環(huán)境因子對鹵蟲生長、體脂肪酸及抗氧化能力的影響

馬 婷，韓朝婕，柴英輝，賈旭穎，高金偉，邵 蓬，竇 勇，周文禮

(天津農(nóng)學(xué)院 水產(chǎn)學(xué)院/天津市水產(chǎn)生態(tài)與養(yǎng)殖重點試驗室，天津 300384)

【研究意義】鹵蟲(Artemiaparthenogenetic)也稱鹽水豐年蟲，在分類上屬節(jié)肢動物門(Arthropoda)、甲殼亞門(Crustacea)、鰓足綱(Branchiopoda)、無甲目(Anostraca)、鹵蟲科(Artemiidae)、鹵蟲屬(Artemia)[1]。鹵蟲分布范圍極廣，在世界各大陸的鹽湖、鹽田等高鹽水域均有分布。鹵蟲是良好作為基礎(chǔ)研究材料，其已被廣泛應(yīng)用于生物的生長[2]、發(fā)育[3]、遺傳[4]、進化[5]等各個方面研究。同時又因其適口性強、營養(yǎng)價值高、可作為藥餌及微量元素的活載體、能夠提高養(yǎng)殖生物的存活率、抗病性等優(yōu)點，成為水產(chǎn)養(yǎng)殖生物廣泛使用的開口餌料[6]。鹵蟲體內(nèi)含有豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸、脂肪酸等營養(yǎng)成分，其體內(nèi)含有的脂肪酸尤其是不飽和脂肪酸對水產(chǎn)生物的生長發(fā)育、免疫防御、能量代謝等均有積極影響[7]。【擬解決的關(guān)鍵問題】雖然鹵蟲體內(nèi)不飽和脂肪酸含量高于飽和脂肪酸，但其整體水平較低，仍無法滿足多數(shù)海水魚、蝦苗種發(fā)育的需要，所以在大規(guī)模養(yǎng)殖生產(chǎn)上中一般使用魚油[8]、葡萄糖[9]進行鹵蟲脂肪酸強化，這不僅提高了養(yǎng)殖成本，而且限制了鹵蟲作為開口餌料在海水養(yǎng)殖育苗生產(chǎn)中的應(yīng)用。與其他強化物相比，生物餌料是一種可持續(xù)的資源，能夠在任何季節(jié)迅速繁殖、生長和收獲，且生長周期短、適于高密度培養(yǎng)[10]。生物餌料中的微藻[11]被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中的各個階段，能夠在不同程度上滿足水產(chǎn)養(yǎng)殖動物各個時期的營養(yǎng)需求。鹵蟲是典型的濾食性生物，在天然環(huán)境中主要以細菌、微藻和有機碎屑等為食，養(yǎng)殖生產(chǎn)中常用的生物餌料主要有球等鞭金藻、海水小球藻、酵母等，均作為餌料廣泛應(yīng)用于鹵蟲飼養(yǎng)及營養(yǎng)強化?！厩叭搜芯窟M展】研究發(fā)現(xiàn)鹵蟲的生長、繁殖狀況不僅與餌料種類和質(zhì)量有著密切的關(guān)系，而且受到外界理化因素的影響[12]，對于鹵蟲等甲殼類動物來說，其生長主要受溫度[13]、鹽度[14]、pH[15]、溶解氧[16]、光照[17]等環(huán)境因子的影響，環(huán)境因子還在一定程度上影響鹵蟲機體滲透壓[18]、耗氧率與排氨率[19]、繁殖[20]等生理功能。隋麗英等[21]研究了鹽度對不同品系鹵蟲的影響，發(fā)現(xiàn)鹽度為70～180的范圍內(nèi)，舊金山鹽田鹵蟲(SFB)、渤海灣孤雌生殖鹵蟲(BHB)和越南人工養(yǎng)殖兩性鹵蟲(VSFB)的存活率隨鹽度的升高而降低；宋雨晴[22]研究了海洋單胞藻對鹵蟲生長的影響，發(fā)現(xiàn)鹵蟲的體長受餌料脂肪含量的影響更明顯；彭瑞冰等[23]研究了不同餌料對鹵蟲總脂含量、脂肪酸組成的影響，發(fā)現(xiàn)以三角褐指藻或“三角褐指藻+酵母液”為餌料培養(yǎng)的鹵蟲總脂和不飽和脂肪酸成份較高，其營養(yǎng)價值最佳；孫學(xué)亮等[24]探究了鹽度對對蝦等甲殼類動物的抗氧化能力的影響，發(fā)現(xiàn)鹽度為15試驗組會顯著降低甲殼動物的抗氧化能力及非特異性免疫能力，相比之下，鹽度為25的試驗組甲殼動物更加健康?！颈狙芯壳腥朦c】目前針對鹵蟲最適養(yǎng)殖環(huán)境的研究多集中于單一的環(huán)境因素影響[25]，此外對鹵蟲的營養(yǎng)強化技術(shù)的研究也大多針對餌料種類這一單一因素[26-27]，而忽略了多因子之間的相互作用以及常見環(huán)境因子與生物因子對鹵蟲生理生化等指標的綜合影響?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本試驗將常見的理化因素(光照、鹽度、pH)與營養(yǎng)強化最重要的生物因素-餌料種類相結(jié)合，綜合4種環(huán)境因素進行正交試驗，探究環(huán)境因子對鹵蟲生長、體脂肪酸成分及體抗氧化指標的影響，旨在獲得最適合鹵蟲生長發(fā)育、脂肪酸積累以及提高免疫力的環(huán)境條件組合，為鹵蟲營養(yǎng)強化技術(shù)提供理論依據(jù)，以期為水產(chǎn)經(jīng)濟動物提供更優(yōu)質(zhì)餌料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 鹵蟲 試驗所用鹵蟲卵由天津海友佳音生物科技有限公司提供的渤海灣孤雌生殖鹵蟲(ArtemiaparthenogeneticBHW) ，放置于冰箱4 ℃密封待用。鹵蟲孵化方法參考[28]，使用人工調(diào)配的海水進行孵化，鹽度為25 ‰；孵化時持續(xù)充氣，保證鹵蟲卵均勻分布，孵化水溫25 ℃，光照強度為72 μmol/(m2· s)，取時齡< 24 h，體長為(0.5±0.05)mm的鹵蟲無節(jié)幼體待用。采用溫度計監(jiān)測水溫，鹽度計監(jiān)測水環(huán)境的鹽度，照度計檢測各試驗組的光照強度，并及時利用白熾燈補光。

