陸英　賀春萍　吳偉懷　梁艷瓊　黃興　鄭金龍　李銳　易克賢

摘 要：【目的】建立高效制備咖啡炭疽菌原生質(zhì)體及聚乙二醇（PEG）介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系的方法，為開展咖啡炭疽菌的致病分子機理研究打下基礎(chǔ)?！痉椒ā恳钥Х忍烤揖吧途闎SC2-2為試驗材料，通過PEG介導(dǎo)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法將含有氯嘧磺隆標記和綠色熒光蛋白報告基因（GFP）的質(zhì)粒pCB1532-G轉(zhuǎn)入BSC2-2原生質(zhì)體中，對獲得的轉(zhuǎn)化子進行遺傳穩(wěn)定檢測、PCR分子檢測和激光共聚焦顯微觀察?！窘Y(jié)果】BSC2-2對氯嘧磺隆的耐受濃度為200.0 mg/L。最佳遺傳轉(zhuǎn)化體系為：28 ℃下用2.5%裂解酶酶解BSC2-2菌絲2 h，收集原生質(zhì)體，再經(jīng)MTC緩沖液沖洗重懸后將質(zhì)粒pCB1532-G轉(zhuǎn)入原生質(zhì)體，在RM培養(yǎng)基中混勻再生，獲得轉(zhuǎn)化子。GFP基因的PCR擴增和分生孢子熒光觀察結(jié)果表明，GFP基因已成功插入并整合到咖啡炭疽菌BSC2-2基因組中。轉(zhuǎn)化子與野生型菌株在菌落形態(tài)、生長速率及致病力上無明顯差別，表明GFP基因在咖啡炭疽菌BSC2-2基因組中穩(wěn)定遺傳。【結(jié)論】成功建立了PEG介導(dǎo)的咖啡炭疽菌遺傳轉(zhuǎn)化體系，獲得與野生型菌株在菌落形態(tài)、生長速率及致病性上無明顯差別的轉(zhuǎn)化子，為后續(xù)研究咖啡炭疽菌的基因功能和致病機理提供技術(shù)支持。

關(guān)鍵詞： 咖啡炭疽菌;PEG介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化;轉(zhuǎn)化子鑒定; 生長;致病性

中圖分類號： S435.712 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2020）11-2706-07

Establishment of genetic transformation system of coffee Collectotrichum using polyethylene glycol-mediated method

LU Ying， HE Chun-ping， WU Wei-huai， LIANG Yan-qiong， HUANG Xing，

ZHENG Jin-long， LI Rui， YI Ke-xian*

（Environment and Plant Protection Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences/Key Laboratory for Monitoring and Control of Tropical Agricultural and Forest Invasive Alien Pests， Ministry of Agriculture and Rural

Affairs/Hainan Key Laboratory for Detection and Control of Tropical Agricultural Pests， Haikou ?571101， China）

Abstract：【Objective】To establish the polyethylene glycol（PEG）-mediated transformation technology system of co-ffee Collectotrichum. This results have established foundation for the study of molecular mechanism of pathogenic molecules of coffee anthracnose. 【Method】Fresh hypha of coffee Collectotrichum strain BSC2-2 was used as recipient and then transformed a plasmid pCB1532-G harboring Chlorimuron ethyl and green fluorescence protein（GFP） gene into the protoplast of BSC2-2 mediated by PEG. The obtained transformants were screened and identified by genetic stability test， PCR and laser confocal microscopic observation. 【Result】The tolerance concentration of BSC2-2 to Chlorimuron ethyl was 200.0 mg/L. The optimum condition for preparing protoplasts and transformation conditions were that digesting the fresh mycelia by using 2.5% lysing enzyme at 28 ℃ for 2 h to produce an efficient yield of protoplasts and then collecting protoplasts. After washing by MTC buffer， the protoplasts were incubated with expression plasmid pCB1532-G and mixed with RM medium and transformants have been obtained. Verifications of the putative transformants by PCR amplification analysis and green fluorescent observation indicated that the GFP gene had successfully transformed in the genome of BSC2-2. Moreover， there was no obvious difference in colony morphology， growth rate and pathogenicity between transformants and wild-type stains. These results indicated that GFP gene was stably inherited in genome of BSC2-2. 【Conclusion】The PEG-mediated genetic transformation system has been successfully established. There is no significant difference in colony morphology， growth rate and pathogenicity between transformants and wild-type stains. The results can provide technical support for the further research on the gene function and pathogenic mechanism of coffee Collectotrichum.

