李枝玲　孔祥軍　鄭杰　韋美玲　李斌　周瑞陽

摘要：【目的】通過對海島棉不育系H276A及其育性恢復材料H268進行三角狀五肽重復蛋白（PPR）家族基因鑒定及比對分析，獲得序列存在差異的PPR基因，為后續(xù)育性恢復基因（Rf）的發(fā)掘提供理論基礎?！痉椒ā客ㄟ^生物信息學分析海島棉PPR基因，并對其進行亞細胞定位預測與功能注釋分析;采用Illumina HiSeq 4000高通量測序技術對海島棉H276A及H268對PPR蛋白家族基因進行轉錄組測序，將篩選獲得的PPR蛋白與其他植物具有育性恢復的PPR蛋白進行氨基酸序列同源比對并構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。【結果】鑒定獲得912個PPR基因，其中有846個在海島棉H276A和H268間存在序列差異，且分別存在7226個SNP差異位點和301個InDel差異位點，其中作用于線粒體的PPR基因有2143個SNP差異位點和134個InDel差異位點。轉錄組測序結果顯示，共檢測到表達基因數量為68197個，其中已知基因56311個、新基因11886個，可滿足后續(xù)數據分析。GO功能注釋結果顯示，PPR基因主要富集于生物學過程，富集于分子功能的PPR基因最少。50.0% PPR蛋白定位于線粒體，29.0% PPR蛋白定位于葉綠體，0.9% PPR蛋白定位于細胞核，20.0% PPR蛋白定位于胞外，0.1% PPR蛋白定位于細胞質膜。xp_016708712（LOC107923023）和xp_016710013（LOC107924193）與多個具有育性恢復功能的PPR蛋白氨基酸序列相似性達33%，說明二者親緣關系較近，且亞細胞定位于線粒體?！窘Y論】xp_016708712和xp_016710013 2個PPR蛋白可能與海島棉不育系H276A育性恢復相關，可用于發(fā)掘海島棉CMS的Rf基因。

關鍵詞： 海島棉;PPR蛋白家族基因;轉錄組測序;生物信息學分析;SNP;InDel

中圖分類號： S562 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2020）11-2614-12

Identification and SNP/InDel analysis of H268 PPR protein family genes in Gossypium barbadense

LI Zhi-ling， KONG Xiang-jun， ZHENG Jie， WEI Mei-ling， LI Bin， ZHOU Rui-yang*

（College of Agriculture，Guangxi University， Nanning ?530004， China）

Abstract：【Objective】Through the identification of pentatricopeptide repeat protein PPR protein family genes and comparative analysis of gene sequence between male sterile line H276A and fertility restoration material H268 of Gossy-pium barbadense，the PPR protein coding genes with sequence difference was obtained. It provided a theoretical reference for the further mining of fertility restoration（Rf） genes. 【Method】The PPR genes of G. barbadense were identified by bioinformatics，and subcellular location prediction and gene function annotationanalysis were performed，then further high-throughput sequencing technology was used to identify the PPR protein family genes in G. barbadense H276A and H268 . Homologous alignment in amino acid sequencewas performed between the identified PPR protein and PPR protein with fertility restore genes，then the phylogenetic tree was constructed. 【Result】912 PPR protein coding genes were identified，846 among them were different in sequence between H276A and H268，7226 SNP differential loci and 301 InDel differential loci were obtained in total. Among them， PPR genes acting on mitochondria contained 2143 SNP differential loci and 134 InDels differential loci. Transcriptome sequencing results showed that a total of 68197 genes were detected，including 56311 known genes and 11886 new genes，which could meet the needs of subsequent data analysis. The results of GO functional classification showed that PPR genes were mainly enriched in biological processes and the least in molecular functions. 50.0% of PPR protein was located in mitochondria，29.0% in chloroplast，0.9% in nucleus，and the remaining 20.1% in plasma membrane and extracellular structure， 0.1 in cellular branch membrane.The results of homology alignment showed thatboth of the homology between xp_016708712（LOC107923023），xp_016710013（LOC107924193） and several identified PPR protein amino acids with fertility restoration function were more than 33%，which indicated that they were closely related ，and both of them were located in mitochondria. 【Conclusion】The PPR protein xp_016708712 and xp_016710013 maybe related to the fertility restoration of the male sterile line H276A. It can be used to explore the Rf gene of CMS in G. barbadense.