1.1.2 餌料 球等鞭金藻、海水小球藻、食用酵母均由天津農(nóng)學(xué)院水生生物生態(tài)試驗室提供。藻液采用f/2培養(yǎng)基，將球等鞭金藻、海水小球藻置于溫度為26 ℃、光照為72 μmol/(m2.s)，光照周期為12∶12(L∶D)的光照培養(yǎng)箱中進行擴大培養(yǎng)。待藻細胞密度達到5×106cell/mL時離心備用。酵母為食用安琪干酵母，投喂前用海水稀釋，放置于4 ℃冰箱密封保存。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗設(shè)計 正交試驗設(shè)計方案見表1。利用SPSS19.0設(shè)計的四因素三水平正交試驗表共有九組(表2)。

表1 四因素三水平正交試驗設(shè)計方案

表2 四因素三水平正交試驗表

1.2.2 試驗方法 試驗用鹵蟲無節(jié)幼體分為9個試驗組，每個試驗組設(shè)置3個重復(fù)，試驗期間養(yǎng)殖水體溫度為(28±1)℃，溶解氧≥ 6.5 mg/L，餌料按不同種類同等密度投喂，每天07:00、13:00和19:00投喂3次，投喂密度為(1.0±0.2)×106cell/mL。每天監(jiān)控養(yǎng)殖條件，及時調(diào)節(jié)。試驗期間每天取樣測定其存活率、體長、體重、體脂肪酸及抗氧化指標。采用溫度計、鹽度計監(jiān)測水溫、水環(huán)境的鹽度，照度計檢測各試驗組的光照強度，并及時利用白熾燈補光。體長采用Olympus光學(xué)顯微鏡和臺微尺進行測定，濕重采用電子天平測量。