Key words： coffee Collectotrichum; PEG-mediated genetic transformation;transformants identification;growth;pathogenicity

Foundation item： National Key Research and Development Program of China（2018YFD0201100）

0 引言

【研究意義】咖啡為茜草科（Rubiaceae）咖啡屬（Coffea）多年生經(jīng)濟作物，主要分布于拉丁美洲、中西亞和東南亞等地（龍宇宙等，2019）?？Х犬a(chǎn)量、產(chǎn)值及消費量均位居世界三大飲料作物（咖啡、茶葉和可可）之首，每年零售額達700億美元左右（Hoffmann，2014;Chu et al.，2016;Dongw et al.，2017;Muluneh，2018），且咖啡種植業(yè)具有可循環(huán)和綠色低碳的產(chǎn)業(yè)特點，故近年來咖啡在我國的種植面積逐漸增加，較大幅度提高了咖啡種植戶的經(jīng)濟效益（楊曌，2017）。我國咖啡種植區(qū)主要分布在云南和海南等熱帶地區(qū)。其中，云南省以種植小?？Х葹橹鳎饕植荚谀喜亢臀髂喜康乃济?、保山、德宏、西雙版納和文山等地;海南省以種植中?？Х葹橹鳎饕N植于萬寧、澄邁、文昌和海口等地（歐陽歡等，2012）。近年來，隨著我國咖啡種植面積的不斷擴大，咖啡病害日益嚴重，由炭疽菌（Colletotrichum spp.）引起的咖啡炭疽病是咖啡樹上一種極易暴發(fā)流行的主要病害，在我國咖啡產(chǎn)區(qū)連年發(fā)生，病原菌可侵染嫩葉、葉柄、枝條和咖啡漿果等部位，引起葉片脫落、枝條干枯和果實腐爛，嚴重影響咖啡的產(chǎn)量和品質(zhì)（Nguyen et al.，2009;van der Vossen and Walyaro，2009;Avelino et al.，2018）。現(xiàn)有的防治措施主要是培育抗病品種、化學(xué)防治和生物防治等?；瘜W(xué)防治雖然取得一定的成效，但同時帶來環(huán)境污染、抗藥性和生態(tài)安全隱患等問題（鄭肖蘭等，2015;Cao et al.，2019）。目前，國內(nèi)外對咖啡炭疽病的研究多集中在病原菌鑒定、生物學(xué)特性和防治藥劑篩選等方面，鮮有針對咖啡炭疽菌致病機理的報道，在一定程度上限制了對炭疽病害侵染過程和致病機理的認識。遺傳轉(zhuǎn)化是研究病原菌致病分子機理的基本工具，因此，建立高效的遺傳轉(zhuǎn)化體系可為從基因水平解析咖啡炭疽病菌的致病機理提供技術(shù)基礎(chǔ)?！厩叭搜芯窟M展】聚乙二醇（PEG）介導(dǎo)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化技術(shù)是炭疽菌研究中常用的一種基因功能手段，具有操作簡便、無需特殊儀器等優(yōu)點，是常用的遺傳轉(zhuǎn)化方法之一。該方法通過細胞壁降解酶作用酶解細胞壁獲得原生質(zhì)體，在PEG的作用下將外源DNA整合到受體基因組中，通過抗生素篩選最終獲得轉(zhuǎn)化子（Liu and Friesen，2012;沈慧敏等，2017;趙美等，2019;Cai at al.， 2019;Niu et al.，2019）。獲得高質(zhì)量的原生質(zhì)體是衡量遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)成功的關(guān)鍵因素，原生質(zhì)體的數(shù)量和質(zhì)量與菌齡、酶解液的組分和酶解時間等密切相關(guān)。高靜等（2011）選擇50 mg/mL崩潰酶和10 mg/mL裂解酶共同酶解蘋果腐爛病菌菌絲2 h，釋放4×107個/mL原生質(zhì)體，成功建立蘋果腐爛病菌的遺傳轉(zhuǎn)化體系。張俊等（2011）使用10 mg/mL溶壁酶與芒果炭疽菌絲振蕩培養(yǎng)3～4 h，獲得高質(zhì)量的原生質(zhì)體。韓小路等（2016）選用0.25 g/mL崩潰酶和0.05 g/mL溶壁酶共同酶解蘋果刺盤孢菌菌絲3 h，獲得高質(zhì)量的原生質(zhì)體。杜艷等（2017）在建立梨炭疽病原菌遺傳轉(zhuǎn)化體系時篩選到最佳的酶解組合為裂解酶+崩潰酶+蝸牛酶，獲得的原生質(zhì)體數(shù)量明顯高于使用單一酶類。張雷剛等（2018）在研究PEG介導(dǎo)的黑附球菌遺傳轉(zhuǎn)化體系時發(fā)現(xiàn)，單一使用裂解酶與多種酶組合獲得的原生質(zhì)體數(shù)量存在明顯差異。曾泉等（2019）在建立辣椒炭疽菌遺傳轉(zhuǎn)化體系時，僅用單一裂解酶作為細胞壁降解酶即取得較理想的結(jié)果。【本研究切入點】咖啡炭疽病作為咖啡樹上一種嚴重的病害，目前尚無有關(guān)咖啡炭疽菌遺傳轉(zhuǎn)化體系方面的研究報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以氯嘧磺隆抗性基因作為篩選標記，探索原生質(zhì)體制備過程中裂解酶組合、裂解濃度、裂解時間等條件，建立穩(wěn)定、高效的PEG介導(dǎo)咖啡炭疽菌遺傳轉(zhuǎn)化體系，為后續(xù)開展咖啡炭疽菌致病機理和基因功能研究提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

