龔團蓮

（內(nèi)蒙古民族大學動物科學技術學院 028042）

獸用藥物種類和應用規(guī)模越來越廣，化學結(jié)構和成分日益變復雜、多樣化。 并且追求高效、快速、低劑量化。 人們對長期攝入低水平、劣質(zhì)藥物殘留所導致的各種慢性及遠期效應進行全面關注[1]。

在畜牧業(yè)中，抗生素被廣泛作為藥物添加劑用于畜禽防治微生物感染和抑制細菌生長，但其在動物性食品中的殘留對消費者健康存在潛在威脅。 動物性食品從古至今都是人類能量的來源，如果其中含有抗生素，對消費者來說等于服用小劑量抗生素，抗生素殘留可把人體致病菌和有益菌同時消滅，也可導致體內(nèi)某些致病菌產(chǎn)生耐藥性，一旦患病者再次用同種抗生素治療很難見到療效，從而降低人們對病菌的免疫能力。 結(jié)果表明，細菌耐藥性與細菌耐藥基因有密切相關，細菌耐藥基因主要位于細菌染色體和質(zhì)粒上。 耐藥質(zhì)?？赏ㄟ^接合、轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導等方式轉(zhuǎn)移，使耐藥菌株增加，因此，消除耐藥質(zhì)粒對控制細菌耐藥性的傳播有重要意義[2]。 本文主要介紹中草藥白頭翁和艾葉的有效成分提取物對大腸桿菌抑菌作用的研究。 有研究表明，白頭翁和艾葉對大腸桿菌均有一定抑菌效果，中草藥屬于純天然藥物，具有抗菌，抗毒素，提高免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)功能，具有無污染、副作用小、殘留毒素少，不容易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點，在中藥醫(yī)學中發(fā)揮了預防和抑制細菌性感染疾病的重要作用[3]。 同時從天然中草藥中篩選抗菌藥物用于防治疾病已成為解決抗生素濫用問題的有效途徑之一[4]。

1 白頭翁與艾葉的概述

1.1 白頭翁簡介

中藥白頭翁為毛茛科植物，銀蓮花屬多年生草本植物。 別名有老翁花、奈何草、老姑草等。 具有清熱解毒、涼血止痢、除濕殺蟲的作用[5]。 白頭翁有效成分有三萜皂苷、木脂素、三萜酸、白頭翁靈、白頭翁素、白頭翁英、原白頭翁素、胡蘿卜苷及糖蛋白等成分[6]。

據(jù)報道，近幾年對白頭翁傳統(tǒng)抗菌、抗病毒、抗病原蟲的作用較為深入研究。 白頭翁提取物對金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、大腸桿菌、熱帶假絲酵母[7]白色葡萄球菌、炭疽桿菌、乙型鏈球菌等均有明顯抑菌作用[8]。 同時也可抗病原微生物、寄生蟲、治療內(nèi)毒素血癥、護肝、殺精、短時間內(nèi)可殺死陰道滴蟲。 白頭翁素具有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛及抗痙攣等作用[9]。

白頭翁除了抗菌抑菌和抗原蟲作用外還具有抗癌、抗腫瘤、增強免疫功能、抗炎等作用[10]。 同時對消化系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)、造血系統(tǒng)及婦科等多種疾病均有治療作用。但白頭翁新鮮時有毒，如誤食易引起胃腸炎和便血； 可作土農(nóng)藥常用來殺蟲蛹。

1.2 艾葉簡介

艾葉屬于菊科類植物，具有濃烈清香味。 艾葉辛、苦、溫、歸肝脾腎經(jīng)、有散寒止痛、少腹刺痛、溫經(jīng)通絡、暖宮調(diào)經(jīng)、安胎的作用，為 “止血良藥” 也是中醫(yī)婦科常選的草藥[11]。 在眾多期刊上了解到艾葉的有效化學成分主要有揮發(fā)油，黃酮類、其次有三萜類、鞣質(zhì)類、桉葉烷類、多糖類及微量元素等[12]。 艾葉所含的組分繁多而復雜，其主要成分含量與組分含量隨產(chǎn)地、品種類別、栽培環(huán)境、采收時間等不同有所差異。

