張 帆， 劉 嘯， 阿迪力·麥木提敏， 安尼卡爾·安尼瓦爾，帕麗黛姆·圖爾迪， 吳佩玲

（新疆醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院口腔醫(yī)學診療中心，新疆維吾爾自治區(qū) 烏魯木齊 830000）

腮腺多形性腺瘤是由腫瘤上皮性組織和黏液樣或軟骨樣間質所組成的一種唾液腺腫瘤，WHO根據(jù)其組織病理學及生物學特性，將其界定為臨界瘤。該疾病手術治療后易復發(fā)，腫瘤浸潤包膜或多次復發(fā)后可導致腫瘤惡變[1]。研究發(fā)現(xiàn)，細胞遺傳學改變、細胞外基質蛋白、癌基因、抑癌基因及黏附分子，均在腮腺多形性腺瘤的發(fā)生、惡變過程中發(fā)揮了一定的作用[2]。谷胱甘肽過氧化物酶-3（GPX-3）是已知GPX家族中唯一的細胞外亞型，是體內重要的過氧化物分解酶之一，在清除過氧化氫及脂質過氧化物中起重要作用[3]。研究發(fā)現(xiàn)，GPX-3可以通過傳遞電子體使體內的磷脂、脂肪酸過氧化氫減少。過氧化氫可參與腫瘤細胞的各種生物學行為過程，如腫瘤細胞的增殖、移動及侵襲[4]。多種因素可導致GPX-3表達變化，并與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展相關，已有研究表明GPX-3在腫瘤組織中呈現(xiàn)低表達[5]。但國內外有關GPX-3在腮腺多形性腺瘤中表達的報道較為罕見。本研究通過熒光定量PCR及蛋白免疫印跡法檢測腮腺多形性腺瘤及瘤旁組織中GPX-3基因和蛋白的表達水平，來探討GPX-3的表達與腮腺多形性腺瘤發(fā)生與惡變的相關性，為腮腺多形性腺瘤的基因預測及治療提供新思路。

1 資料和方法

1.1 臨床資料

本研究隨機選取2017-06—2019-04期間，新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院、新疆醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院，以及新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院收集的標本（腮腺良性多形性腺瘤30例、腮腺多形性腺瘤瘤旁2 cm腺體組織30例、腮腺惡性多形性腺瘤10例）。其中男性42例，女性28例；50歲以上46例，50歲以下24例；腫瘤平均大小3.2 cm。納入標準：臨床病理診斷為腮腺良、惡性多形性腺瘤（圖1）及瘤旁2 cm腺體組織的手術樣本，且均未行任何輔助治療；患者同意并簽訂樣本留取知情同意書，并記錄患者臨床資料。排除標準：曾接受術前放療或化療患者的樣本組織。30例腮腺良性多形性腺瘤組織為良性組，30例腫瘤邊緣2 cm腮腺組織為正常組，10例腮腺惡性多形性腺瘤組織為惡性組。所有樣本均由2名經(jīng)驗豐富的主治醫(yī)師及以上級別的病理醫(yī)師診斷。根據(jù)腫瘤大小從腫瘤中心至邊緣分別取多個樣本，分別分成2份，1份放置液氮罐中凍存，另1份送病理檢查，經(jīng)病理證實后納入樣本。

1.2 主要試劑和儀器

主要試劑和儀器包括：Trizol試劑（Invitrogen公司，美國）、反轉錄試劑盒（Thermo公司，美國）、熒光定量PCR試劑盒（QIAGEN公司，德國）、GPX-3羊抗人多克隆抗體 （Abcam公司，英國）、兔抗人βactin多克隆抗體（Abcam公司，英國）、聚偏二氟乙烯膜（羅氏公司，德國）、Applied Biosystems 7500熒光定量PCR儀（ABI公司，美國）、凝膠成像儀（Bio-Rad 公司，美國）、酶標儀（Thermo 公司，美國）；GPX-3及β-actin引物均由上海生工基因合成。

圖1 腮腺良性多形性腺瘤（A）和腮腺惡性多形性腺瘤（B）的組織病理學表現(xiàn)（×100）Figure 1 Histopathological findings of benign pleomorphic adenoma of parotid gland (A)and malignant pleomorphic adenoma of parotid gland(B) （×100）