咖啡炭疽菌野生型菌株BSC2-2（Colletotrichum gloeosporioides），由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護研究所熱帶特色經(jīng)濟作物病害研究室于2019年從海南省白沙縣咖啡種植園的感病咖啡葉片中分離純化獲得。攜帶綠色熒光蛋白報告基因（GFP）和氯嘧磺隆抗性基因的質(zhì)粒pCB1532-G由海南大學(xué)植物保護學(xué)院林春花博士饋贈。rTaq聚合酶、真菌基因組提取試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒購自寶生物工程（大連）有限公司;GFP引物序列委托上海英濰捷基貿(mào)易有限公司合成;裂解酶（Lysing enzyme）、溶壁酶（Lywallzyme）、蝸牛酶（Snailase）和氯嘧磺?。–hlorimuron ethyl）購自生工生物工程（上海）股份有限公司; PDA培養(yǎng)基、PDB培養(yǎng)基、RM再生培養(yǎng)基、MTC緩沖液、40% PEG Buffer（pH 7.5）和Top Ager培養(yǎng)基配制參考韓小路等（2016）、張雷剛等（2018）的方法。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 原生質(zhì)體制備與再生 將活化好的BSC2-2菌餅接種至裝有100 mL PDB的培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)3 d，雙層滅菌紗布過濾，收集菌絲，用無菌水清洗3遍，再用0.8 mol/L NaCl沖洗2次，然后稱取0.5 g菌絲裝于50 mL滅菌離心管中，加入10 mL酶解液，所用細胞壁降解酶為溶菌酶、裂解酶和蝸牛酶。先以2.5%酶解液濃度進行試驗，篩選適合的酶種類或組合，試驗設(shè)7個酶解體系，分別為溶菌酶、裂解酶、蝸牛酶、溶菌酶+裂解酶、裂解酶+蝸牛酶、溶菌酶+蝸牛酶和溶菌酶+裂解酶+蝸牛酶;根據(jù)已確定的最佳酶種類，按1.0%、1.5%、2.0%、2.5%和3.0%的酶解液濃度，在搖床上28 ℃ 80 r/min振蕩酶解2.0 h，確定最佳酶解濃度;最后根據(jù)最優(yōu)酶解體系分別將菌絲酶解1.0、1.5、2.0、2.5和3.0 h。用3層擦拭紙和1層紗布過濾酶解混合物到50 mL離心管中，室溫下3500 r/min離心10 min，收集原生質(zhì)體，用MTC緩沖液沖洗原生質(zhì)體后重懸，血球計數(shù)板計數(shù)。每處理3次重復(fù)，每重復(fù)計數(shù)5次。