現(xiàn)代藥理研究中表明，艾葉提取液具有抗病毒、抗菌、鎮(zhèn)咳、祛痰、平喘、消炎、抗過敏、護肝利膽、促進消化、鎮(zhèn)靜等諸多藥理作用[13]。 對多種細菌病毒有抑制作用，如白喉桿菌、結(jié)核桿菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、大腸桿菌等[14]。臨床上主要用于經(jīng)寒不調(diào)、安胎、殺蟲止癢此外，還常用于皮膚科疾病，消化系統(tǒng)疾病、腫瘤、瘧疾、痹痛、小兒陰縮癥[15]。 同時也可對口腔支原體病原、肺炎支原體病原多較為顯著抑制作用[16]。 艾葉資源豐富、廉價、低毒，是一種廣譜的抗菌抗病毒的草藥。

2 實驗材料與儀器

2.1 材料

白頭翁飲片、艾葉飲片 （華天制藥有限公司供應）。

2.2 菌株來源

菌株來源： 內(nèi)蒙古民族大學 （微生物實驗室）。

菌株種類： 三元豬場分離的大腸桿菌桿、肝臟大腸桿菌（第1 次提?。⒏闻K大腸桿菌 （第2 次提?。⒏闻K大腸桿菌（第3 次提?。?、肝臟大腸桿菌 （第4 次提取） 蒙鵝鵝業(yè)大腸桿菌、豬大腸桿菌桿、大鳥鵝業(yè)大腸桿菌桿G3、標準大腸桿菌。

2.3 儀器

分析天平 （塞多利斯科學儀器有限公司），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE-529991282 (上海亞榮生化儀器)，循環(huán)水真空泵SHZ-Ⅲ（上海亞榮生化儀器廠），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE-529991282 (上海亞榮生化儀器)，pH 計 （PHS-3C） 上海儀電科學儀器股份有限公司，電子天平稱TD1000LC (天津天馬街基儀器有限公司)，XMTD-701S42-Ⅲ型循環(huán)水真空泵 （上海亞榮生化儀器廠），DF-101S 集熱式磁加熱攪拌器XMTD-70 （金壇市瑞儀華儀器有限公司），清洗超聲儀SK1200H (上?？茖С晝x器有限公司)，打孔器 B2914、濾紙 (新華一號)、三角瓶、燒杯、量筒、玻璃棒、培養(yǎng)皿、試管、青霉素小瓶、重量瓶、涂布器、鑷子、接種環(huán)、移液槍、槍頭、移液管、酒精燈、酒精棉球、記號筆、冷凝管。

2.4 試劑

蛋白胨、瓊脂粉、牛肉浸膏、氯化鈉均為分析純； 氫氧化鈉、硫酸、氯化鋇、乙醇。

2.5 原料藥物

硫氰酸紅霉素、硫酸安普霉素、恩諾沙星、氟苯尼考、鹽酸環(huán)丙沙星、替米考星、磺胺喹噁啉鈉、乳酸諾氟沙星、硫酸新霉素、磺胺氯丙嗪鈉 （以上藥物均為醫(yī)療級原粉）。

3 白頭翁、艾葉有效成分的提取

3.1 中藥有效成分提取概述

中草藥隨不同成分而有不同程度的溶解性和分子極性，水煎劑為最古老的服用方法之一。 目前研究表明，大多中草藥抑菌中使用的是水提取法，以水作為溶劑提取有效成分，這可能會導致某些非水溶性有效成分的損失，除了水以外還有親水性有機溶劑及親脂性有機溶劑，如氯仿、乙醚、乙醇、丙酮等。另外，提取法有熱回流、蒸餾、滲渡法、超聲法等，在提取過程中時間、溫度、提取法等都會影響有效成分的提取，從而導致其抑菌效果[17]，提取工藝涉及提取、分離、濃縮、純化精制、干燥等過程[18]。 在白頭翁和艾葉提取工藝中，白頭翁提取參考宋科標、時維靜[19]等采取熱回流提取法和超聲法，其中選擇水和70%的乙醇作為溶劑，水提取作為對照，70%的乙醇提取率最為高，所以用70%的乙醇在不同時間內(nèi)提取，超聲時間不要過長，篩選最佳提取率，而艾葉提取工藝中參考馮麗娟、孫志勇等[20]報道，用艾葉3 種不同有效成分提取法作為實驗方案，方法有水煎、有機溶劑，超聲法等對艾葉提取法進行正交實驗表的設計，篩選艾葉最佳抑菌效果工藝，不同提取法可有效證明白頭翁和艾葉提取液對不同來源大腸桿菌的抑菌效果，在實驗中進一步探索和比較不同提取法及時間、溫度等問題，以最佳提取工藝發(fā)揮中草藥的抑菌作用。