鹵蟲存活率=n/N×100%

其中,n：鹵蟲量，N：鹵蟲的全部個體數(shù)量。

鹵蟲體脂肪酸測定方法參考GB 5009.168-2016[29]。

抗氧化相關(guān)酶活和丙二醛(MDA)含量均采用南京建成試劑盒(南京建成生物工程研究所)進行測定。SOD活力單位(U)定義每毫克組織蛋白在1 mL反應(yīng)液中SOD抑制率達50 %時所對應(yīng)的SOD量為一個SOD活力單位。CAT活力單位為每毫克組織蛋白每秒鐘分解1 μmol的H2O2的量。POD活力單位為37 ℃條件下，每毫升組織每分鐘催化1 μg底物的酶量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均以“平均值±標準誤(Means±SE)”表示，用SigmaPlot 13.0軟件繪制圖形，利用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行主效應(yīng)檢驗，并用Duncan’s進行組間的多重比較，設(shè)P≤ 0.05為顯著性差異水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 環(huán)境因子對鹵蟲存活和生長的影響

如圖1所示，試驗期間，第4組鹵蟲存活率最高，為71.36 %，顯著高于除第五第九組以外的其他處理組(P<0.05)，其次為第1、3、5、8、9組，存活率在58.77 %～65.61 %，第2、6、7組存活率最低，僅為45.36 %～46.55 %，顯著低于其他處理組(P<0.05)。主效應(yīng)檢驗表明：4種因子對鹵蟲存活率影響的主次關(guān)系為：pH >鹽度>餌料種類>光照強度。

所有圖中字母不同表示差異顯著(P<0.05)，下同

如圖2所示，試驗初期各處理組體長無顯著差異，隨著試驗時間的延長，各組體長差異明顯。試驗結(jié)束(7 d)時，第9組鹵蟲的體長最大，為2.38 mm，顯著高于其他處理組(P<0.05)，其次為第1、3、4、5、8組，而第2、6、7組鹵蟲的體長最小，體長在1.665～1.735 mm，顯著低于其他處理組(P<0.05)。由主效應(yīng)檢驗可知，4種因子對鹵蟲體長影響的主次關(guān)系為：pH >光照強度>鹽度>餌料種類。

圖2 環(huán)境因子對鹵蟲體長的影響Fig.2 Effect of environmental factors on the body length of Artemia parthenogenetic

如圖3所示，試驗初期，各組體長無顯著差異，試驗中期(3～5 d)體重增長明顯，增重最快，各組體重差異明顯。試驗結(jié)束時(7 d)組的鹵蟲體重最大，為(0.201±0.013)mg，顯著高于其他試驗組(P<0.05)；其次為第5和9組，體重分別為(0.160±0.01)和(0.161±0.008)mg；第6、7組鹵蟲體重處于較低水平；第2組的鹵蟲體重最低，僅為(0.081±0.01)mg，顯著低于其他處理組(P<0.05)。環(huán)境因子對鹵蟲體重主效應(yīng)的檢驗關(guān)系依次為：pH >餌料種類>鹽度>光照強度。

圖3 環(huán)境因子對鹵蟲體重的影響Fig.3 Effects of environmental factors on Artemia parthenogenetic weight

2.2 環(huán)境因子對鹵蟲體內(nèi)脂肪酸組成及含量的影響

如圖4所示，第四組鹵蟲體脂肪酸總量、飽和脂肪酸、單不飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸含量均高于其他處理組，其次為第1、3、5、7、9組，而第2、6、8組4種脂肪酸相關(guān)指標均顯著低于其他處理組(P<0.05)。主效應(yīng)檢驗結(jié)果表明：4種環(huán)境因子對鹵蟲飽和脂肪酸、單不飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸影響的主次關(guān)系為pH>餌料種類>鹽度>光照，而對脂肪酸總量的影響關(guān)系為餌料種類>pH>鹽度>光照。

圖4 環(huán)境因子對鹵蟲體脂肪酸組成種類及含量的影響Fig.4 Effect of environmental factors on the types and contents of fatty acid composition of Artemia parthenogenetic

2.3 環(huán)境因子對鹵蟲抗氧化力的影響

如圖5所示，試驗期間第四組鹵蟲SOD、CAT和POD酶活性均高于其他試驗組(P<0.05)，其次是第8、5、3、6組，再次是9、2、1、7組等，而MDA含量第四組低于其他試驗組(P<0.05)，第8、3、6、9組較高。主效應(yīng)檢驗結(jié)果表明：鹵蟲POD和SOD酶活力主次關(guān)系為鹽度>光照> pH>餌料種類，鹵蟲CAT酶活力主次關(guān)系為pH>鹽度>餌料種類>光照，鹵蟲MDA含量的主次關(guān)系為餌料種類>光照>pH>鹽度。