1. 2. 2 咖啡炭疽菌對氯嘧磺隆敏感性測定 將BSC2-2菌餅（直徑5 mm）分別接種到含0、12.5、25.0、50.0、100.0、150.0和200.0 mg/L氯嘧磺隆的PDA培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)5 d，測量菌落直徑，每處理3 次重復(fù)。

1. 2. 3 原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化 參照高靜等（2011）的轉(zhuǎn)化方法，略有改動。調(diào)整原生質(zhì)體終濃度至1×107個/mL。將20～30 mL pCB1532-G質(zhì)粒加入200 mL原生質(zhì)體中，室溫下放置30 min;加入1 mL 40% PEG Buffer，混勻，室溫下放置25 min;將原生質(zhì)體混合液與200 mL溫熱的RM再生培養(yǎng)基混合倒板;培養(yǎng)基凝固后在平板上用10 mL Top Age培養(yǎng)基（含有篩選濃度的氯嘧磺隆）覆蓋，25 ℃倒置培養(yǎng)3 d。

1. 2. 4 轉(zhuǎn)化子鑒定

1. 2. 4. 1 利用GFP特異性引物對轉(zhuǎn)化子基因組進行PCR驗證 轉(zhuǎn)化子總DNA按照真菌基因組提取試劑盒使用說明進行提取。GFP特異性引物：GFP-F：5'-TACTGCAGATGGTGAGCAAGGGCGAG-3';GFP-R：5'-CGGGATCCCTTGTACAGCTCGTCCATG-3'。PCR反應(yīng)體系25.0 μL：0.5 μL rTaq聚合酶（5 U/μL），2.5 μL 10×PCR Buffer（含Mg2+），2.0 μL dNTPs（2.5 mmol/L），上、下游引物（10 μmol/L）各1.0 μL，1.0 μL DNA模板（30 ng/μL），滅菌ddH2O補足至25.0 μL。擴增程序：95 ℃預(yù)變性3 min;95 ℃ 1 min，60 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，進行35個循環(huán);72 ℃延伸5 min。

1. 2. 4. 2 轉(zhuǎn)化子熒光檢測 挑取轉(zhuǎn)化子分生孢子和菌絲樣品制片，在奧林巴斯FV1000激光共聚焦顯微鏡在藍光（488 nm）下進行熒光觀察、拍照。

1. 2. 5 轉(zhuǎn)化菌株生物學(xué)特性分析

1. 2. 5. 1 轉(zhuǎn)化菌株生長情況 轉(zhuǎn)化菌株及野生型菌株置于PDA培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)5 d后，在菌落邊緣打取0.5 cm×0.5 cm菌餅，置于新的PDA培養(yǎng)基上，28 ℃條件下培養(yǎng)，分別于接種后第3、4、5、6和7 d測量菌落直徑和觀察產(chǎn)孢情況，每處理4次重復(fù)。

1. 2. 5. 2 轉(zhuǎn)化菌株致病性測定 采用離體葉片傷口接種法，具體操作參照Cao等（2019）的方法。每處理4次重復(fù)。

1. 3 統(tǒng)計分析

試驗所得數(shù)據(jù)均采用SAS 9.0進行統(tǒng)計分析，并以Duncans新復(fù)極差法進行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2. 1 咖啡炭疽菌對氯嘧磺隆的敏感性測定結(jié)果

將BSC2-2在含有不同濃度梯度氯嘧磺隆的PDA培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)觀察，結(jié)果（圖1）顯示，培養(yǎng)5 d后BSC2-2菌落直徑隨氯嘧磺隆濃度的增加而逐漸變小，在200.0 mg/L氯嘧磺隆的PDA培養(yǎng)基上，BSC2-2生長被完全抑制，因此，選用200.0 mg/L氯嘧磺隆為轉(zhuǎn)化子的篩選濃度。