1.3 熒光定量PCR檢測GPX-3的mRNA表達

取100 mg組織，用眼科剪剪成小塊，置于組織勻漿機中研成粉末，加入1 mL Trizol試劑，靜置15 min；加入1/5體積的氯仿，混勻于冰上放置5 min。4℃下12 000 r/min離心15 min，吸取上清液至新的EP管中，加入等體積的異丙醇混勻，-20℃下放置0.5 h，4℃下12 000 r/min離心10 min。加入75%乙醇溶液1 mL，抽吸使沉淀物懸浮，4℃下12 000 r/min離心5 min，棄上清液，再次加入75%乙醇溶液；重復此步驟，后置于冰上待乙醇揮發(fā)；再加入適量焦碳酸二乙酯（DEPC）水，4℃12 000 r/min離心1 min，所得溶液即為總RNA。利用Nandrop分光光度計測定RNA濃度及A260/A280比值。根據(jù)試劑盒說明書，將RNA反轉錄為cDNA，以 cDNA為模板進行PCR擴增。采用相對定量法，以β-actin作為內參基因，相關目的基因及內參基因序列如表1所示。PCR體系為 20 μL，具體包括 2×SYBR Green PCR Master Mix、QN ROX Reference Dye 2 μL，上游、下游引物各 1.4 μL，RNase-free water 3.2 μL，cDNA 2 μL。并且每個樣本設置3個復孔，檢測3個生物學重復。反應條件為：95℃預變性 2 min；95℃變性5 s，60℃ 退火10 s，35個循環(huán)。在Applied Biosystems 7500熒光定量PCR儀器中進行，用 2-ΔΔCt法計算各組相對表達量，比較3組表達量的差異，并行統(tǒng)計學分析。

表1 熒光定量PCR引物序列Table 1 Real-time PCR primer sequences

1.4 蛋白免疫印跡法檢測GPX-3的蛋白表達

取100 mg組織，用眼科剪剪成小塊，置于組織勻漿機中研成粉末，加入1 mL的RIPA裂解液和10 μL的苯甲基磺酰氟超聲處理。處理完后置冰上裂解0.5 h，10 000 g/min離心10 min，取中層溶液即為所提蛋白，二喹啉甲酸（BCA）法測蛋白濃度。取20 μL蛋白在12%SDS-PAGE中進行電泳，半干法轉膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，4℃一抗孵育過夜。用1×TBST洗膜3次，每次15 min，加入二抗室溫孵育2 h。用 1×TBST洗膜 3次，每次15 min，之后在暗室中加入ECT發(fā)光劑進行顯影，Image Lab軟件分析各條帶灰度值，以GPX-3蛋白條帶與β-actin蛋白條帶的比值作為GPX-3蛋白的相對表達量。實驗重復3次，比較3組表達量的差異，并行統(tǒng)計學分析。

1.5 統(tǒng)計學處理

使用SPSS 21.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析,采用K-S檢驗數(shù)據(jù)是否呈正態(tài)分布,Levene檢驗方差齊性，GPX-3 mRNA及蛋白表達量采用均數(shù)±標準誤表示，不符合正態(tài)分布則使用秩和檢驗,多組組間差異性檢驗采用ANOVA方差分析,兩兩比較以對照組為參照進行Dunnett檢驗,GPX-3在不同年齡、性別及腫瘤大小中的表達陽性率運用獨立四格表χ2檢驗，均以雙側P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 GPX-3 mRNA的表達

腮腺良性多形性腺瘤、腮腺惡性多形性腺瘤中mRNA的相對表達量明顯低于瘤旁組織，且腮腺惡性多形性腺瘤中mRNA的相對表達量最低，組間差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01，表 2、圖 2、圖 3）。

表2GPX-3 mRNA在瘤旁腺體組織及腮腺良惡性多形性腺瘤中的表達結果（例）Table 2 Expression of GPX-3 mRNA in para-tumor glandular tissue and benign and malignant parotid pleomorphic adenoma（case）

圖2 熒光定量PCR分析GPX-3基因在瘤旁腺體組織及腮腺良惡性多形性腺瘤中的相對表達量Figure 2 Quantitative PCR analysis of GPX-3 gene in paraneoplastic glandular tissue，benign and malignant parotid pleomorphic adenoma

