王帆 劉小莉

摘要：研究了植物源化合物肉桂醛對單核細(xì)胞增生李斯特氏菌（Lm）的抑制作用。肉桂醛對Lm的最小抑制濃度和最小殺菌濃度分別為150、300 μg/mL。經(jīng)過肉桂醛處理的Lm細(xì)胞出現(xiàn)菌體細(xì)胞變形、膨大的現(xiàn)象，胞外的葡萄糖和核酸含量明顯高于對照，胞內(nèi)蛋白含量降低，說明肉桂醛處理使得Lm細(xì)胞通透性增大，并且抑制了Lm的蛋白合成。流式細(xì)胞儀分析結(jié)果顯示，最小殺菌濃度的肉桂醛處理6 h后，細(xì)胞死亡率可達(dá)到95.6%。

關(guān)鍵詞：肉桂醛;單核細(xì)胞增生李斯特氏菌;抑制作用

中圖分類號： S182 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號：1002-1302（2020）24-0194-04

單核細(xì)胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes，Lm）是一種人畜共患的食源性致病菌，主要存在于水產(chǎn)品、乳品、肉品等動物性食品中，對特定人群（孕婦、新生兒、老人以及免疫缺陷者）的潛在威脅很大，致死率高達(dá)20%～30%[1-2]。與大多數(shù)病原菌不同的是，Lm在低溫條件下仍可生長繁殖，在食品加工與貯藏過程中容易造成污染引起食物中毒，隨著生活節(jié)奏的加快，人們對冷藏以及即食食品的需求比重日益加大，Lm潛在的危險(xiǎn)性也逐漸凸顯?，F(xiàn)有的防控措施中，化學(xué)方法可以快速殺菌但也存在安全隱患，因此開發(fā)安全高效的新型抑菌劑具有巨大的應(yīng)用潛力。

肉桂醛（cinnamaldehyde）在自然界主要存在于樟屬植物中，工業(yè)上通常以化學(xué)合成的方法進(jìn)行制備。它的應(yīng)用極其廣泛，在醫(yī)藥領(lǐng)域被用于抗腫瘤、抗病毒等，在食品領(lǐng)域被用作食用香料以及防腐保鮮劑[3]。近年研究表明，肉桂醛對Lm表現(xiàn)出較好的抑制效果[4-6]，但肉桂醛對Lm的作用機(jī)制卻很少有報(bào)道。本研究探索肉桂醛抑制Lm的作用機(jī)制，為將肉桂醛開發(fā)成為新型高效抑菌劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株和試劑

Lm CICC21532采購自中國工業(yè)微生物菌種保藏中心，腦心浸液（BHI）培養(yǎng)基采購自北京陸橋公司，肉桂醛采購自國藥集團(tuán)，羧基熒光素二乙酸酯（cFDA）、碘化丙啶（PI）采購自美國Sigma公司。

1.2 菌液和藥液制備

將Lm接種于無菌BHI培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng) 16 h 至對數(shù)期，以BHI培養(yǎng)基調(diào)整菌液濃度至1×107 CFU/mL備用。以乙醇作溶劑將肉桂醛配置成濃度為1×105 μg/mL的母液。

1.3 Lm對肉桂醛的敏感性測定

在96孔板上將肉桂醛母液用BHI培養(yǎng)基進(jìn)行梯度稀釋，使其作用濃度分別為0、25、50、75、100、150、200、300 μg/mL，菌液濃度為1×107 CFU/mL，37 ℃培養(yǎng)24 h。采用超微量微孔板分光光度計(jì)于600 nm測定96孔板的吸光度，測定肉桂醛對Lm的最小抑制濃度（MIC）。在沒有渾濁的微孔中接種50 μL培養(yǎng)液涂布于BHI瓊脂培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)24 h，測定肉桂醛對Lm的最小殺菌濃度（MBC）。

1.4 肉桂醛對Lm細(xì)胞形態(tài)的影響

Lm培養(yǎng)至對數(shù)期，加入肉桂醛使其作用濃度分別為MIC和MBC，用無菌水作空白對照，37 ℃、120 r/min 處理6 h后離心收集菌體，用0.1 mol/mL pH值7.4的磷酸緩沖液洗滌3次，加入2.5%戊二醛于4 ℃過夜固定。菌體采用體積分?jǐn)?shù)為30%、50%、70%、90%、100%的乙醇溶液脫水置換，每次15 min，脫水后臨界點(diǎn)干燥，將干燥的菌體固定到金屬臺上，用離子濺射儀對金屬臺噴金、鍍膜，掃描電鏡觀察拍照。