3.2 白頭翁與艾葉的提取

3.2.1 白頭翁的提取工藝

（1） 超聲法： 精確稱取白頭翁粉，分別加入水和乙醇，超聲 20min 和 30min，過濾，減壓濃縮至藥液含量為 1g/ml，灌入安瓿冷藏備用，參見表1。

（2） 回流法： 精確稱取白頭翁粉分別加入水和乙醇，加熱回流 60min 和 90min，提取兩次，趁熱過濾，合并濾液，減壓濃縮至藥液含量為1g/ml，灌入安瓿冷藏備用，參見表1。

3.2.2 艾葉提取液的制備

（1） 水煎煮法： 分別精確稱取艾葉粉25g，加入不同倍量的水，在不同時間內(nèi)水煎煮提取并抽慮，減壓濃縮至藥液含量為1g/ml 灌入安瓿冷藏備用。

（2） 有機溶劑法： 分別精確稱取艾葉粉25g，加入水和不同體積濃度的乙醇、在不同時間內(nèi)提取，抽濾濃縮至藥液含量為1g/ml 備用。

（3） 超聲法： 分別精確稱取艾葉粉25g，加入水和不同體積濃度的乙醇進行不同時間的超聲波提取，抽濾濃縮至藥液含量為1g/ml 備用。

表1 白頭翁提取工藝流程

艾葉采取正交實驗進行提取，以提取時間、提取方法、料液比例、溶媒為主要因素，采取L9 （34） 正交實驗設計表，對艾葉的有效成分的最佳提取工藝進行研究，參見表2、表3。

表2 實驗因素水平表

表3 正交設計實驗安排表

3.2.3 中藥提取物的浸膏得率

白頭翁提取工藝中最佳水回流60min 提取浸膏率為31%，艾葉第九組實驗提取率最佳為27.6%。

4 耐藥菌株篩選

4.1 藥敏片制備

（1） 選新華1 號定型濾紙，用打孔器打成直徑為6mm 的小圓片1000 片，將100 個作為一組。

（2） 將10 個安瓿清洗干凈，放入烘干箱設50℃烘干。

（3） 把1000 個圓濾紙片分裝到10 個小瓶中，并將小瓶的瓶口用棉塞住，在121℃條件下高壓蒸汽鍋滅菌30min，置37℃恒溫烘干備用。

（4） 把烘干好的圓紙片放入重量瓶中，每瓶100 個紙片。

4.2 藥液配置

按抗生素藥物使用說明書濃度規(guī)格換算成一個基本單位藥量，用基本單位藥量精確稱取配料，換算按1g 需加水量，相當于配制藥液所加蒸餾水毫升數(shù)。 硫酸安普5g 可拌25kg 飼料，其換算方法為0.5g 本品加2500ml 蒸餾水，其他抗生素硫氰酸紅霉素原料藥15mg、硫酸安普霉素10mg、恩諾沙星20mg、氟苯尼考10mg、鹽酸環(huán)丙沙星20mg、替米考星10mg、磺胺喹惡啉鈉30mg、乳酸諾氟沙星20mg、硫酸新霉素10mg、磺胺氯丙嗪鈉10mg 倒入10ml 容量瓶中，加蒸餾水定容至10ml，使其完全溶解。 從容量瓶中用移液槍將藥液抽取1ml，倒入裝濾紙片容量瓶中，浸泡0.5h 后放入恒溫烘干箱內(nèi)烘干30min。 用無菌鑷子取出濾紙裝入安瓿冷凍-20℃保存[21]。

4.3 制備培養(yǎng)基

（1） 取 20 個培養(yǎng)皿，10 個試管清洗干凈，晾干。 用報紙包好培養(yǎng)皿，在121℃下高壓蒸汽滅菌鍋滅菌30min。

（2） 瓊脂培養(yǎng)基： 稱取蛋白胨 10g 牛肉粉 3g 氯化鈉 5g 加入1000ml 純化水，使其完全溶解。 用 NaOH 將其pH 調(diào)到 7.2～7.6。 再加入23g 瓊脂，攪半均勻。 并放在萬用電爐上加熱使其完全溶解。 然后分別裝到兩個500ml 的三角瓶中。 用棉塞塞住。 放在121℃條件下高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)滅菌30min 備用。