Key words： Gossypium barbadense; PPR protein family; transcriptome sequencing; bioinformatics analysis; SNP; InDel

Foundation item： National Natural Science Foundation of China（31571719）

0 引言

【研究意義】細胞質雄性不育（Cytoplasmic male sterility，CMS）是廣泛存在于高等植物中的一種自然現象，表現為母體遺傳、花粉敗育和雌蕊正常，其育性可被大多數育性恢復基因（Rf）恢復（Liu et al.，2011），且這些基因編碼三角狀五肽重復蛋白（Pentatricopeptide repeat，PPR），是三系配套進行雜交育種的生物學基礎。利用CMS系進行雜交制種，無需人工去雄，不僅節(jié)省人力物力，還可提高雜交種子的純度（劉加周，2008）。迄今為止，已從玉米（Cui et al.，1996）、高粱（Klein et al.，2001;Jordan et al.，2010）、矮牽牛（Bentolila et al.，2002）、水稻（Akagi et al.，2004;Huang et al.，2012）、蘿卜（Desloire et al. 2003;Wang et al.，2008;Yasumoto et al.，2009）和辣椒（Yeong et al.，2010）等植物中克隆獲得Rf基因。棉花是我國重要的經濟作物，具有顯著的雜種優(yōu)勢，但棉花Rf基因尚有待發(fā)掘。因此，研究海島棉育性恢復材料H268的PPR蛋白基因，對棉花優(yōu)良恢復系選育、雜種優(yōu)勢利用及Rf基因篩選均具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】目前，在已鑒定的Rf基因中，除玉米Rf2基因及水稻Rf2和Rf17基因（Fujii and Toriyama，2009;Itabashi et al.，2011）外，其他已知的Rf基因均編碼PPR蛋白。PPR蛋白家族廣泛存在于植物中，且大多數定位于線粒體和葉綠體，以35個簡并氨基酸為重復單位串連排列而成，對細胞質基因表達具有重要調控作用（Small et al.，2004;丁安明，2014）。與基因組相比，轉錄組具有時間和空間的限定，在不同的生長時期及環(huán)境下，同一細胞的基因表達情況存在差異（王莎，2013）。基于基因表達差異，利用Illumina高通量測序平臺的轉錄組測序技術能在單核苷酸水平下對任意物種的整體轉錄活動進行檢測，在分析轉錄本結構和表達水平的同時，還能發(fā)現未知轉錄本和稀有轉錄本，精確識別可變剪切位點及編碼序列單核苷酸多態(tài)性（cSNP），提供更全面的轉錄組信息（劉楚霄等，2016）。與傳統(tǒng)的芯片雜交平臺相比，轉錄組測序無需預先針對已知序列設計探針，即可對任意物種的整體轉錄活動進行檢測，可提供更精確的數字化信號、更高的檢測通量及更廣泛的檢測范圍，是目前深入研究轉錄組復雜性的強大工具（Trapnell et al.，2010）。單核苷酸多態(tài)性（SNP）是指基因組中單個堿基變異所引起的遺傳多態(tài)性，其變異類型主要包括轉換、顛換、缺失和插入。單堿基突變可導致蛋白發(fā)生變異，從而影響生命體有關性狀的生物學功能（唐立群等，2012）。插入缺失標記（InDel）通常指兩親本全基因組中的差異，相對另一親本而言，其中一個親本的基因組中存在一定數量的核苷酸插入或缺失（王莎，2013）。InDel廣泛分布于基因組中，適用于全基因組關聯分析、高密度遺傳圖譜的構建及圖位克隆等研究。隨著不同棉花種質資源數據庫的增加，可通過比較基因組學分析挖掘種間SNP/InDels變異情況（徐相波等，2006）。【本研究切入點】PPR蛋白主要定位于高等植物的線粒體中，通過對不育基因轉錄本進行剪接修飾，進而調控不育基因的表達，致使育性得以恢復。由于基因編碼區(qū)內的SNP/InDels可能會導致編碼氨基酸的種類發(fā)生變化，從而影響其功能。但目前鮮見有關海島棉H268 PPR基因家族鑒定及SNP/InDel分析的研究報道?！緮M解決的關鍵問題】采用生物信息學軟件對海島棉基因組進行PPR蛋白家族基因鑒定分析，并運用高通量轉錄組測序技術對海島棉不育系H276A和育性恢復材料H268進行轉錄組測序，篩選出差異表達的PPR基因和作用于線粒體的PPR基因，為后續(xù)育性的鑒別提供候選基因。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