2. 2 原生質(zhì)體制備條件優(yōu)化結(jié)果

2. 2. 1 降解酶種類對原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響 由圖2可知，在單獨使用2.5%裂解酶作為細胞壁降解酶處理菌絲時，獲得的原生質(zhì)體產(chǎn)量最高，達4.03×105 個/mL，顯著高于其他處理的原生質(zhì)體產(chǎn)量（P<0.05，下同），其次是2.5%溶壁酶，2.5%蝸牛酶的效果最差，只獲得0.13×105 個/mL的原生質(zhì)體;2.5%裂解酶+2.5%溶壁酶組合使用時獲得的原生質(zhì)體產(chǎn)量為3.02×105 個/mL，效果不如單獨使用2.5%裂解酶。2.5%蝸牛酶+2.5%裂解酶、2.5%蝸牛酶+2.5%溶壁酶組合使用時，獲得原生質(zhì)體數(shù)量非常少。因此，選用2.5%裂解酶制備原生質(zhì)體。

2. 2. 2 裂解酶濃度對原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響 用含不同濃度裂解酶的酶解液處理菌絲，結(jié)果（圖3）顯示，在一定濃度范圍內(nèi)，原生質(zhì)體數(shù)量隨裂解酶濃度的升高而增加，當裂解酶濃度為2.5%時，釋放的原生質(zhì)體數(shù)量達最高值，為2.33×106 個/mL，顯著高于其他濃度處理;但裂解酶濃度升高到3.0%時，產(chǎn)生的原生質(zhì)體數(shù)量顯著減少。

2. 2. 3 酶解時間對原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響 用含2.5%裂解酶的酶解液分別酶解菌絲1.0、1.5、2.0、2.5和3.0 h，隨著酶解時間的延長，釋放的原生質(zhì)體數(shù)量呈上升趨勢，至2.5 h時釋放的原生質(zhì)體數(shù)量達最高值，為2.84×105個/mL，隨后開始減少（圖4），其中酶解2.0 h與酶解2.5 h的原生質(zhì)體產(chǎn)量間無顯著差異（P>0.05），因此，選擇2.0 h作為收集原生質(zhì)體用于遺傳轉(zhuǎn)化的最佳酶解時間。

2. 3 轉(zhuǎn)化子的分子驗證結(jié)果

將所有的轉(zhuǎn)化子在含氯嘧磺隆的PDA培養(yǎng)基上連續(xù)培養(yǎng)10代后，發(fā)現(xiàn)所有的轉(zhuǎn)化子仍可表現(xiàn)出對氯嘧磺隆的抗性，表明轉(zhuǎn)化子所獲得的抗性能穩(wěn)定遺傳。利用GFP基因的特異性引物GFP-F/GFP-R對隨機挑取的15個轉(zhuǎn)化子進行PCR擴增，結(jié)果（圖5）顯示，所有轉(zhuǎn)化子和質(zhì)粒均能在730 bp處擴增出單一條帶，而野生型菌株未能擴增出GFP基因片段，說明GFP基因已成功插入并整合到咖啡炭疽菌BSC2-2基因組中，且可穩(wěn)定遺傳。

2. 4 轉(zhuǎn)化子的顯微熒光觀察結(jié)果

隨機挑取轉(zhuǎn)化子，在激光共聚焦顯微鏡下觀察分生孢子，可觀察到明顯的綠色熒光（圖6）。說明GFP基因已成功整合到咖啡炭疽菌基因組中，且能很好地表達。

2. 5 轉(zhuǎn)化菌株與野生型菌株的生物學(xué)特性比較分析結(jié)果

2. 5. 1 生長情況差異分析 采用十字交叉法測量菌落直徑，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)化菌株與野生型菌株的菌落形態(tài)無差別（圖7），轉(zhuǎn)化菌株與野生型菌株生長速率無明顯差異（表1）。

2. 5. 2 轉(zhuǎn)化菌株致病性測定 選取大小相近的咖啡嫩葉作為接種材料，用接種針輕微刺傷葉片表面，然后將PDA上培養(yǎng)5 d的待測菌株取直徑5 mm的菌餅接種于葉片針刺傷口處，以無菌PDA為對照，接種5 d 后觀察葉片發(fā)病情況。結(jié)果（圖8）表明，轉(zhuǎn)化菌株及野生型菌株接種的咖啡葉片均出現(xiàn)病斑且病斑擴展速度無明顯差異，而對照未發(fā)病。