圖5 環(huán)境因子對鹵蟲抗氧化力的影響Fig.5 Effects of environmental factors on the antioxidant capacity of Artemia parthenogenetic

3 討 論

3.1 環(huán)境因子對鹵蟲存活、生長的影響

鹵蟲是生活在高鹽水體中的一種小型甲殼動物[30]，鹽度是鹵蟲養(yǎng)殖環(huán)境中重要的因子之一。呂光俊[31]研究表明山東鹽場鹵蟲在鹽度為50下生長最快，在鹽度為5時孵化率最高，鹵蟲在低鹽度孵化率較高高鹽度生長最快。R Blust等[32]研究了pH在5.5～8.5鹵蟲的生長情況，發(fā)現(xiàn)pH較低條件下鹵蟲存活率較低，生長緩慢；在pH為8時鹵蟲適應(yīng)能力最強，表明pH過低會抑制鹵蟲的生長發(fā)育。田樹林等[33]對山西運城鹵蟲休眠卵孵化特性進行了研究，發(fā)現(xiàn)光照對鹵蟲休眠卵的孵化有顯著影響，與黑暗條件相比，光照條件下鹵蟲孵化率提高10 %以上，生長速度明顯提高，表明光照可以促進其孵化和生長。張登瀝等[34]研究了鹽藻、麩皮、酵母對鹵蟲生長和生殖的影響，發(fā)現(xiàn)不同餌料對鹵蟲的存活和生長速度均有顯著影響，其中(P<0.05)麩皮組生長最好，而酵母組最差；達到性成熟時鹽藻組存活率最高，酵母組存活率則最低對，說明鹵蟲的存活與生長狀況與其餌料種類有著密切的關(guān)系。本研究發(fā)現(xiàn)對鹵蟲存活、體長和體重起主要影響作用的環(huán)境因素均是pH，實驗結(jié)束時第3、4、8、9組鹵蟲的存活率最高，此時pH范圍在8～9，第2、6、7組鹵蟲的存活率最低，體長最小，3組的pH條件均為7，表明pH8～9有利于鹵蟲的存活，而pH 7的水體在一定程度上限制了鹵蟲生長。本實驗中第4組的存活率和體重均高于其他處理組，而體長則高于除第九組外的其他處理組，說明其存活和生長的最佳條件為第四組，其環(huán)境因素組合是光照強度為72 μmol/(m2·s)、鹽度為25、pH為8.0、餌料種類為球等鞭金藻。

3.2 環(huán)境因子對鹵蟲體脂肪酸組成及含量的影響

目前理化因子對鹵蟲體脂肪酸影響的研究較少，研究著重在餌料對鹵蟲體脂肪酸影響的方向。有研究指出鹽度升高，除C22:0顯著高于其它組別外，鹽度變化對鹵蟲脂肪酸含量均無顯著影響(P>0.05)[35]，其他因子對鹵蟲脂肪酸的影響尚未明確。餌料為水產(chǎn)生物提供主要代謝能量來源，對水生生物的發(fā)育、生長與繁殖有重要意義影響[36]。而餌料對鹵蟲生長、生殖的影響大部分的研究測重于啤酒酵母、混合單胞藻、螺旋藻粉、農(nóng)副產(chǎn)品(如米糠、麩皮、豆粕等)、植物漿等對鹵蟲的餌料效果，發(fā)現(xiàn)在鹵蟲生長前期，農(nóng)副產(chǎn)品飼養(yǎng)鹵蟲的生長速度高于其他種類飼料，在鹵蟲生長的中后期混合單胞藻和螺旋藻粉對鹵蟲的生長和存活較高與其他餌料，而酵母對鹵蟲的影響最差[37]。并且鹵蟲的趨光性，致使在不同光照強度的作用下鹵蟲的游泳行為不同，從而導(dǎo)致各試驗組的鹵蟲體代謝和耗能情況出現(xiàn)較大差異[38]。Watanabe等[39]研究發(fā)現(xiàn)生物餌料飼養(yǎng)的鹵蟲體內(nèi)脂肪酸組成成份的種類與數(shù)量都顯著優(yōu)于普通餌料飼養(yǎng)的鹵蟲。本研究結(jié)果表明pH和餌料種類是影響鹵蟲脂肪酸種類和含量的兩個主要環(huán)境因子，說明適宜的理化條件(尤其是pH)對鹵蟲體脂肪酸的積累有著明顯的促進作用，可能是由于在適宜的理化條件中，鹵蟲才得以正?；顒?，能量消耗與轉(zhuǎn)換才能維持穩(wěn)態(tài)，保持機體營養(yǎng)均衡；當(dāng)環(huán)境中的理化條件不適時，機體用于適應(yīng)環(huán)境的能量消耗過大，機體的能量轉(zhuǎn)換下降，從而導(dǎo)致營養(yǎng)儲存較低，營養(yǎng)缺失。本實驗中第四組的脂肪酸總量和不飽和脂肪酸含量均顯著高于其他處理組，說明鹵蟲脂肪酸積累最佳條件為第4組。