海島棉CMS系H276A是本課題成員周瑞陽教授于2014年通過花粉管通道法創(chuàng)制的新型不育材料（劉冬梅，2014）;海島棉H268是在以不育系H276A為母本進行測交過程中發(fā)現的育性恢復材料（陳平，2018）。以上2種材料均種植于廣西大學農學院棉花種植基地，于開花期選取直徑3～5 mm的花蕾剝離花藥，液氮處理后于-80 ℃保存，用于轉錄組測序。

1. 2 PPR蛋白家族基因鑒定

下載海島棉的基因組（https：//cottonfgd.org/）構建本地數據庫。使用HMMER 3.0和PPR蛋白家族的保守結構域Pfam（PF01535）的隱馬爾可夫模型（HMM）對海島棉基因組功能注釋的蛋白序列進行對比檢索，獲得海島棉預測候選PPR蛋白序列。此外，利用HMMER 3.0中的hmmbuild構建海島棉PPR蛋白的隱馬爾可夫模型，并搜索海島棉蛋白數據庫（E<1e-5）搜索鑒定出具有海島棉PPR蛋白結構域的蛋白。同時，利用在線工具CDD、InterPro和PFAM數據庫對獲得的PPR蛋白進行鑒定，篩選出具有PPR結構域序列的PPR蛋白用于后續(xù)分析。

1. 3 轉錄組測序

采用CTAB法提取海島棉H268花蕾的總RNA。使用Agilent 2100型核酸生物分析儀、NanoDrop核酸分析儀和1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其濃度及完整性。取3 μg總RNA樣品，適溫變性打開其二級結構，用攜帶Oligo（dT）的磁珠富集mRNA，將mRNA打斷成小片段，然后加入cDNA第一鏈合成劑反轉錄合成cDNA第一鏈，再配制雙鏈合成反應體系合成雙鏈cDNA。修復雙鏈cDNA末端，并在3'末端加上A堿基，使接頭與cDNA連接。最后使用Agilent 2100 Bioanalyzer檢測文庫的插入片段范圍，并以Illumina HiSeq 4000測序平臺進行高通量測序。

1. 4 生物信息學分析

利用SoftBerry（http：//linux1.softberry.com/）對鑒定得到的PPR蛋白進行亞細胞定位預測，利用ProtParam（https：//web.expasy.org/protparam/）預測海島棉PPR蛋白的理化性質。在Gene Ontology（GO）數據庫中對鑒定獲得的海島棉PPR蛋白進行功能注釋。根據基因組注釋信息，利用EditPlus鑒定篩選出作用于線粒體的PPR基因。結合轉錄組測序獲得的SNP/InDel注釋信息對作用于線粒體的PPR基因進行SNP/InDel分析，篩選出含SNP/InDel差異位點的基因。

1. 5 SNP位點克隆驗證

根據候選SNP位點，通過NCBI數據庫查到該位點前后各100 bp堿基序列作為模版，利用Premier 5.0設計特異性引物（表1）。為鑒定SNP位點的準確性，從作用于線粒體且有SNP差異的基因中隨機挑選10個基因進行克隆，膠回收純化后連接至pEASY?-Blunt Cloning Vector載體上，將連接產物轉化Trans1-T1感受態(tài)細胞，菌液涂布于含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)12 h，挑取陽性菌落。每基因至少取5個陽性克隆送至深圳華大基因股份有限公司測序。用DNAMAN 6.0將供試材料（H276A和H268）的基因測序結果與基因組編碼區(qū)序列（CDS）進行多重比對，通過序列比對找出SNP位點。