2.2 GPX-3蛋白在瘤旁組織與腮腺良惡性多形性腺瘤中的表達

腮腺多形性腺瘤瘤旁腺體組織、腮腺良性多形性腺瘤、腮腺惡性多形性腺瘤中蛋白的表達量分別為 0.94±0.01、0.35±0.02、0.11±0.01（表 3），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。GPX-3 蛋白在腮腺良、惡性多形性腺瘤中的表達明顯低于瘤旁組織（P＜0.01，表3、圖4、圖 5）。

圖3 腮腺良惡性多形性腺瘤中GPX-3基因相對瘤旁腺體組織的表達分布Figure 3 Expression distribution of GPX-3 gene in benign and malignant pleomorphic adenomas of the parotid gland relative to adjacent tumor tissue

表3 GPX-3蛋白在瘤旁腺體組織、腮腺良惡性多形性腺瘤中的表達結果（例）Table 3 Expression of GPX-3 protein in paraneoplastic glandular tissue,benign parotid pleomorphic adenoma,malignant parotid pleomorphic adenoma（case）

圖4 蛋白免疫印跡法分析GPX-3蛋白在瘤旁腺體組織及腮腺良惡性多形性腺瘤中的表達Figure4 Western blot analysis of GPX-3 protein expression in para-glandularglandulartissue,benignparotidpleomorphicadenoma,malignantparotidpleomorphicadenoma

2.3 GPX-3 mRNA和蛋白的表達與其臨床病理特征的關系

如表4、表5所示：GPX-3 mRNA和蛋白在腮腺多形性腺瘤中的表達，與患者的年齡、性別、腫瘤大小、組織學分級及分化程度無關（均P＞0.05），但與腮腺惡性多形性腺瘤的TNM分期、惡性成分比例有關（均P＜0.05）。

圖5 GPX-3蛋白在瘤旁腺體組織及腮腺良惡性多形性腺瘤中的表達分布Figure 5 GPX-3 protein expression and distribution in benign and malignant pleomorphic adenomas of the parotid glands and parotid glands

3 討論

腮腺多形性腺瘤的發(fā)生起源于腺管和肌上皮細胞，是名副其實的“混合瘤”，其病理學表現(xiàn)多樣，可見腫瘤性上皮組織和黏液樣或軟骨樣間質，根據(jù)其成分比例，可分為細胞豐富型和間質豐富型。一般認為，細胞豐富型相對較易惡變，間質豐富型相對較易復發(fā)。若處理不當，則易導致腫瘤復發(fā)[6]。如何減少術后復發(fā)是腮腺多形性腺瘤的一大挑戰(zhàn)。許多學者認為，術中腫瘤切除不完全易導致復發(fā)[7]，故腮腺多形性腺瘤的切除范圍一直是研究的熱點。程晗菲等[8]發(fā)現(xiàn)，基質金屬蛋白酶-9（matrix metalloprotein-9，MMP-9）及血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）在惡性腮腺多形性腺瘤中呈高表達，相比瘤旁1 cm組織，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），證實瘤旁1 cm是腮腺多形性腺瘤切除的安全界限。而劉志明等[9]研究發(fā)現(xiàn)，人第10號染色體缺失的磷酸酶（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome then，PTEN）在腮腺多形性腺瘤及瘤旁0.5～1.0 cm組織中表達均低于正常腺體組織（P＜0.05），而PTEN在瘤旁2 cm組織與正常腺體組織中表達差異無統(tǒng)計學意義 （P＞0.05），這為本實驗采取瘤旁2 cm組織為正常對照組提供了理論依據(jù)。本研究結果發(fā)現(xiàn)，GPX-3在腮腺多形性腺瘤與瘤旁組織中的表達有顯著差異 （P＜0.05），在基因和蛋白的表達量上支持臨床病理診斷。

表4 GPX-3 mRNA與腮腺多形性腺瘤臨床病理特征的關系（例）Table 4 Relationship between GPX-3 mRNA and clinicopathological features of parotid pleomorphic adenoma（case）