3.3 不同環(huán)境組合對鹵蟲抗氧化力的影響

抗氧化系統(tǒng)是機體清除體內(nèi)多余的活性氧、保護自身免受氧化損傷的重要體系，是相互關(guān)聯(lián)的。超氧化物歧化酶(SOD)對機體的氧化與抗氧化平衡起著至關(guān)重要的作用，SOD酶能清除超氧陰離子自由基，保護機體細胞免受侵害[40]；過氧化氫酶(CAT)分解活躍的氫氧自由基(OH·)，保護機體細胞穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境及細胞的正常生活；過氧化物(POD)與生物的呼吸作用、光合作用及生長素的氧化都有著密切的關(guān)系，在整個生物的生長發(fā)育過程中POD的活性不斷發(fā)生改變[41]；MDA則是氧自由基攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸引發(fā)脂質(zhì)過氧化作用所產(chǎn)生的脂質(zhì)過氧化物，且MDA能使機體組織細胞受損傷[42]。本研究結(jié)果表明4種環(huán)境因子對鹵蟲四種抗氧化指標的影響主次關(guān)系略有差異，理化因子對鹵蟲抗氧化相關(guān)酶活具主要影響，其中鹽度對鹵蟲的POD、SOD酶活力影響較大，說明適宜鹽度條件下鹵蟲機體可以促進過氧化物的生成和增加超氧陰離子，保護機體細胞，促進鹵蟲的生長；而CAT受pH影響較大，主要是由于水體pH影響機體內(nèi)氫氧自由基的產(chǎn)生，pH較低時氫氧自由基數(shù)量降低，細胞內(nèi)環(huán)境不平衡；pH較大時，促進細胞內(nèi)環(huán)境內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。而生物因子-餌料種類對MDA含量具有主要影響，說明機體內(nèi)脂質(zhì)過氧化物的形成與消除不僅與酶活性水平相關(guān)，同時也與適宜的餌料種類和自身營養(yǎng)狀態(tài)有關(guān)。其中第1、4組的鹵蟲MDA含量較低，這兩組的鹵蟲機體細胞損傷較低，且這兩組的餌料均為球等鞭金藻，說明投喂球等鞭金藻阻礙機體細胞的損傷，減少機體內(nèi)MDA含量的累積；主效應(yīng)檢驗得出；本試驗結(jié)果中第4組的SOD、CAT和POD酶活力均高于其他各試驗組，說明第4組飼養(yǎng)的鹵蟲體內(nèi)氧化損傷程度顯著低于其他各試驗組，能夠有效的修復(fù)受損細胞，加強代謝機體產(chǎn)生的有害成分，加強自身的防御作用，降低自身傷害；同時第4組的MDA含量最低，說明鹵蟲體內(nèi)對組織的保護能力最強，細胞膜抵抗脅迫遭破壞的能力提高[43]，說明第4組養(yǎng)殖條件下鹵蟲的抗氧化能力優(yōu)于其他養(yǎng)殖條件。

4 結(jié) 論

綜上所述，環(huán)境中的理化因子尤其是pH和鹽度對鹵蟲存活、生長和抗氧化性能的影響效果最大，而生物因子——餌料種類則對鹵蟲體脂肪酸積累起主要影響作用。綜合鹵蟲生長、體脂肪酸和抗氧化性能指標，其最佳飼養(yǎng)條件為光照72 μmol/(m2·s)、鹽度25、pH 8、餌料種類為球等鞭金藻。