1.5 肉桂醛對Lm細(xì)胞通透性的影響

Lm培養(yǎng)至對數(shù)期，用無菌磷酸緩沖液（0.1 mol/mL，pH值7.4）洗滌重懸，加入肉桂醛使其作用濃度分別為MIC和MBC，用無菌水作空白對照，置于37 ℃、120 r/min條件下培養(yǎng)，分別于0、1、2、3、4、5、6 h取樣，離心收集上清液，采用F006試劑盒（南京建成生物工程研究所）測定葡萄糖含量，260 nm紫外吸光度反映核酸含量的變化。

1.6 肉桂醛對Lm細(xì)胞蛋白的影響

Lm培養(yǎng)至對數(shù)期，用無菌磷酸緩沖液（0.1 mol/mL，pH值7.4）洗滌重懸，加入肉桂醛使其作用濃度分別為MIC和MBC，用無菌水作空白對照，37 ℃、120 r/min處理6 h，經(jīng)細(xì)胞破碎儀破碎后離心，取沉淀加入等體積上樣緩沖液混合，于100 ℃沸水浴中保溫5 min，取出冷卻至室溫后進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳（分離膠12%，濃縮膠4%，電壓120V）。用染色液染色2～3 h，再用脫色液進(jìn)行處理后觀察拍照。

1.7 Lm細(xì)胞死亡的測定

Lm培養(yǎng)至對數(shù)期，用無菌磷酸緩沖液（0.1 mol/mL，pH值7.4）洗滌重懸，加入肉桂醛使其作用濃度分別為MIC和MBC，用無菌水作空白對照，37 ℃、120 r/min處理6 h。菌懸液樣品加入cFDA熒光探針（終濃度50 μg/mL），37 ℃避光裝載10 min，無菌磷酸緩沖液洗滌后加入PI熒光探針（終濃度30 μg/mL），室溫避光裝載10 min，無菌磷酸緩沖液洗滌重懸后進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析檢測。流式細(xì)胞儀激發(fā)波長488 nm，檢測器FL1檢測波長525 nm，檢測器FL3檢測波長620 nm，cFDA進(jìn)入FL1熒光通道，PI進(jìn)入FL3熒光通道，獲取FL1-FL3散點(diǎn)圖。

1.8 數(shù)據(jù)處理與分析

所有試驗(yàn)均進(jìn)行3次重復(fù)，應(yīng)用SPSS 17.0軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析（P<0.05），Origin 8.5軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 Lm對肉桂醛的敏感性測定

Lm對肉桂醛的敏感性結(jié)果見圖1。Lm經(jīng)肉桂醛處理后生長受到明顯的抑制作用，隨著處理濃度的增大，D600 nm逐漸降低，當(dāng)濃度達(dá)到150 μg/mL時(shí)，微孔中觀察不到渾濁，因此肉桂醛對Lm的MIC為150 μg/mL。在無渾濁的微孔中接種50 μL培養(yǎng)液涂布于BHI瓊脂培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)24 h，完全無細(xì)菌生長的最小濃度為300 μg/mL，即為肉桂醛對Lm的MBC。

2.2 肉桂醛對Lm細(xì)胞形態(tài)的影響

肉桂醛對Lm細(xì)胞形態(tài)的影響見圖2。正常Lm呈短桿狀，菌體形態(tài)飽滿，細(xì)胞表面光滑。MIC濃度的肉桂醛處理后，Lm菌體細(xì)胞變長，細(xì)胞之間的界限變得模糊。MBC濃度的肉桂醛處理后，部分細(xì)胞出現(xiàn)變形、膨大的現(xiàn)象。肉桂醛作用后Lm細(xì)胞表面并未觀察到明顯的凹陷和穿孔。

2.3 肉桂醛對Lm細(xì)胞通透性的影響

核酸中的嘌呤和嘧啶堿基在260 nm附近有最大吸收峰，通過測定260 nm處的紫外吸光度可以反映細(xì)胞中核酸的泄漏情況[7]。從圖3、圖4可以看出，肉桂醛處理1 h后，Lm細(xì)胞外的葡萄糖含量明顯（P<0.05）高于空白對照，處理2 h后，核酸含量也明顯（P<0.05）升高，且含量隨著時(shí)間和濃度的增加逐漸升高。說明肉桂醛處理導(dǎo)致Lm細(xì)胞的通透性增大，細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)向細(xì)胞外流失。