表5 GPX-3蛋白與腮腺多形性腺瘤臨床病理特征的關系（例）Table 5 Relationship between GPX-3 protein and clinicopathological features of parotid pleomorphic adenoma（case）

GPX家族有8個成員 （GPX1-GPX8），其主要功能是催化谷胱甘肽 （GSH）轉化為還原型谷胱甘肽（GSSG）[10-11]。GPX-3是目前已知唯一含有細胞外抗氧化異構體的硒半胱氨酸，它能消除機體內的過氧化氫和脂質過氧化物，阻斷活性氧自由基對機體的損害。GPX-3異常失活可能導致組織細胞中ROS的過度產生和積累，引起上皮細胞DNA損傷，最終導致腫瘤發(fā)生[12]。多種報道顯示GPX-3是一種有效抑制腫瘤發(fā)展的基因。有學者發(fā)現(xiàn)GPX-3在乳腺癌中的表達明顯低于相應的癌旁組織，GPX-3的表達與乳腺癌的惡性程度及預后有關[13]。Zhou等[14]發(fā)現(xiàn)GPX-3高甲基化導致GPX-3在胃癌中表達下調。而關于GPX-3在腮腺多形性腺瘤中的表達少有報道。本研究通過熒光定量PCR和蛋白印跡法，檢測了GPX-3mRNA及其蛋白在腮腺良、惡性多形性腺瘤及瘤旁組織中的表達，發(fā)現(xiàn)GPX-3 mRNA及蛋白的表達在腮腺良惡性多形性腺瘤中較瘤旁正常組織中明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義 （P＜0.05），提示GPX-3參與了腮腺多形性腺瘤的發(fā)生及惡變。本研究結果與GPX-3在其他腫瘤中的表達趨勢一致，包括肺癌[15]、甲狀腺癌[16]、結腸癌[17]、黑色素瘤[18]、食管腺癌[19]、胃癌[14]等。而在臨床病理特征上，GPX-3在腮腺多形性腺瘤中的表達與患者年齡、性別、腫瘤大小、組織學分級及分化程度無明顯關系，但與腮腺惡性多形性腺瘤的TNM分期、侵襲性、惡性成分比例有關，這與在乳腺癌中發(fā)現(xiàn)的結果基本一致。本研究結果提示，GPX-3的低表達與腮腺多形性腺瘤的發(fā)生、發(fā)展及惡變密切相關，為GPX-3作為一種輔助因子來預測腮腺多形性腺瘤是否惡變，并評估預后提供了理論基礎。但因腮腺惡性多形性腺瘤較為少見，故本研究惡性組樣本較少，可能使本研究中GPX-3與腮腺多形性腺瘤惡性程度的關系，與其他惡性腫瘤的相關研究結果略有差異。后期值得在更大樣本中，進一步研究GPX-3與腮腺多形性腺瘤復發(fā)及惡變的關系。

關于GPX-3的表達機制，有研究顯示DNA甲基化是導致基因表達沉默的常見機制之一[19]，國外研究發(fā)現(xiàn)GPX-3高甲基化可能導致GPX-3在腫瘤中呈現(xiàn)低表達[20]，且Zhou等[14]發(fā)現(xiàn)GPX-3高甲基化可能是老年胃癌患者術后復發(fā)的預后指標。本研究探討了GPX-3的表達與腮腺多形性腺瘤發(fā)生及惡變的相關性，但GPX-3高甲基化與其表達下降的關系仍需進一步研究。最新研究通過調節(jié)腫瘤細胞中的GPX-3水平來抑制腫瘤細胞的生長及更新，進一步為GPX-3對腫瘤的靶向治療提供了潛在可能[21]。本研究發(fā)現(xiàn)GPX-3在腮腺多形性腺瘤中的表達下降，且GPX-3的低表達與腮腺多形性腺瘤的發(fā)生及惡變密切相關，故GPX-3有望成為腮腺多形性腺瘤惡變及預后的生物學指標。目前GPX-3對腫瘤的作用機制尚不明確，在臨床的靶向治療上仍需進一步研究。隨著GPX-3作用機制研究的深入，它終將在腫瘤基因靶向治療上進一步被突破，為腮腺多形性腺瘤復發(fā)及惡變的治療提供新思路，從而減少反復手術對患者造成的創(chuàng)傷。