1. 6 系統(tǒng)發(fā)育進化分析

基于Poisson校正模型，利用極大似然法推導出海島棉PPR蛋白家族基因的演化歷史。利用鄰接法（Neighbor-joining）和BioNJ算法構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹：基于JTT模型估算的成對距離矩陣，選擇具有較高對數似然值的拓撲，自動得到啟發(fā)式搜索的初始樹，并按比例繪制，分支長度以每個站點的替換數量來度量，分析涉及47個氨基酸序列，所有站點覆蓋率低于95%的位置均被淘汰。使用MEGA 7.0對相似性較高的10個氨基酸序列與其他植物中具有育性恢復功能的PPR蛋白氨基酸序列構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹（Kumar et al.，2016）。

2 結果與分析

2. 1 PPR蛋白家族基因鑒定及理化性質分析結果

使用隱馬爾可夫模型搜索含PPR蛋白家族保守結構域的蛋白，并結合生物信息學分析鑒定出PPR基因，共獲得1269個PPR基因，剔除重復序列后最終獲得912個PPR基因（表2）。理化性質預測結果顯示，PPR蛋白的氨基酸殘基數為77～1476個，分子量為8.66～16.69 kD，理論等電點（pI）為4.68～10.08，總平均親水性為-0.784～0.411，不穩(wěn)定系數為17.02～60.28，脂肪系數為65.92～115.89。由圖1可知，68.0% PPR蛋白的pI屬于堿性范圍，富含堿性氨基酸;63.0% PPR蛋白為親水蛋白，以親水性氨基酸居多;70.0% PPR蛋白的穩(wěn)定性較好;94.0% PPR蛋白為脂溶性蛋白，以脂溶性氨基酸居多，具有較好的脂溶性（圖1）。

2. 2 海島棉H268轉錄組測序結果

采用Illumina HiSeq 4000測序平臺對海島棉H268的2個不同單株進行轉錄組測序，結果（表3）顯示平均每單株樣品獲得8.38 Gb的轉錄組數據，原始數據（Raw reads）均為61530000條，經過濾處理后分別獲得55771950和55958762條高質量序列（Clean reads）。再以Q20值（≥95.00%）作為測序結果評價標準，結果顯示，2個單株樣品的Q20值均大于98.00%，說明測序結果可靠。將Clean reads比對至陸地棉基因組，發(fā)現2個單株樣品的總比對率分別為86.72%和86.71%，比對到參考序列唯一位置的比對率分別為63.79%和64.67%，說明樣品間比對率無明顯差異，表明樣品間的數據具有可比性。此外，測序結果還顯示，共檢測到表達基因數量為68197個，其中已知基因56311個、新基因11886個，可滿足后續(xù)的數據分析。

2. 3 PPR基因家族的生物信息學分析結果

GO功能注釋結果（圖2）顯示，PPR基因主要富集于生物學過程，其次是細胞組分，以富集于分子功能的PPR基因最少。在生物學過程方面，富集于生物過程的PPR基因最多，其次是細胞過程、代謝過程和含核堿化合物代謝過程，此外，部分PPR基因富集于胚胎發(fā)育、授粉及非生物刺激反應等;在細胞組分方面，富集于質體的PPR基因最多，其次是細胞、細胞質、線粒體和細胞成分，還有少部分PPR基因富集于細胞膜，可能PPR蛋白與信號轉導、脅迫響應有關;在分子功能方面，富集于RNA結合和核酸結合的PPR基因最多，富集于結合、結構分子活性和結合活性的PPR基因相對較少。海島棉PPR蛋白家族的亞細胞定位預測結果表明，50.0% PPR蛋白定位于線粒體，29.0% PPR蛋白定位于葉綠體，0.9% PPR蛋白定位于細胞核，20.0% PPR蛋白定位于胞外，剩余的0.1% PPR蛋白定位于細胞質膜（圖3）。