（3） 將配好的固體培養(yǎng)基傾倒在滅菌好的培養(yǎng)皿內(nèi)。 將底部覆蓋住并小于4mm。 傾倒后待其凝固，凝固后培養(yǎng)皿倒置。

（4） 同時把配置好的固體培養(yǎng)基倒入試管內(nèi)2/3 處，傾斜制成斜面培養(yǎng)基凝固，備用。

（5） 液體培養(yǎng)基的制備稱取蛋白胨 10g、牛肉粉 3g、氯化鈉5g 加入1000ml 純化水，使其完全溶解。 用NaOH 將其pH調(diào)到7.2～7.6。 然后分別裝到2 個500ml 的三角瓶中。 用棉塞塞住。 放在121℃的條件下高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)滅菌30min。 備用。

4.4 供試菌懸液的制備

4.4.1 接種

取供試的9 種大腸桿菌菌液接種到以配置好的斜面培養(yǎng)基上，在培養(yǎng)箱 37℃內(nèi)培養(yǎng) 16～18h，備用。

4.4.2 菌液稀釋

麥氏比濁法是McFarland 發(fā)明的用于細菌比濁的不同濁度的標準濁度管。 配制方法是根據(jù)氯化鋇和硫酸的比例來決定的，見表4，不同比例生成的硫酸鋇沉淀的濃度有明顯不同，并且都有一定值。

操作方法：

（1） 輕搖標準試管。

（2） 測定試管加入無菌生理鹽水，直到濃度與所要求的標準管濃度相似。

4.5 貼藥敏片

（1） 將已稀釋好供試的三元豬場分離大腸桿菌、肝臟大腸桿菌 （第1 次提?。?、肝臟大腸桿菌 （第2 次提?。?、肝臟大腸桿菌 （第3 次提取）、肝臟大腸桿菌 （第4 次提取）、蒙鵝鵝業(yè)分離大腸桿菌、豬大腸桿菌、大鳥鵝業(yè)分離大腸桿菌、標準大腸桿菌等9 種大腸桿菌分別用移液搶抽100ul 菌液，接種到以配好的平板培養(yǎng)基中，用涂菌環(huán)將菌液涂均勻。 然后將已制備好的藥敏片分別貼到已接種的培養(yǎng)基中，輕輕按壓，稍等片刻，并倒置培養(yǎng)基，同時在培養(yǎng)皿上用記號筆記錄菌液名稱、藥敏片名稱、涂菌日期。 置恒溫箱培養(yǎng)16～18h。

（2） 篩選耐藥菌株結(jié)果為肝臟大腸桿菌 （第1 次提?。⒏闻K大腸桿菌 （第2 次提?。?、肝臟大腸桿菌 （第3 次提?。?、肝臟大腸桿菌 （第4 次提?。?、蒙鵝鵝業(yè)分離大腸桿菌、豬大腸桿菌、標準大腸桿菌等菌株對幾類抗菌藥物較為敏感有抑菌圈，而三元豬場大腸桿菌，大鳥鵝業(yè)大腸桿菌具有一定程度的耐藥性，見表 5，表中 （+） 表示敏感、（-） 表示不敏感.

5 中藥提取物的抑菌效果

選擇白頭翁提取工藝中水回流60min 提取浸膏率最佳31%，艾葉提取中第九組實驗提取率最佳為27.6%，條件為50%乙醇16 倍稀釋超聲提取。

表4 麥氏比濁管的配比

表5 抗菌藥抑菌效果表

5.1 測試白頭翁與艾葉提取液對標準大腸桿菌株的抑菌效果

以標準大腸桿菌為對照，對三元豬場大腸桿菌和大鳥鵝業(yè)大腸桿菌進行中藥抑菌實驗。

將已制備好的平板培養(yǎng)基分成4 個區(qū)域標號分別為： 空白、25ul、50ul、100ul，用移液槍抽取已稀釋好的菌液 100ul，均勻涂在培養(yǎng)基上，然后選取最佳制備工藝的白頭翁和艾葉提取液各一個在菌液上涂藥液，用移液槍分別抽25ul、50ul、100ul 藥液涂均勻，置培養(yǎng)箱37℃內(nèi)培養(yǎng)16～18h。