3 討論

PEG介導(dǎo)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化是真菌中應(yīng)用較廣泛的一種遺傳操作方法，具有轉(zhuǎn)化效率高、操作簡便及體系成熟等特點，已成熟應(yīng)用于稻瘟菌、鐮刀菌和炭疽菌等絲狀真菌遺傳轉(zhuǎn)化研究中（Sweigard et al.，1992; Gu et al.，2015;曹蘇珊等，2020）。本研究探索了原生質(zhì)體制備過程中酶組合、酶濃度和酶解時間等條件，并成功構(gòu)建了以GFP為報告基因、基于咖啡炭疽病菌的PEG轉(zhuǎn)化體系，為后續(xù)基因功能研究提供了技術(shù)支持。

與其他遺傳方法相比，PEG介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法具有操作簡單、不需要特殊儀器、周期短等優(yōu)點，已成為目前基因功能研究的常用方法之一。其中，制備高質(zhì)量的原生質(zhì)體是建立遺傳轉(zhuǎn)化體系的一個關(guān)鍵步驟，是影響轉(zhuǎn)化效率的關(guān)鍵因素之一。在制備原生質(zhì)體時，常用蝸牛酶、崩潰酶、溶壁酶和裂解酶等單一或多種酶類組合除去真菌細胞壁。由于不同真菌細胞壁成分有所差異，對裂解酶組合、裂解濃度和裂解時間也各不相同（張穎等，2014;張雷剛等，2018）。高靜等（2011）建立PEG介導(dǎo)的蘋果腐爛病菌遺傳轉(zhuǎn)化體系時，在纖維素酶、溶菌酶和蝸牛酶共同酶解菌絲2 h的條件下獲得高質(zhì)量的原生質(zhì)體;楊樹炭疽菌中以1%裂解酶酶解菌絲3.5 h，獲得108個/mL的原生質(zhì)體（劉玲玲等，2017）。本研究單獨使用2.5%裂解酶處理咖啡炭疽菌2.0～2.5 h時獲得的原生質(zhì)體產(chǎn)量最高，其次是2.5%溶壁酶，單獨使用2.5%蝸牛酶制備原生質(zhì)體的效果最差;2.5%裂解酶+2.5%溶壁酶+2.5%蝸牛酶組合使用未能提高酶解效果。因此，在制備原生質(zhì)體時應(yīng)篩選適合的細胞壁裂解酶和裂解時間。

使用有效抗生素標記篩選轉(zhuǎn)化子是關(guān)鍵步驟。在轉(zhuǎn)化炭疽菌屬真菌時，潮霉素基因是目前使用較廣泛的選擇標記，對節(jié)黧豆炭疽菌（Robinson and Sharon，1999）、芒果炭疽菌（張俊等，2011）、黃瓜炭疽病菌（Zhou et al.，2011a）、鱷梨炭疽菌（Zhou et al.，2011b）、楊樹炭疽菌（李思蒙等，2013）和蘋果炭疽菌（王海艷等，2013）等的生長有良好的抑制效果，抑制濃度為50～300 mg/L。本研究的咖啡炭疽菌菌株對潮霉素基因的敏感性不高，轉(zhuǎn)化時易挑取假陽性菌株，而該菌株對氯嘧磺隆的敏感性較高。由此看來，潮霉素對刺盤孢屬不同種的生長抑制存在明顯差異，可能與病菌種間和復(fù)合種內(nèi)的生理特性差異有關(guān)。

4 結(jié)論

以咖啡炭疽菌野生型菌株BSC2-2為受體，通過PEG介導(dǎo)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法將含有氯嘧磺隆標記和GFP報告基因的質(zhì)粒pCB1532-G轉(zhuǎn)入BSC2-2原生質(zhì)體中，獲得與野生型菌株在菌落形態(tài)、生長速率及致病性上無明顯差別的轉(zhuǎn)化子，成功建立了PEG介導(dǎo)的咖啡炭疽菌遺傳轉(zhuǎn)化體系，為研究咖啡炭疽菌的基因功能和致病機理提供技術(shù)支持。

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（責任編輯 麻小燕）

收稿日期：2020-03-09

基金項目：國家重點研發(fā)計劃項目（2018YFD0201100）

作者簡介：*為通訊作者，易克賢（1963-），博士，研究員，博士生導(dǎo)師，主要從事抗性育種研究工作，E-mail：yikexian@126.com。陸英（1976-），博士，副研究員，主要從事植物病理學(xué)研究工作，E-mail：ytluy2010@163.com