、異菌脲等殺菌劑對芒果炭疽菌菌絲生長的抑制作用[13]，也可以進行咪鮮胺和異菌脲的復配毒力測定篩選出藥效較好的復配比例。

參考文獻：

[1]Tripathi P，Dubey N K，Shukla A K. Use of some essential oils as post-harvest botanical fungicides in the management of grey mould of grapes caused by Botrytis cinerea[J]. World Journal of Microbiology & Biotechnology，2008，24（1）：39-46.

[2]臧 睿，黃麗麗，康振生，等. 陜西蘋果樹腐爛病菌（Cytospora spp.）不同分離株的生物學特性與致病性研究[J]. 植物病理學報，2007，37（4）：343-351.

[3]惠娜娜，郭建明，李繼平，等. 6種殺菌劑對蘋果樹腐爛病菌的毒力測定及田間防治效果[J]. 中國果樹，2018（6）：54-56.

[4]Wang X，Zang R，Yin Z，et al. Delimiting cryptic pathogen species causing apple valsa canker with multilo-cusdata[J]. Ecology and Evolution，2014，4（8）：1369-1380.

[5]曹克強，國立耘，李保華，等. 中國蘋果樹腐爛病發(fā)生和防治情況調查[J]. 植物保護，2009，35（2）：114-117.

[6]陳存坤，王文生，高元惠，等. 新疆厚皮甜瓜采后病害及主要病原真菌的分離與鑒定[J]. 保鮮與加工，2008，8（6）：54-56.

[7]Kim J O，Shin J H，Gumilang A，et al. Effectiveness of different classes of fungicides on Botrytis cinerea causing gray mold on fruit and vegetables[J]. Plant Pathology Journal，2016，32（6）：570-574.

[8]崔 娜，黃思良，岑貞陸，等. 殺菌劑對細交鏈孢菌的室內抑菌效果[J]. 廣西農業(yè)科學，2006，37（4）：394-396.

[9]黃 海，張 鑫，鄒 杭，等. 番茄灰霉病菌室內毒力測定及藥效試驗[J]. 西北農林科技大學學報（自然科學版），2015，43（2）：184-190.

[10]趙新海，鐘麗娟，徐 沖，等. 康地蕾得對黃瓜枯萎病的室內生物活性測定[J]. 浙江農業(yè)科學，2008（5）：600-601.

[11]Arslan U. Efficacy of boric acid，monopotassium phosphate and sodium metabisulfite on the control of apple scab[J]. Journal of Phytopathology，2016，164（9）：678-685.

[12]段海明，余 利，黃偉東，等. 不同溫度下6種化學殺菌劑對玉米莖腐病菌的抑制活性及與生防菌發(fā)酵上清液的混配[J]. 江蘇農業(yè)學報，2018，34（1）：41-49.

[13]Futane A S，Dandnaik B P，Salunkhe S S，et al. Management of storage diseases of onion by using different fungicides and antibiotics[J]. International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences，2018，7（3）：1149-1158.劉曉勤，張銳利. 基于高通量測序技術的紅棗黑斑病病原菌分離與鑒定[J]. 江蘇農業(yè)科學，2020，48（24）：108-112.