2.4 肉桂醛對Lm細(xì)胞蛋白的影響

肉桂醛對Lm細(xì)胞蛋白的影響見圖5，對分子量在15～170 ku的Lm細(xì)胞蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，正常Lm蛋白電泳條帶完整清晰，MIC肉桂醛處理后，Lm的電泳條帶明顯變淺，MBC肉桂醛處理后，部分條帶逐漸缺失，缺失部分為分子量在35～170 ku之間的蛋白。 結(jié)果表明?肉桂醛處理使得Lm細(xì)胞蛋白含量降低，一方面肉桂醛抑制了Lm的蛋白特別是大分子量蛋白的合成，進(jìn)而導(dǎo)致菌體生長受阻死亡;另一方面反映出細(xì)胞膜通透性增大導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)流失到細(xì)胞外，這與“2.3”節(jié)的結(jié)果趨勢一致。

2.5 Lm細(xì)胞死亡的測定

cFDA/PI雙染色結(jié)果見圖6，cFDA是一種滲透性染料，自身不發(fā)熒光，穿過細(xì)胞膜后被細(xì)胞內(nèi)的酯酶水解，釋放出發(fā)綠色熒光的羧基熒光素cF，非滲透性的cF只能保留在具有完整細(xì)胞膜的活細(xì)胞中，死細(xì)胞和細(xì)胞膜破損的受傷細(xì)胞不能被染色[8]。PI不能穿過完整的活細(xì)胞膜，只能進(jìn)入受傷細(xì)胞和死細(xì)胞破損的細(xì)胞膜并與核酸結(jié)合發(fā)紅色熒光，因此PI染色可以反映出細(xì)胞膜破損和細(xì)胞死亡的程度[9]。采用cFDA/PI雙染色結(jié)合流式細(xì)胞儀可以檢測菌體活細(xì)胞、受傷細(xì)胞和死細(xì)胞。流式細(xì)胞儀FL1-FL3散點(diǎn)圖顯示4類不同的細(xì)胞，即cFDA+/PI-的活細(xì)胞（Q1-LR）、cFDA+/PI+的受傷細(xì)胞（Q1-UR）、cFDA-/PI+的死細(xì)胞（Q1-UL）以及cFDA-/PI-的細(xì)胞碎片（Q1-LL）[10]。試驗(yàn)結(jié)果表明，正常Lm大多數(shù)細(xì)胞處于活細(xì)胞狀態(tài)，所占比例為93.1%;MIC肉桂醛處理6 h后，活細(xì)胞比例降低到2.6%，細(xì)胞受傷率和死亡率分別升高到73.7%和21.9%，大多數(shù)細(xì)胞處于膜損傷狀態(tài)，但是細(xì)胞內(nèi)的酯酶仍然具有活性;MBC肉桂醛處理6 h后，細(xì)胞死亡率升高到95.6%，大多數(shù)細(xì)胞處于死亡狀態(tài)。

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)研究了肉桂醛對Lm的抑制作用。肉桂醛對Lm的MIC和MBC分別為150、300 μg/mL。掃描電鏡結(jié)果顯示，肉桂醛處理后Lm出現(xiàn)變形、膨大的現(xiàn)象，細(xì)胞表面并未觀察到明顯的凹陷和穿孔。 肉桂醛處理1 h和2 h 后Lm細(xì)胞外的葡萄糖和核酸含量明顯高于空白對照，說明肉桂醛處理使得Lm細(xì)胞通透性增大，細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)向細(xì)胞外流失。SDS-PAGE電泳分析結(jié)果表明，肉桂醛處理后Lm細(xì)胞蛋白含量降低，肉桂醛抑制了分子量在 35～170 ku之間蛋白的表達(dá)。cFDA/PI雙染色結(jié)合流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，肉桂醛處理后的Lm活細(xì)胞比例降低，細(xì)胞受傷率和死亡率升高，MIC濃度的肉桂醛處理6 h后，細(xì)胞受傷率升高到73.7%，MBC濃度的肉桂醛處理6 h后，細(xì)胞死亡率達(dá)到到95.6%。綜上所述，肉桂醛可對Lm的細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞膜滲透性造成損傷，并且抑制其大分子量蛋白質(zhì)的合成。有關(guān)肉桂醛抑制Lm的特異性靶標(biāo)和分子機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

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