2. 4 PPR基因SNP/InDel分析結果

將海島棉H268轉錄組數據與H276A和H276B的轉錄組數據（孔祥軍，2017）進行比對，獲得含SNP和InDel差異位點的基因，分別為835567和120995個，通過與鑒定獲得的912個PPR基因比對篩選出含SNP差異位點的PPR基因845個，含InDel差異位點的PPR基因220個（表4）。結合基因組注釋信息，利用EditPlus進行比對鑒定，共獲得作用于線粒體的PPR蛋白基因484個。結合轉錄組注釋信息篩選具有SNP和InDel差異且作用于線粒體的PPR基因，其中含SNP差異位點的基因445個，含InDel差異位點的基因104個（表4）。

2. 5 SNP克隆驗證結果

剔除假陽性克隆后獲得3組可靠的測序結果，將基因測序結果與基因組CDS進行比對，結果（表5）表明，在海島棉H276A與H268的基因測序結果比對中，LOC107924644和LOC107918366基因分別含有2和1個SNP差異位點，以LOC107937842基因SNP差異位點數最多，為18個（圖4）;在海島棉H276A的基因測序結果與基因組CDS比對中，LOC107918366和LOC107924644基因不存在SNP差異位點，LOC- 107937842基因有5個SNP差異位點（圖5）;在海島棉H268的基因測序結果與基因組CDS比對中，LOC107924644、LOC107918366和LOC107937842基因均存在SNP差異位點，其中，LOC107937842基因SNP差異位點最多，為19個（圖6）。經檢驗所有差異位點與轉錄組測序所得位點匹配，進一步驗證測序結果的可靠性。

2. 6 海島棉PPR基因家族育性恢復基因候選分析

在NCBI和EMBL網站搜索植物中已鑒定的具有育性恢復功能的PPR蛋白氨基酸序列，然后與鑒定獲得的PPR蛋白氨基酸序列構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹（圖7），結果發(fā)現，同一物種間進化關系較近，不同物種間分化程度較高，說明PPR基因家族在不同物種間存在一定差異;xp_016708712和xp_016710013與多個具有育性恢復功能的氨基酸序列親緣關系較近，且亞細胞定位預測均定位于線粒體，推測二者具有一定的育性恢復作用。通過DNAMAN 6.0進行比對，結果發(fā)現在鑒定獲得的PPR蛋白氨基酸序列中，與其他植物中具有育性恢復功能的PPR蛋白氨基酸序列相似性25%以上的共有10個，其中，xp_016708712（LOC107923023）與xp_016710013（LOC107924193）與多個具有育性恢復功能的PPR蛋白氨基酸序列相似性達33%。

3 討論

3. 1 PPR基因家族鑒定

隨著不同物種基因組測序的完成，PPR基因家族成員鑒定也取得長足進展。目前，除了模式植物煙草（丁安明，2014）、擬南芥（Liu et al.，2016b）和水稻（Chen et al.，2018）外，番茄（丁安明等，2014）、谷子（Liu et al.，2016a）、甘藍型油菜（譚暉和官春云，2017）、小麥（郭彩娟等，2019）等物種的PPR基因家族也被鑒定，且研究發(fā)現PPR基因能參與線粒體和葉綠體基因轉錄后加工、調控雄性不育相關基因表達、參與胚胎形成和逆境防御等（丁安明等，2013）。本研究對海島棉PPR基因家族進行鑒定，剔除重復序列后共獲得912個PPR基因，成員數量較多，與丁安明（2014）、郭彩娟等（2019）研究結果相似，表明PPR基因家族成員眾多。

Lahmy等（2000）通過熒光蛋白定位試驗和Wes-tern boltting證實擬南芥P67定位于葉綠體。Lurin等（2004）通過軟件分析和熒光蛋白定位均證實大部分擬南芥PPR蛋白定位于線粒體或葉綠體。Schmitz-Linneweber等（2006）利用RNA免疫沉淀技術證實玉米PPR4蛋白定位于葉綠體。丁安明等（2014）研究發(fā)現，60% PPR蛋白定位于線粒體和葉綠體。本研究亞細胞定位預測結果顯示，79.0%PPR蛋白定位于線粒體和葉綠體，與上述前人研究結果相似，故推測PPR基因參與線粒體和葉綠體基因轉錄后加工。此外，研究發(fā)現PPR蛋白具有RNA結合活性，推測其參與RNA加工，可與靶RNA的特異位點直接發(fā)生相互作用（丁安明等，2014）;擬南芥P67與玉米CRP1均具有RNA結合活性（Lahmy et al.，2000）;水稻OsPPR1參與葉綠體RNA加工及質體早期生物合成（Gothandam et al.，2005）。本研究的GO功能注釋結果顯示，較多PPR蛋白具有核酸結合活性和蛋白結合活性，還參與核堿化合物代謝過程、生物進程、代謝和細胞過程等，且部分PPR蛋白還參與胚胎發(fā)育、授粉及非生物刺激反應等生物過程;在細胞組分方面，富集于質體的PPR基因最多，還有少部分PPR基因富集于細胞膜，可能PPR蛋白與信號轉導、脅迫響應有關，與丁安明等（2014）對絨毛狀煙草PPR蛋白的GO注釋結果基本一致。