結(jié)果表明，空白和白頭翁涂25ul 藥液部分有明顯長菌，而50ul 和100ul 沒長菌，具有一定的抑菌效果。 艾葉提取液25ul、50ul 沒有抑菌效果，而100ul 藥液有較小的抑菌效果。

5.2 白頭翁和艾葉的最小抑菌濃度的測定

5.2.1 選取提取液

從白頭翁和艾葉中選取乙醇提取和水提取濃度最高的2 個藥液，以標準大腸桿菌和耐藥菌株作為實驗研究對象，進行藥敏實驗。

5.2.2 菌液稀釋

取菌液稀釋至108 倍，取2ml 加入肉湯稀釋至200ml 備用。

5.2.3 稀釋抗菌藥物的制備及菌液接種

取無菌試管7 支，排放成一排，第一管加8ml 肉湯外其余的6 個管加5ml 肉湯，在第一管加入抗菌藥原液2ml，用移液槍吸出混勻，然后吸取5ml 至第2 管，混勻稀釋再吸取5ml 至第3 管，如此連續(xù)倍比稀釋至第6 管，并從第6 管中吸取5ml棄去，第7 管為不含藥物的生長對照。 然后在每管內(nèi)加入上述制備好的標準大桿稀釋菌液各1ml，第1～5 管藥物濃度分別為0.3、0.15、0.075、0.375、0.01875、0.009375/mg，將接種好的稀釋管塞好塞子，置37℃保溫箱內(nèi)16～18h[22]。

5.2.4 結(jié)果判斷與解釋

白頭翁乙醇回流提取的第1、2 試管沒有長菌，第3 個試管有較少細菌，剩下幾個試管都都有細菌生長。 所以最小抑菌濃度為0.5ml/mg，從艾葉正交實驗里挑選提取法最佳的，結(jié)果表明最小抑菌濃度為0.3ml/mg。

5.3 白頭翁、艾葉提取物對耐藥菌株抑菌效果

將稀釋好的三元豬大腸桿菌、大鳥鵝液大腸桿菌、標準桿菌分別抽取100ul 涂布于制備好的瓊脂培養(yǎng)基上，每個菌液涂6 個平板，在培養(yǎng)基上打距離相等的4 個孔，每孔直徑為6mm，孔間距約20mm，每平板上注入3 種不同提取法的藥液100ul，加于瓊脂孔內(nèi)，并在另一個孔內(nèi)加入蒸餾水作為空白對照，置培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)16～18h，觀察結(jié)果。

結(jié)果判定，如表6、7，白頭翁對3 種菌株有明顯的抑菌作用，而艾葉抑菌作用不明顯。

6 結(jié)果

在中藥提取實驗中，白頭翁采用水回流方法提取60min 提取浸膏得率為31%，該條件為最佳提取工藝； 艾葉提取的率最佳為第九組27.6%，條件為50%乙醇16 倍稀釋超聲提取。 通過對9 株不同來源的大腸桿菌進行藥敏實驗篩選耐藥性菌株，結(jié)果為三元豬場分離的大腸桿菌和大鳥鵝業(yè)分離的大腸桿菌具有較強的耐藥性，對篩選好的耐藥性菌和對照標準大腸桿菌同時進行白頭翁、艾葉提取物抑菌實驗。 結(jié)果表明，白頭翁提取液對3 種菌株均有一定的抑菌效果，而艾葉對3 種菌株有不同程度的抑菌效果，其效果不明顯，抑菌圈兒小。 研究表明，白頭翁有效成分白頭翁素具有一定的抑菌作用，抑菌效果明顯。 而艾葉中有效成分對大腸桿菌無明顯，抑菌效果。 但在本實驗中，中藥提取中存在抑菌效果不穩(wěn)定性、抑菌機理不清楚等問題，因此，要使中藥真正能做到高效抑菌可能還需進一步研究中藥抗菌機理。

表6 白頭翁提取液抑菌效果 （單位： mm）

表7 艾葉提取液抑菌效果 （單位： mm）

7 討論

隨著發(fā)展，中草藥已成為抗生素替代品的研究熱點之一。據(jù)研究表明，在白頭翁與艾葉有效成分提取工藝及有效成分鑒定分析技術日益改善。 同時，在白頭翁和艾葉的化學成分、藥理作用、臨床應用等方面有了較小進展。 但對白頭翁和艾葉的研究仍然存在不足，有待進一步研究。