3. 2 SNP/InDel分析

在功能基因的圖位克隆中常需高密度的分子標記，但目前公布的各種分子標記密度均未達到令人滿意的程度。InDel和SNP分子標記是新型的分子標記類型，基本可滿足精細定位目的基因的需求。InDel和SNP分子標記經濟實用、特異性高、穩(wěn)定性好（曹立超等，2014）。本研究通過轉錄組測序獲得作用于線粒體的PPR基因中分別有2143個SNP差異位點和134個InDel差異位點，為后續(xù)海島棉CMS育性恢復基因的發(fā)掘提供了重要依據。

3. 3 作用于線粒體的PPR蛋白及育性恢復

PPR基因家族作為一類重要的恢復基因，在植物的生長發(fā)育和細胞器基因的表達調控等多種生物學過程中發(fā)揮至關重要的作用（Zhao et al.，2018）。已有研究表明，雄性植株含有Rf基因，能拮抗細胞質線粒體中的CMS誘導基因（CMS-inducing gene）。在胞質雄性不育系統(tǒng)中，CMS誘導基因能表達產生疏水的CMS特異性多肽（CMS-specific pelypeptide），Rf基因編碼的PPR蛋白能調控CMS誘導基因的表達水平，通過降低或抑制不育相關基因的轉錄，降低有毒蛋白的水平，從而促使CMS植株恢復育性（Bentolila et al.，2002;劉天驕等，2017）。含有異常開放閱讀框（ORF）的線粒體RNA會導致雄性不育，Rf基因所表達的PPR蛋白能與這些線粒體RNA相結合而抑制其表達（Kazama et al.，2008;Uyttewaal et al.，2008）。含16個PPR基序的蘿卜恢復基因Rfo（Rfk1），雖對線粒體基因ORF125轉錄本的含量無影響，但影響其蛋白翻譯或翻譯后的加工過程（Desloire et al.，2003;Kazama and Toriyama，2003）;含有14個PPR基序的矮牽牛育性恢復基因Rf-PPR592可能通過影響線粒體基因PCF轉錄本的表達量，而在一定程度上減少PCF蛋白含量（Mili and Pind-Roma，2003;Koizuka et al.，2003）;水稻BT型恢復基因Rf-1具有16個PPR基序，參與線粒體基因atp6轉錄本的表達（Alfonso et al.，2004;Komori et al.，2004）。PPR基因可改變與胞質不育相關基因的表達水平，通過阻止線粒體誘導基因編碼蛋白的表達以恢復花粉育性（徐相波等，2006）。郭彩娟等（2019）通過與已報道的水稻育性恢復基因進行同源比對，結果獲得候選23個PPR基因，并結合結實率等重要農藝性狀表型分析初步確定4個PPR基因可能參與調控二系雜交小麥雜交種的育性恢復進程。本研究的同源比對分析結果表明，在鑒定獲得的PPR蛋白氨基酸序列中，與植物已鑒定具有育性恢復功能的PPR蛋白氨基酸序列相似性在25%以上的共有10個，其中xp_016708712和xp_016710013與多個具有育性恢復作用的氨基酸序列親緣關系較近，且亞細胞定位預測均定位于線粒體，故推測二者具有一定的育性恢復作用。

4 結論

xp_016708712和xp_016710013 2個PPR蛋白可能與海島棉不育系H276A育性恢復相關，可用于發(fā)掘海島棉CMS的Rf基因。

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